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Article de méthode

Une stratégie novatrice alliant CGH-Array, séquençage de l’exome-ensemble et électroporation de In Utero chez les rongeurs afin d’identifier les gènes pour les Malformations du cerveau

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DOI :

10.3791/53570

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1 décembre 2017

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1University of Florence, 2INSERM INMED, 3Aix-Marseille University, 4Plateforme Biologie Moléculaire et Cellulaire INMED, 5Royal Children's Hospital, 6Murdoch Children's Research Institute, 7University of Melbourne, 8Plateforme postgenomique INMED, 9University of Pavia, 10Wellcome Trust Centre for Human Genetics, 11Oxford Radcliffe NHS Trust, 12IRCCS Casimiro Mondino Foundation, 13Research Institute of Molecular Pathology, 14IRCCS Stella Maris, 15Columbia University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Hétérotopie nodulaire périventriculaire (PNH) est la forme la plus courante de malformations du développement cortical (MCD) à l’âge adulte, mais sa base génétique reste inconnue dans des cas plus sporadiques. Nous avons récemment mis au point une stratégie pour identifier les gènes candidats nouveaux pour MCD et de confirmer directement leur rôle causal in vivo.

Résumé

Malformations congénitales qui impliquent le cortex cérébral — aussi connu sous le nom des malformations du développement cortical (MCD) — sont des causes importantes de la déficience intellectuelle et représentent 20 à 40 % des épilepsies pharmacorésistantes dans l’enfance. L’imagerie cérébrale à haute résolution a facilité en vivo l’identification d’un grand groupe de phénotypes MCD. Malgré les progrès de l’imagerie cérébrale, de l’analyse génomique et de génération de modèles animaux, un workflow simple d’accorder systématiquement la priorité gènes candidats et pour tester les effets fonctionnels de mutations putatives est manquant. Pour contourner ce problème, une stratégie expérimentale permettant d’identifier de nouveaux gènes pour MCD a été développée et validée. Cette stratégie repose sur l’identification des régions génomiques candidat ou gènes via CGH-array ou ensemble-l’exome séquençage et de caractériser les effets de leur inactivation ou de la surexpression de mutations spécifiques dans le développement de cerveau rongeurs via in utero électroporation. Cette approche a conduit à l’identification du gène C6orf70 , codant pour une protéine vésiculaire, à la pathogenèse de la leucomalacie hétérotopie nodulaire, un MCD causé par la migration neuronale défectueuse.

Introduction

Le cortex cérébral joue un rôle clé dans les processus cognitifs et intellectuels et est impliqué dans la mémoire comme apprentissage et contrôle des émotions. Il n’est donc pas étonnant que beaucoup de maladies neurologiques et psychiatriques résulte des malformations du développement cortical (MCD). L’étiologie de la MCD est complexe puisque tous deux acquis et les facteurs génétiques sont impliqués. La prévalence cumulée de proportion déterminée génétiquement de MCD est d’environ 2 %, et ils sont sporadiques dans la plupart des cas. Par exemple, l’incidence de la dysgénésie cérébrale congénitale a été estimée à plus de 1 % dans la population humaine, et certaines formes de MCD sont observées dans plus de 14 % des patients souffrant d’épilepsie et dans 40 % des épileptiques graves ou réfractaires1, 2.

Hétérotopie nodulaire périventriculaire (PNH) est l’un de la plus commune MCDs et est causée par une migration anormale des neurones de la zone ventriculaire (VZ) pour le cortex cérébral en voie de développement. L’échec des neurones pour migrer les résultats en amas de neurones hétérotopiques le long des parois des ventricules latéraux qui peuvent habituellement être visualisées à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique (IRM). Les caractéristiques cliniques, anatomiques et d’imagerie de la PNH sont hétérogènes. Nodules peuvent varier de petites et unilatérale à bilatérale et symétrique. Des séquelles cliniques communs concernent l’épilepsie et intellectuel handicap3. Des mutations du gène Filamine A (ou FLNA), qui correspond en Xq28, trouvées chez 100 % des familles avec l’HPN bilatérale liée à le X et dans 26 % des patients sporadique3,4. Une forme récessive rare de PNH causée par des mutations dans le gène ARFGEF2 , qui correspond à 20q13, a été signalée dans deux familles consanguines5. Récemment, des mutations bialléliques gènes codant pour la paire de cadhérine récepteur-ligand DCHS1 et saturées4 ont été identifiées chez neuf patients touchés par une maladie multisystémique qui comprend6de la PNH. PNH a également été associé fragile X syndrome7, Williams syndrome8, de syndrome microdélétion 22 q 119, duplications à 5 p 1510, destructions à 1P 3611, 5q14.3-q1512, 6 p 2513 et 6 q délétion terminale syndrome14,15,16,17,18,19, ce qui suggère que les gènes supplémentaires sont dispersés dans l’ensemble du génome. Cependant, environ 74 % de patients PNH sporadiques le fondement génétique reste à être élucidé17.

Les approches de cartographie génétique classique tels qu’array hybridation génomique Comparative (CGH-array) se sont avérés pour être des outils puissants pour la détection des anomalies chromosomiques submicroscopique, cependant, les régions génomiques identifiées à l’aide de cette approche sont souvent de grande taille et contiennent de nombreux gènes.

