CRISPR Génération / cas9 Mediated monoallélique Suppressions pour étudier la fonction Enhancer dans souris cellules souches embryonnaires

Sakthi D. Moorthy; Jennifer A. Mitchell

doi:10.3791/53552

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Article de méthode

CRISPR Génération / cas9 Mediated monoallélique Suppressions pour étudier la fonction Enhancer dans souris cellules souches embryonnaires

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DOI :

10.3791/53552

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2 avril 2016

Sakthi D. Moorthy¹ , Jennifer A. Mitchell¹

¹Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

Dans cet article

Résumé

La meilleure approche de la validation expérimentale de l’activité de l’amplificateur est l’analyse de perte de fonction. Voici un protocole efficace qui utilise la délétion médiée par CRISPR/Cas9 pour étudier la régulation de la transcription des gènes spécifique de l’allèle dans les cellules ES F1 qui contiennent un génome hybride (Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus).

Résumé

Les amplificateurs contrôlent l’identité cellulaire en régulant l’expression génique spécifique au tissu d’une manière indépendante de la position et de l’orientation. Ces amplificateurs sont souvent situés distalement du gène régulé dans les régions intergéniques ou même dans le corps d’un autre gène. La nature indépendante de la position de l’activité des amplificateurs rend difficile l’appariement des amplificateurs avec les gènes qu’ils régulent. La délétion d’une région d’amplification fournit une preuve directe de l’activité d’un amplificateur et constitue l’étalon-or pour révéler le rôle d’un amplificateur dans la transcription d’un gène endogène. Les méthodes conventionnelles de délétion basées sur la recombinaison homologue ont été dépassées par les progrès récents de la technologie d’édition du génome qui permettent des modifications rapides et précisément localisées des génomes de nombreux organismes modèles. L’édition du génome médiée par CRISPR/Cas9 peut être utilisée pour manipuler le génome de nombreux types de cellules et d’organismes rapidement et à moindre coût, en raison de la facilité avec laquelle Cas9 peut être ciblé sur le génome par un ARN guide à partir d’un plasmide d’expression sur mesure. La délétion homozygote d’éléments régulateurs géniques essentiels peut conduire à la létalité ou à l’altération du phénotype cellulaire, tandis que la délétion monoallélique des amplificateurs transcriptionnels permet d’étudier la régulation cis de l’expression génique sans ce problème de confusion. Voici un protocole pour la délétion médiée par CRISPR/Cas9 dans les cellules souches embryonnaires (ES) de souris F1 (Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus). La délétion, le criblage et l’analyse de l’expression monoallélique sont facilités par les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) entre les deux allèles qui se produisent en moyenne tous les 125 pb dans ces cellules.

Introduction

Des éléments de régulation transcriptionnelle sont critiques pour réglage fin spatio-temporelle de l' expression des gènes au cours du développement ¹ et la modification de ces éléments peut entraîner une maladie due à l' expression génique aberrante ^2. De nombreuses régions associées à des maladies identifiées par le génome des études d'association sont larges dans les régions non codantes et présentent des caractéristiques d'amplificateurs de transcription ^3-4. L' identification des amplificateurs et les harmoniser avec les gènes qu'ils régulent est compliqué car ils sont souvent situés à plusieurs kilobases ....