Création de Génome édités cellules souches pluripotentes humaines Lines: De Ciblage Isolement

Résumé

L’édition du génome des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) peut être effectuée rapidement et efficacement. Voici une procédure expérimentale robuste pour modifier génétiquement les hPSC, comme en témoigne l’édition du locus de la sphère de sécurité AAVS1 pour exprimer l’EGFP et introduire une résistance aux antibiotiques.

Résumé

Génome édition de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) fournit une plate-forme génétiquement contrôlée et cliniquement pertinente pour partir à comprendre le développement humain et d'enquêter sur la physiopathologie de la maladie. En employant des nucléases spécifiques au site (SNA) pour l'édition du génome, la dérivation rapide de nouvelles lignes HPSC hébergeant altérations génétiques spécifiques dans un cadre par ailleurs isogène devient possible. Nucléases à doigts de zinc (ZFN), transcription nucléases de type activateur de effectrices (Talens) et regroupés répétitions palindromiques courts régulièrement espacées (CRISPR) / cas9 sont les filets de protection sociale les plus couramment utilisés. Tous ces nucléases fonction en introduisant une double rupture de brin d'ADN à un site spécifié, favorisant ainsi l'édition de gènes précis à un locus génomique. Édition du génome SSN-médité exploite deux des mécanismes de réparation de l'ADN endogènes de la cellule, rejoignant fin non homologue (NHEJ) et la réparation dirigée homologie (HDR), soit à introduire insertion / mutations de délétion ou alter le génome en utilisant un modèle de réparation homologue sur le site de la double rupture brin. Électroporation de hPSCs est un moyen efficace de transfection SNA et les modèles de réparation qui intègrent transgènes tels que journalistes fluorescentes et cassettes de résistance aux antibiotiques. Après électroporation, il est possible d'isoler uniquement les hPSCs qui ont incorporé la construction de réparation en sélectionnant pour la résistance aux antibiotiques. La séparation mécanique de colonies HPSC et confirmant la bonne intégration dans le site cible à travers le génotypage permet l'isolement de lignées de cellules correctement ciblées et génétiquement homogènes. La validité de ce protocole est démontré ici en utilisant tous les trois plates-formes SSN à intégrer EGFP et une résistance à la puromycine construisent dans le AAVS1 sécurité locus port de cellules souches pluripotentes humaines.

Introduction

Technologies d'édition de Génome évoluent rapidement dans les outils standard pour la biologie moléculaire et cellulaire ^1. Le génie génétique des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) est d'un intérêt particulier en tant hPSCs représentent une source de cellules humaines primaires génétiquement intactes auto-renouvellement. hPSCs peuvent être différenciées en divers types de cellules pour la modélisation de la maladie ou en tant que source pour des thérapies de transplantation ^2,3. Démontré ici est un protocole qui utilise trois types de nucléases spécifiques au site (SNA) en conjonction avec les mécanismes de réparation d'ADN endogènes pour l'intégration ciblée d'une construction reporter au locus AAVS1 différents. Après transfection de SNA dans hPSCs, nous démontrons comment isoler des populations de cellules isogéniques hébergeant le journaliste.

La capacité de manipuler les génomes, spécifiquement souches pluripotentes génomes cellulaires, en utilisant SNA est pas un phénomène nouveau que l'utilité de nucléases à doigts de zinc (de ZFN) et la transcription de activénucléases effectrices ou comme-Talens () pour l'édition de gènes a été démontrée il ya plusieurs années ^4-10. Cependant, avec l'avènement de S. pyogenes CRISPR / technologie cas9 ^11-13, édition de gène est devenu largement accessible ^14. Tous les numéros de sécurité sociale introduisent une double rupture d'ADN simple brin (DSB) sur le site cible spécifié ^1,4,5,11 qui est réparé par des mécanismes cellulaires endogènes en utilisant soit non homologue réparation de fin d'assemblage (NHEJ) ou d'homologie dirigé (HDR) ^15. NHEJ est sujette aux erreurs et peut introduire des mutations de décalage du cadre entraînant la perte de la fonction des gènes, alors que HDR permet de nouveaux éléments à introduire à travers la co-transfection d'un modèle de réparation avec le SSN. Bien que les principes sous-jacents de réparation de l'ADN qui facilitent l'édition de gènes sont pensés pour être en grande partie le même pour chaque SSN, certaines différences entre les plates-formes peuvent être notées. De la conception de novo ZFNs permet la flexibilité et l'optimisation nucléase ^16, cependant l'utilisation de publicbibliothèques de montage disponibles et des outils de dépistage pour concevoir ZFNs individuels peuvent prendre beaucoup de temps. Une fois que le lieu géométrique souhaitée pour le ciblage médié par ZFN est déterminée, ZFN paires peuvent être conçus avec l'outil en ligne ¹⁷ ZiFit. Après la conception, ZFNs peut être modulaire assemblé à travers plusieurs séries de plasmide ¹⁸ clonage. Sinon, il ya beaucoup, ZFNs pré-validé disponibles dans le commerce ^19. Nucléases TALE peuvent également être conçus en utilisant des outils en ligne et des composants disponibles publiquement ^17,20. Par exemple, TALENs peut être rapidement assemblé à partir de blocs de cinq répétitions de fées, à travers l'ensemble de FLASH ^{21 ou} en utilisant la PCR basée hiérarchique Assemblée Golden Gate ^22. Facilité de la conception du SSN et de la vitesse de construction utilisant CRISPR / cas9 ont fait génome édition d'un outil largement accessible. Le petit guide ARN médiée ciblage des CRISPR / cas9 permet également de multiplexage des ARN guides de cibler plusieurs loci avec une construction unique ^14. Le stylecas9 de gène pour le montage ne ​​nécessite que l'identification d'un motif adjacent de protospacer (PAM; un trinucléotide NGG pour S. pyogenes cas9) proximale par rapport au locus cible. En insérant un oligonucleotide correspondant aux 20 paires de bases 5 'de l'APM dans le plasmide d'px330 ^14, le produit de construction peut être monté dans une étape de clonage. En plus de S. pyogenes cas9, cas9 de N. meningitidis (NmCas9) qui reconnaît un '(PAM) 5'-NNNNGATT-3 a été montré efficace pour permettre une modification dans le gène hPSCs ^23.