L’avènement des techniques de séquençage parallèle massive (c.-à-d. séquençage de l’Exome-ensemble (WES) et Whole-Genome séquençage (WGS)) a considérablement réduit le coût et le temps requis pour séquencer un ensemble humain exome ou du génome. Interprétation des données de l’EMTE et gt reste néanmoins difficile dans la plupart des cas, depuis, pour les variantes de chaque patient des dizaines à des centaines (ou même des milliers, en fonction du type d’analyse) émergent du filtrage des données.

Pour accélérer le processus d’identification de nouveaux gènes MCD, une stratégie systématique novatrice alliant CGH-array, WES et in utero électroporation (IUE) de dépistage des gènes candidats a été conçu. IUE permet de désactiver sélectivement (ou surexpriment) des gènes spécifiques ou des mutations dans les cerveaux de rongeurs, ce qui permet une évaluation rapide de leur implication dans l’exocytosis18,19. Arni médié-knockdown ou la surexpression d’un ou plusieurs gènes candidats devrait entraîner, quand le gène est associé de développement de la maladie, de défauts localisés de la migration neuronale et/ou de maturation. Lors de l’identification d’un gène dont l’inactivation (ou surexpression) reproduit le phénotype observé chez les patients chez les rongeurs, il devient un candidat exceptionnel pour le dépistage chez les patients sporadiques avec MCD. En utilisant cette approche, nous avons récemment révélé la contribution essentielle du gène C6orf70 (également connu sous le nom ERMARD) dans la pathogenèse de la PNH chez les patients abritant de destructions chromosomiques en 6 q 2716.

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Protocole

Énoncé d’éthique : Des rats Wistar ont été accouplés, entretenus et utilisés dans les animaleries Invest in Med, en accord avec la législation de l’Union européenne et les Français.

1. ADN Extraction et Quantification de CGH-Array et WES

  1. Extraire l’ADN génomique (ADNg) de leucocytes du sang humain provenant de patients à l’aide d’un robot automatisé d’isolement ADN ou trousses manuels disponibles dans le commerce d’extraction d’ADN selon le protocole du fabricant. Quantifier tous les échantillons à l’aide d’un spectrophotomètre.

2. tableau-CGH protocole

  1. Digestion de restriction de l’ADNg
    1. Double digest 500 ng de génomique purifié provenant d’un patient et un contrôle disponible dans le commerce humain ADN avec RsaI et AluI pendant 2 h à 37 ° C. Utiliser 0,5 μl de 10 enzymes U/μl de chaque réaction. Incuber pendant 20 min à 65 ° C pour inactiver les enzymes et déplacer les tubes à échantillon à la glace.
  2. Étiquetage des échantillons
    1. Ajouter le volume approprié des amorces aléatoires requis pour le format « microarray » en usage dans chaque tube de réaction (par exemple 5 µl de microarrays 1-pack, pack de 2 et 4-pack). Mélangez bien en pipettant également monter et descendre doucement.
    2. Transférer les tubes échantillon dans un thermocycleur. Incuber à 95 ° C pendant 3 min, puis à 4 ° C pendant 5 min.
    3. Préparer un cyanine cyanine 3 et un 5 étiquetage Master Mix sur la glace en mélangeant les volumes suivants : 10,0 µl 5 X tampon de réaction, 5,0 µl 10 x dNTPs, 3,0 µl Cyanine 3-dUTP ou Cyanine 5-dUTP et 1,0 µl Exo (-) enzyme Klenow, 2,0 µl eau exempte de nucléase. Choisissez le volume de chaque réactif selon le format « microarray » en cours d’utilisation.
    4. Ajouter le mélange réactionnel étiquetage dans chaque tube de réaction contenant l’ADNg. Bien mélanger en doucement pipetage de haut en bas.
    5. Transférer les tubes échantillon dans un thermocycleur et incuber à 37 ° C pendant 2 h, 65 ° C pendant 10 min et ensuite maintenir les échantillons à 4 ° C.
  3. Purification de l’ADNg étiqueté
    1. Ajouter 430 µl de TE 1 x (pH 8,0) dans chaque tube à essais.
    2. Placer une colonne de purification dans les tubes de prélèvement de 2 mL et étiqueter les colonnes correctement. Charge de chaque étiquette ADNg sur une colonne de purification.
    3. Centrifuger pendant 10 min à 14 000 x g dans une micro-centrifugeuse à température ambiante. Jeter le cheminement et replacez la colonne dans le tube de prélèvement de 2 ml.
    4. Ajouter 480 µL de TE 1 x (pH 8,0) dans chaque colonne. Centrifuger pendant 10 min à 14 000 x g dans une micro-centrifugeuse à température ambiante. Jeter le cheminement.
    5. Inverser la colonne dans un tube de prélèvement de frais 2 mL et centrifuger pendant 1 min à 1 000 x g dans une micro-centrifugeuse à température ambiante pour recueillir des échantillons purifiés.
    6. Porter le volume de l’échantillon de celles exigées pour le format « microarray » utilisé à l’aide d’un concentrateur ou en ajoutant 1 x TE (pH 8,0). Par exemple, pour 1-pack microarray porter le volume à 80,5 µL. Incuber l’échantillon sur la glace pendant 5 min et ensuite déposer la solution monter et descendre de 10 fois.
  4. Préparation d’ADNg marqué pour l’hybridation
    1. Combiner des échantillons d’essai et de référence à l’aide de la cyanine appropriée marqués 5 échantillon et cyanine 3 marqués dans un tube frais 1,5 mL RNase-libre. Par exemple, pour 1-pack microarray veiller à ce que le volume final est 158 µL. choisir le volume de l’échantillon selon le format « microarray » en cours d’utilisation.
    2. Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer le rendement, degré d’activité étiquetage ou spécifique en mesurant l’absorbance à A260 nm (ADN), A550 nm (cyanine 3) et A650 nm (cyanine 5).
      1. Calculer le rendement moyen de la formule : [ADN concentration(ng/µl) x volume (µl) de l’échantillon] / 1 000 (ng/µg). Calculer l’activité spécifique à l’aide de la formule : pmol par µl de colorant/µg / µl d’ADNg.
        NOTE : par exemple, pour 0,5 µg d’ADN d’entrée, le rendement doit être 8 à 11 µg et l’activité spécifique (pmol/µg) devrait être de 25 à 40 pour la Cyanine-3 portant l’étiquette échantillon et 20 à 35 pour l’échantillon étiqueté Cyanine-5.
    3. Pour préparer la quantité d’hybridation Master Mix requis pour le format « microarray » en cours d’utilisation, mélanger les réactifs suivants : 50 µL Cot-1 ADN (1,0 mg/ml), 52 µL 10 x aCGH Agent de blocage et µl 260 2 x tampon d’hybridation HI-tr/min.
    4. Ajouter le volume approprié de l’hybridation Master Mix dans le tube de 1,5 ml exempte de RNase qui contient l’ADNg marqué pour obtenir le volume total requis pour le format « microarray » en cours d’utilisation. Par exemple, pour 1 paquet microarray, assurez-vous que le volume final de chaque réaction 362 µl.
    5. Mélanger l’échantillon de pipetage de haut en bas, puis rapidement centrifuger à 14 000 x g et incuber pendant 3 min à 95 ° C et à 37 ° C pendant 30 min.
  5. Assemblée des chambres et l’hybridation
    1. Charger une lame propre joint dans la base de la chambre avec l’étiquette de joint vers le haut et alignée sur la section rectangulaire de la base de la chambre. Veiller à ce que la diapositive joint soit alignée avec la base de chambre et qu’il n’est pas entrouverte.
    2. Diluer le mélange témoin hybridation sur le puits de joint, en s’assurant que l’échantillon est répartie uniformément.
    3. Posez une diapositive « microarray » sur la diapositive de joint évaluer que la paire "sandwich" est correctement alignée. Ensuite, assembler la chambre de réaction, mettre le couvercle sur les diapositives de sandwich et de main-serrer la pince.
    4. S’assurer que les diapositives mouiller en tournant la chambre Assemblée verticalement. Assurez-vous que les bulles ne sont pas présents dans la salle. Si nécessaire, tapez sur l’Assemblée sur une surface dure pour déplacer les bulles stationnaires.
    5. Mettre les chambres à glissière assemblés dans un rack de rotator mis en place pour faire tourner à 20 tr/min. Mettre la chambre de l’hybridation dans une étuve et effectuer l’hybridation à 65 ° C pendant 24 ou 40 h selon le format « microarray » en cours d’utilisation.
  6. Microarray lavage et balayage
    1. Chambre d’hybridation sortir de four et il submerge dans le tampon de lavage 1. Procéder à son démontage.
    2. Retirer la glissière de microarray et mettre rapidement en une grille coulissante dans le tampon de lavage 1 à température ambiante.
    3. Laver la lame de tableau pendant 5 min avec agitation (l’aide d’une puce et un agitateur magnétique). Ajuster la vitesse d’agitation dans un cadre de 4 (vitesse moyenne), pour obtenir le bon, mais un mélange pas trop vigoureuse.
    4. Laver la lame de tableau dans le tampon de lavage 2 pour brasser de s 90. Récupérer doucement la lame de la mémoire tampon (il doit sortir sec) et la placer dans un support de diapositives à l’aide d’un protecteur de lame.
    5. Charger la diapositive dans le scanner de tableau et effectuer l’analyse conformément aux instructions du fabricant de la gamme.
    6. Analyser les résultats en utilisant le logiciel d’Extraction fourni avec le scanner utilisé conformément aux instructions du fabricant (V.9.1.3.1).

3. WES protocole

  1. Enrichissement de la cible
    1. Le dsDNA BR dosage permet de déterminer la concentration de l’échantillon ADNg selon le protocole de l’instrument.
    2. Diluer 5 µg de haute qualité double brin ADN avec 1 x tampon faible TE dans un tube de liaison faible de 1,5 mL dans un volume total de 50 µL.
    3. Mettre en place un sonicateur et mettre un microtube dans la station de chargement et de déchargement selon les instructions du fabricant. Garder le bouchon sur le tube.
    4. Lentement, transférer l’échantillon d’ADN de 50 µl à travers le septum avant fractionnement sans introduire des bulles.
    5. L’ADN selon les paramètres suggérés du fabricant de la sonicateur de cisaillement et d’évaluer la qualité à l’aide d’un Bioanalyzer selon les instructions du fabricant. La cible de la taille de fragment d’ADN est de 150 à 200 bp.
  2. Réparation de l’ADN se termine
    1. Préparer le mélange de réaction de réparation fin en mélangeant 40 µL de fin mélange de réparation enzymatique avec 10 µL de fin réparation Oligo Mix. Mélangez bien sur un vortex.
    2. Incuber les échantillons à 20 ° C pendant 30 min dans un thermocycleur et puis tenez-les à 4 ° C. Ne pas utiliser un couvercle chauffé.
    3. Ajouter 50 µL du mélange réaction réparation fin préparé à l’étape 3.2.1 à chaque 50 µL cisaillé échantillon d’ADN bien. Mélangez bien en pipettant également de haut en bas ou par agitation douce.
    4. Purifier l’échantillon avec un kit de purification de perles basés selon le protocole du fabricant.
  3. Polyadénylation des extrémités 3'.
    1. Ajouter 20 µl du mélange réactionnel dA-Tailing à chaque échantillon d’ADN purifié, réparé à la fin (environ 20 µL).
    2. Mélangez bien en pipettant également de haut en bas ou par agitation douce.
    3. Incuber les échantillons à 37 ° C dans un thermocycleur et puis maintenez-le à 4 ° C. Ne pas utiliser un couvercle chauffé.
  4. Ligature de l’adaptateur de pré-saisie d’indexation.
    1. Ajouter 5 µL de ligature Master Mix pour chaque échantillon d’ADN A queue.
    2. Ajouter 5 µL de la solution d’Index pré-saisie appropriée à chaque échantillon.
    3. Sceller les puits et homogénéiser au vortex pour 5 s. brièvement centrifuger les échantillons.
    4. Incuber les échantillons à 20 ° C pendant 15 min dans un thermocycleur et puis maintenez à 4 ° C. Ne pas utiliser un couvercle chauffé.
    5. Purifier les échantillons avec un kit de purification de perles basés selon le protocole du fabricant.
  5. Amplification de la bibliothèque indexée.
    1. Préparer le volume approprié de mélange de réaction PCR pré-saisie en mélangeant 1 µL du mélange de Primer et 25 µL du mélange réactionnel PCR. Mélangez bien sur un vortex.
    2. Combiner les 26 µL du mélange dans le puits distincts d’une PCR amplification et 24 µL de chaque échantillon de bibliothèque ADNg indexée.
    3. Exécuter un programme PCR avec les étapes suivantes : 98 ° C pendant 2 min, 5 cycles à 98 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 1 min et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min. maintenir les échantillons à 4 ° C.
    4. Purifier l’échantillon avec un kit de purification de perles basés selon le protocole du fabricant.
    5. Évaluer la qualité avec un Bioanalyzer selon le protocole du fabricant.
  6. Mise en commun des échantillons d’ADN indexés pour l’hybridation
    1. Pour chaque pool de réaction de capture, combiner le volume approprié de chaque échantillon de bibliothèque ADNg indexée dans un puits d’une plaque PCR. Par exemple, pour l’homme ou souris All-Exon capturer bibliothèques, combiner 8 bibliothèques par pool à l’aide de 187,5 ng de chaque bibliothèque indexée. S’assurer que chaque pool de réaction de capture finale contienne 1 500 ng d’ADNg indexée.
    2. Réduire le volume de chaque bien de < 7 µL à l’aide d’une pompe à vide. Évitez complètement sécher l’échantillon.
    3. Ajouter suffisamment d’eau exempte de nucléase à chaque piscine ADNg concentré pour faire le volume final bien 7 µL et vortex puis la plaque contenant ADNg vigoureusement pendant 30 s. centrifugeuse dans une essoreuse centrifugeuse ou mini-plaque pour recueillir le liquide au fond des puits.
  7. Hybridation ADNg piscines de bibliothèque à la bibliothèque de Capture
    1. Pour chaque pool d’ADNg 7 µL indexé, ajouter 9 µl du mélange de blocage. Pipetter en haut et en bas pour mélanger.
    2. Cap des puits, transférer la plaque scellée contenant ADNg pour le thermocycleur et incuber à 95 ° C pendant 5 min, puis maintenez-le à 65 ° C. Assurez-vous que la plaque est maintenue à 65 ° C pendant au moins 5 min.
    3. Préparer la dilution appropriée de l’édifice de la RNase, sur la base de la taille de la bibliothèque de capture (dilution à 10 % pour < 3,0 Mo et 25 % dilution pour les bibliothèques > les bibliothèques 3,0 Mo).
    4. Selon la taille de Capture de bibliothèque, combiner la quantité appropriée de la bibliothèque de Capture et diluer la solution bloc RNase dans une plaque PCR gardée sur glace. Mélangez bien en pipettant également. Pour les bibliothèques de capture < 3,0 Mo, utilisation 2 µl de bibliothèque et 5 µL de RNase bloc à dilution à 10 %. Pour les bibliothèques de capture > 3,0 Mo, l’utilisation de 5 µl de bibliothèque et 2 µl de RNase bloc à dilution de 25 %.
    5. Ajouter 37 µL de tampon d’hybridation dans chaque cupule contenant 7 µL du mélange de Capture Library/RNase bloc. Bien mélanger en pipetage et centrifuger brièvement la plaque contenant le mélange.
    6. Maintenir la plaque de piscine ADNg à 65 ° C tout en utilisant une pipette multi-canaux pour transférer l’ensemble µL 44 du mélange de la bibliothèque de Capture de l’étape 3.7.5 à chaque échantillon puits de la plaque de piscine ADNg. Bien mélanger en pipettant également lentement monter et descendre de 8 à 10 fois.
    7. Sceller les puits avec les couvercles de barrette bombé. Assurez-vous que tous les puits sont complètement étanches. Placer un tapis de compression sur la plaque de la PCR dans le thermocycleur.
    8. Incuber le mélange d’hybridation pour 24h à 65 ° C. Remarque : Les échantillons peuvent être hybridées jusqu'à 72 h, mais doivent vérifier que l’hybridation étendue ne provoque pas d’évaporation vaste dans les puits d’échantillon.
  8. Préparation des billes magnétiques-streptavidine
    1. Préchauffer le tampon de lavage 2 à 65 ° C dans un bloc de baignoire ou de la chaleur de l’eau.
    2. Resuspendre vigoureusement les billes magnétiques de streptavidine sur un vortex. Les billes magnétiques s’installer pendant le stockage.
    3. Pour chaque échantillon d’hybridation, ajouter 50 µL des suspension perles aux puits d’une plaque PCR.
    4. Laver les perles et les remettre en suspension dans 200 µL de tampon de liaison.
  9. Capture de l’ADN hybride billes de streptavidine.
    1. Évaluer et noter le volume de solution d’hybridation qui reste après le 24 h d’incubation.
    2. Maintenir la plaque de l’hybridation à 65 ° C et utiliser une pipette multicanaux pour transférer la totalité du volume (environ 60 µL) de chaque mélange d’hybridation dans les puits de la plaque contenant 200 µL de streptavidine lavé perles. Bien mélanger en pipettant également lentement monter et descendre de 3 à 5 fois.
    3. Boucher les puits et incuber la plaque de capture sur une table de mixage Nutator ou équivalent pendant 30 min à température ambiante. Veillez à ce que les échantillons sont correctement mélange dans les puits.
    4. Brièvement, centrifuger la plaque de capture dans une essoreuse centrifugeuse ou mini-plaque.
    5. Mettre la plaque de capture dans un séparateur magnétique de collecter les perles de la suspension. Retirer et jeter le surnageant.
    6. Remettre en suspension les perles dans 200 µL de tampon de lavage 1. La composition de pipetage de haut en bas jusqu'à ce que les perles sont entièrement remises en suspension.
    7. Centrifuger brièvement dans une essoreuse centrifugeuse ou mini-plaque.
    8. Mettre la plaque dans le séparateur magnétique.
    9. Attendez que la solution effacer, puis retirer et jeter le surnageant.
  10. Capturer après traitement pour multiplexé séquençage des échantillons
    1. Préparer le volume approprié de mélange réactionnel PCR en mélangeant ce qui suit : l’eau sans nucléase 9 µL, 25 µL Master Mix et 1 µL Amorce mélanger selon le nombre d’amplification. Mélangez bien à l’aide d’un agitateur Vortex et rester sur la glace.
    2. Pour chaque réaction d’amplification, placez 35 µL du mélange réactionnel PCR de l’étape 3.10.1 dans les puits d’une plaque PCR.
    3. Pipetter chacun des échantillons perle lié aux saisies bibliothèque piscine haut et en bas pour que la suspension de la perle soit homogène.
    4. Ajouter 15 µL de chaque suspension de perle de piscine bibliothèque capturés au milieu réactionnel PCR approprié. Bien mélanger en pipettant également, jusqu'à ce que la suspension de la perle est homogène.
    5. Placez la plaque préparée au point 3.10.2 dans un thermocycleur et exécutez le programme d’amplification PCR suivant : 98 ° C pendant 2 min, 8 à 11 cycles à 98 ° C pendant 30 s, 60 ° C pour 30 s et 72 ° C pendant 1 min, suivi d’une extension finale à 72 ° C pendant 10 min. Maintenir les échantillons à 4 ° C.
    6. Purifier l’échantillon avec une purification de perles basés selon le protocole du fabricant.
    7. Évaluer la qualité avec un Bioanalyzer selon le protocole du fabricant.
  11. Préparer les échantillons pour multiplexés séquençage
    Remarque : Les échantillons enrichis finales contiennent des piscines de 8 ou 16 bibliothèques indexées, basée sur la taille de la bibliothèque de Capture et résultant de pré-saisie mise en commun de la stratégie. Le nombre total de bibliothèques indexées qui peuvent être multiplexées dans une ruelle de séquençage de l’unique est déterminé par les spécifications de sortie de la plate-forme utilisée, ainsi que la quantité de données de séquençage requises pour la bibliothèque de Capture.
    1. Calculer le nombre d’index qui peuvent être combinés par voie de circulation, selon la capacité de la plate-forme. Le nombre total de bibliothèques indexées qui peuvent être multiplexées dans une ruelle de séquençage de l’unique est déterminé par les spécifications de sortie de la plate-forme utilisée, ainsi que la quantité de données de séquençage requises pour la bibliothèque de Capture. Par exemple, pour la bibliothèque de v5 Exon tous les humains, les données de séquençage recommandé par bibliothèque indexé est de 4 Go et les données de séquençage recommandé par pré-saisie Pool est 32Go (indice de 8 piscines).
  12. Les bibliothèques de la séquence.
    1. Charger les bibliothèques sur la prochaine génération de plates-formes de séquençage de choix et d’effectuer le séquençage exécuter selon les spécifications de l’appareil.
  13. Analyser les données de séquençage de l’exome.
    1. Exécuter le pipeline et le logiciel de choix pour les appels de base. Par exemple, utilisez Stampy de carte lectures20, de supprimer les doublons avec Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) et d’identifier des polymorphismes de nucléotides simples et insertion ou suppression de bases (indels) avec Platypus21. Filtrer les variantes synonymes et ceux observés à une fréquence de l’allèle < 5 % et comparer des données avec celles d’exomes parental afin d’identifier les variantes de novo .

4. préparation d’ADN plasmidique pour In Utero électroporation

  1. Concevoir plusieurs ARN en épingle à cheveux courts (interférents) ciblant la séquence codante ou la région 3' UTR des gènes candidats comme décrit plus haut22.
  2. Pour empêcher les éloignent effets tester interférents spécificité en recherche BLAST contre les bases de données à l’aide de méthodes standard. Exclure les interférents affichant plus de 50 % de la complémentarité avec d’autres gènes de rat.
  3. Oligonucléotides clone recuit dans un vecteur mU6-pro comme décrit précédemment23.
  4. Purifier l’ADN avec un Maxi-prep conformément aux instructions du fabricant de plasmide et faire une concentration finale de 3 µg/µL.
  5. Aliquote 20 µl d’ADN (0,5 mg/ml pCAGGS-GFP soit seul ou avec 1,5 mg/ml de shARN construire) et ajouter 2 µL de Fast vert colorant (2 mg/mL) afin de permettre un contrôle visuel de l’injection.

5. in Utero électroporation

  1. Intervention chirurgicale
    1. Anesthésier E15.5 rates gravides (E0 a été définie comme le jour de la confirmation de plug vaginal sperme-positif), en utilisant une combinaison d’un mélange de kétamine/xylazine (0,1 à 0,01 mg / corps poids, respectivement), qui est donné par une voie intrapéritonéale injection pour l’induction anesthésique.
    2. Assurez-vous que l’animal est complètement anesthésié en observant la disparition du réflexe pincée orteil.
    3. Raser le bas du ventre de l’animal avec la pince pour enlever la fourrure. Désinfecter la peau à l’aide de scrubs de povidone-iode et d’alcool à 70 %. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
    4. Placez l’animal sur une source de chaleur et de mettre un drap stérile (avec une fenêtre ouverte de 4 à 5 cm au milieu) sur le site d’incision. Porter des masques faciaux, blouse de laboratoire, chapeaux et gants chirurgicaux stériles. Maintenir la stérilité jusqu'à la fin de la chirurgie.
    5. À l’aide de ciseaux pointus pour faire une incision verticale (2 à 2,5 cm) de la peau le long de la ligne médiane de l’abdomen caudal et puis faire une incision de la paroi musculaire sous la peau — également de 2,5 cm, le long de la ligne médiane.
    6. Soigneusement exposer une corne utérine de la cavité abdominale. Baisse de 37 ° C préchauffé solution saline normale pour hydrater les embryons. Garder l’utérus humide en permanence.
  2. Injection d’ADN et d’électroporation
    1. Une des cornes utérines tenir doucement avec une pince le phoque annelé et pousser un embryon à la paroi utérine. Maintenir l’embryon dans une main et avec l’autre main insertion avec soin capillaires en verre 1 mm de la ligne médiane dans le ventricule latéral gauche (2-3 mm de profondeur) et injecter environ 1 µL d’ADN avec Fast Green pour permettre une surveillance visuelle de l’injection à l’aide une microinjector.
    2. Laisser tomber une solution saline normale à la surface d’électrodes2 3 x 7 mm. Placer l’électrode positive stérile du côté injecté (ventricule latéral gauche) et l’électrode négative stérile sur le ventricule droit. Livrer 5 impulsions électriques à intervalles de 950 ms avec une pédale de pied (4000 condensateur mF facturés à 40 V avec un électroporateur).
  3. Procédures d’électroporation post
    1. Remettre les cornes utérines de la cavité abdominale, ajouter des gouttes de solution saline normale de la cavité pour permettre des embryons positionnés plus naturellement et pour tenir compte des pertes de fluides peropératoire.
    2. Fermer la paroi musculaire abdominale avec des sutures chirurgicales résorbables, puis la peau à l’aide d’une maille simple-interrompu.
    3. Remettre le rat dans la cage et surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il ressort de l’anesthésie.
    4. Pour la gestion de la douleur administrer buprénorphine (0,03 mg/kg) à l’animal par une injection sous-cutanée tous les 8-12 h, pendant 48 h.

6. préparation des échantillons de cerveau

  1. Méthode de fixation
    1. Sacrifier l’enceinte rat 5 jours après l’intervention chirurgicale avec anesthésie de gaz (isoflurane) suivie d’une rapide dislocation cervicale.
    2. Pratiquer une incision verticale de ré-ouvrir la cavité abdominale.
    3. Exposer les cornes utérines, enlever l’embryon de l’utérus et décapiter les à l’aide de ciseaux pointus.
    4. Enlever le cerveau avec un minimum de dommages au tissu : à l’aide de ciseaux pointus, faire une petite incision le long de la partie postérieure (cervelet) / axe antérieur (bulbes olfactifs) de la tête pour percer la peau et le crâne, puis à l’aide d’une paire de pinces, Décollez le crâne d’exposer la cerveau et supprimez-la à l’aide d’une petite spatule.
    5. Immerger le cerveau pendant la nuit à 4 ° C dans un 4 % paraformaldéhyde à 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS).
  2. Coupes de cerveau
    1. Laver le cerveau dans du PBS 1 x pendant 10 min.
    2. Incorporer des cerveaux dans 4 % d’agar en plastique intégrant des moules.
      1. Préparer 50 mL de gélose de 4 % en solution 1 PBS x pour l’enrobage 5 cerveaux embryonnaires. Faire en sorte qu’agarose dissous est à pas plus de 50 ° C.
    3. Garder le cerveau en gel d’agarose à polymériser pendant au moins 1 h à 4° C. Enlever l’excès d’agarose autour du cerveau.
    4. Coller le cerveau à la plaque de base vibratome, axé sur l’axe antérieur/postérieur du cerveau est perpendiculaire à la lame. Attendre quelques minutes que la colle sécher et placer la plaque avec le cerveau collé dans la chambre vibratome.
    5. Remplir le vibratome avec PBS 1 x. Tranche de 100 µm de coupes épaisses.
    6. Transfert des tranches de cerveau sur des lames, enlever l’excès de liquide, ajouter quelques gouttes de milieu de montage et placer une lamelle sur le dessus de cerveaux

7. confocal imagerie et analyse Quantitative

  1. Laissez le sécher moyen de montage pendant la nuit avant d’imagerie. Sections d’image à 10 X sur un microscope confocal à balayage laser.
  2. À l’aide de logiciels pour l’analyse quantitative d’image, convertir l’image en 8 bits, sélectionnez un représentant GFP fluorescent cellules positives et définissez manuellement la forme. Pour ce faire, cliquez sur « Devis » et dessiner la bordure de la cellule à l’aide de l’outil de sélection à main levée. Dans cette façon le diamètre et le seuil d’intensité de la cellule sont automatiquement conservés par le logiciel.
  3. Cliquez sur « Rechercher les cellules » qui permet au logiciel de localiser les cellules transfected dans le cortex. Puis, le cas échéant, supprimer manuellement des faux positifs.
  4. Diviser toute l’épaisseur du cortex dans 8 domaines d’intérêt normalisés dans différentes sections. Pour ce faire, cliquez sur « Outil de la région », sélectionnez 8 « région Stripes » où le premier (1er) et le dernier (8) bandes correspondent respectivement à la VZ et vers le haut du CP. Cliquez sur « Appliquer » pour permettre au logiciel de compter la position relative des cellules transfectée de GFP dans le cortex entier. Enfin cliquez sur « Enregistrer la Quantification » pour exporter les données dans un fichier Excel pour l’analyse.

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Résultats

La stratégie expérimentale conçue pour identifier de nouveaux gènes causatifs MCD est récapitulée dans la Figure 1.

En effectuant la CGH-array dans une cohorte de 155 patients présentant des anomalies de développement de cerveau combinant variablement PNH (Figure 2 a), dysgénésie du corps calleux, colpocéphalie, hypoplasie du cervelet et polymicrogyria associées à l’épilepsie, ataxie et troubles...

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Discussion

MCDs sont des causes importantes de la déficience intellectuelle et représentent 20 à 40 % de l’enfance pharmacorésistant épilepsie1,2. Intérêt pour MCDs a considérablement augmenté ces dix dernières années grâce à deux facteurs principaux. Le premier est l’amélioration dans d’imagerie cérébrale (en particulier l’IRM), qui permet de visualiser de nombreuses malformations du cerveau qui n’étaient pas précédemment reconnues de médecins et de scientifiques. L’autre ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr G. McGillivray, Pr. J. Clayton-Smith, Pr. W.B. Dobyns, Pr. P. Striano, PR. c'est-À-dire Scheffer, Pr. S.P. Roberston et PR. S.F. Berkovic pour fournir aux patients de la MCD. Nous remercions le Dr F. Michel et D. Mei pour aide et conseils techniques. Ce travail a été financé par le Programme-cadre de l’UE, sept projets de désir, le numéro de contrat : santé-F2-602531-2013, (à V.C., R.G., A.R., A.F. et C.C.), INSERM (à A.R. et C.C.), la Fondation Jérôme Lejeune (R13083AA A.F, E.P.P et C.C.) et Région Provence Alpes Côte d’Azur (APO2014 - DÉMOTIQUE C.C. et A.A.D). D.A.K est un EMBO Young Investigator et est soutenu par la FWF accorde (I914 et P24367).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Picospritzer IIIParker Hannifin CorpP/N 051-0500-900Systèmes de distribution par micro-injection intracellulaire
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252Fast green permet une surveillance visuelle de l’injection
BTX ECM 830 ÉlectroporateurBTX Harvard Apparatus45-0002L’ECM 830 est un générateur d’impulsions à ondes carrées conçu pour les applications
in vitro et in vivoMicrotome HM 650 VMicrom10076838Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz avec lame vibrante
FluoView 300OlympusL’Olympus FluoViewTM 300 est un microscope confocal à balayage laser à balayage ponctuel, à détection de points, conçu pour l’application de recherche
en biologie Logiciel eCELLenceGlance Vision TechnologieseCELLence est un logiciel conçu pour l’analyse quantitative de la migration cellulaire
Agilent Microarray Scanner BundleLames
pour 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K ou 8 x 15KAgilentAgilent p/n G4900DA, G2565CA ou G2565BA
pour 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K ou 8 x 60KAgilentG4900DA ou G2565CA
Chambre d’hybridation, acier inoxydableAgilentAgilent p/n G2534AChambre pour hybridation
CGH en réseauHybridation Lames d’étanchéité de la chambre, paquetjoints pour puces CGH
pour puces à 1 paquet ouAgilentAgilent p/n G2534-60003
pour les puces à 2 paquets ouAgilentAgilent p/n G2534-60002
pour les puces à 4 ouAgilentAgilent p/n G2534-60011
pour les puces à lot de 8AgilentAgilent p/n G2534-60014
Four d’hybridationAgilentAgilent p/n G2545A
Rotateur de four d’hybridation pour chambres d’hybridation de microarraysAgilent Agilentp/n G2530-60029
Thermocycleur avec couvercle chauffantAgilentAgilent p/n G8800A ou équivalentTermal cycleur pour incubations
1,5 mL Tube de microfuge sans RNaseAmbionp/n AM12400 ou équivalentMicrocentrifugeuse
Barre d’agitation magnétiqueCorningp/n 401435 ou équivalentInstrument d’agitation
Fluorimètre Qubit LifeTechnologiesp/n Q32857Instrument de quantification de l’ADN
Kit de dosage Qubit dsDNA BR, à utiliser avec le fluorimètreQubit Invitrogenp/n Q32850Kit pour fluorimètre Qubit
UV-VIS spectrophotomètreThermo ScientificNanoDrop 8000 ou 2000, ou équivalentInstrument pour la quantification de l’ADN
P10, P20, P200 et P1000 pipettesPipetman ou équivalentd’ADN
Concentrateur sous videThermo Scientificp/n DNA120-115 ou
équivalent		Instrument pour concentrer l’ADN
SureTag Kit complet d’étiquetage de l’ADNAgilentp/n 5190-4240Kit de marquage ADN (pour échantillons humains)
Colonnes de purification (50 unités)Agilentp/n 5190-3391Kit de marquage ADN (pour échantillons humains)
AutoScreen A, plaques 96 puitsGE Healthcarep/n 25-9005-98Kit de marquage ADN (pour échantillons humains)
Kit de nettoyage PCR GenEluteSigma-Aldrichp/n NA1020Kit de marquage ADN (pour échantillons humains)
Génomique humaine ADNp/n G1521Kit de marquage ADN (pour échantillons humains)
Pour microréseaux CGH :Promega(femelle) ou p/n G1471 (mâle)Réseau CGH contrôle ADN
Pour les microréseaux CGH+SNP :Coriellp/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878 ou NA18579Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit ouAgilentp/n 5188-5226Hybridation et lavage CGH
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 etAgilentp/n 5188-5221Hybridation et lavage Oligo
aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2Agilentp/n 5188-5222Array CGH hybridation et lavage
Solution de stabilisation et de séchageAgilentp/n 5185-5979Array CGH hybridation et lavage
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Kit d’hybridationAgilentp/n 5188-5220 (25) ou p/n 5188-5380 (100)Hybridation et lavage CGH
Electrique Cot-1Agilentp/n 5190-3393Hybridation et lavage CGH
Agilent CAgilentScanner pour lames CGH
SureSelect XT2 Kit de réactifsKit pour enrichissement cible
Plate-forme HiSeq (HSQ), 16 ÉchantillonsAgilentp/n G9621A
Plate-forme HiSeq (HSQ), 96 échantillonsAgilentp/n G9621B
Plate-forme HiSeq (HSQ), 480 échantillonsAgilentp/n G9621C
Plate-forme MiSeq (MSQ), 16 échantillonsAgilentp/n G9622A
Plate-forme MiSeq (MSQ), 96 échantillonsAgilentp/n G9622B
Plate-forme MiSeq (MSQ), 480 échantillonsAgilentp/n G9622C
DNA 1000 KitAgilentp/n 5067-1504Kit pour la séparation, le dimensionnement et la quantification de fragments d’ADNdb de 25 à 1000 pb.
Kit ADN haute sensibilitéAgilentp/n 5067-4626Kit pour l’analyse d’ADN fragmenté ou de banques d’ADN.
AMPure XPKit pour la purification PCR automatisée.
5 mLAgencourtréf. A63880
60 mLAgencourtréf. A63881
450 mLAgencourtréf. A63882
Dynabeads MyOne Streptavidine T1Isolement et manipulation des acides nucléiques biotinylés
2 mLLife TechnologiesCat #65601
10 mLLife TechnologiesCat #65602
Kit de dosage Quant-iT dsDNA BR, pour le fluorimètreQuantification de l’ADN
100 dosages, 2-1000 ngLife TechnologiesCat #Q32850
500 dosages, 2-1000 ngLife TechnologiesCat #Q32853
Qubit tubes de dosageLife Technologiesp/n Q32856Quantification de l’ADN
SureSelec tXT2 Capture LibrariesAgilenten fonction de l’expérienceKit pour la capture des bibliothèques
SureCycler 8800 ThermocycleurAgilentp/n G8800AAmplification de l’ADN
Module de plaque à 96 puits pour SureCycler 8800 ThermocycleurAgilentp/n G8810AAmplification de l’ADN
compatible SureCycler 8800 Plaques à 96 puits Agilentp/n 410088Amplification de l’ADN
Bande optique capuchonsAgilentp/n 401425Amplification de l’ADN
Bandes de capuchon de tube, bombéesAgilentp/n 410096Amplification de l’ADN
Tapis de compressionAgilentp/n 410187Amplification de l’ADN
2100 Bioanalyzer Laptop BundleAgilentp/n G2943CAAmplification de l’ADN
2100 Bioanalyseur Kit d’électrophorèseAgilentp/n G2947CAAmplification de l’ADN
Système de préparation d’échantillons Covaris, série E ou série SCisaillement d’ADNCovaris
Porte-échantillonsréf. 520078cisaillement de l’ADN
Mélangeur à plaques NutatorBD Diagnosticsp/n 421105 ou équivalentMélangeur à plaques
GaIIxIlluminamachine de séquençage de nouvelle génération
de 5 Distribution scanner Kit Qubit Covaris

Références

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