En plus des différences de facilité de conception SSN, chaque plate-forme a des propriétés spécifiques. Par exemple, les ZFN et TALENs utilisent le domaine de nuclease Fokl, qui génère un quatre nucleotides 5 'en surplomb ²⁴ tout en cas9 On pense que la plupart du temps générer DSB à extrémités franches. ZFN, TALENs, et cas9 diffèrent dans leurs stabilités de protéines, la vitesse de marche-arrêt de l'ADN cible, et le mode de balayage de l'ADN, qui could théoriquement entraîner de petites différences dans l'édition résultat ^1. Bien que d'autres études seront nécessaires pour comprendre pleinement les conséquences de ces différences, que nous décrivons ici un protocole qui est très robuste dans tous les trois plates-formes et peut être utilisé pour générer facilement hPSCs génétiquement modifiés.

Peu de choix SSN, électroporation est une procédure robuste pour transfecter SNA et modèles homologie de réparation dans hPSCs ^25. Le nombre de colonies survivantes après la sélection pour la résistance aux antibiotiques dépend de paramètres spécifiques de locus et la stratégie d'édition (par exemple, la taille de l'insert transgénique et le mode de sélection). Le protocole décrit ici se traduit généralement par environ 150-400 colonies seule cellule dérivés.

Gene-édition au niveau du locus AAVS1 utilisant ce protocole a déjà été utilisé pour démontrer l'efficacité du SNA ^4,5. Le modèle de réparation AAV-CAGGS-EGFP utilise un str de piégeage de gènesatégie de conférer d'une manière spécifique du locus résistance à la puromycine. En résumé, le modèle de réparation contient un site accepteur d'épissage en amont de la cassette de résistance à la puromycine sans promoteur. Lors de l'intégration correcte dans le premier intron du gène PPP1R12C au locus AAVS1, la cassette de résistance est exprimé à partir du promoteur du gène modifié. La robustesse de ce test de AAVS1 spécifique nous permet de comparer l'efficacité de chaque plate-forme SSN.

Édition de Gene utilisant SNA est puissante, étant donné la capacité de perturber et / ou de modifier tout gène théoriquement. L'application de cette stratégie à hPSCs fournit polyvalence hPSCs peuvent être ensuite différenciés en une multitude de types de cellules humaines telles que les neurones ^26, les hépatocytes ^{27, 28} et les cardiomyocytes. En outre, l'utilisation de cellules souches pluripotentes induites patient dérivé permet la réparation ou l'introduction de mutations pathogènes connus dans un fond génétique spécifique au patient ²⁹ , En fournissant une plate-forme à partir de laquelle pour étudier les mécanismes de la maladie et de la thérapeutique de test en utilisant les propres cellules du patient ^30. En résumé, l'édition de gène dans hPSCs est une approche efficace et polyvalent pour étudier la biologie fondamentale du développement humain et de la maladie ^31.

Protocole

Les procédures décrites dans ce manuscrit ont été examinés et approuvés par le Comité de surveillance de la recherche sur les cellules souches UC Berkeley.

1. Préparer cellules souches pour Édition

1. Grow et cellules souches pluripotentes humaines culture (de hPSCs) sur une plaque à 6 puits contenant 2,4 × 10 ⁶ cellules / plaque de la souris mitomycine C-inactivé fibroblastes embryonnaires (MEF) mangeoires cultivées sur de la gélatine ^32. Maintenir hPSCs dans 3 ml de milieu de cellules souches embryonnaires humaines par puits (médias CSEh) et de grandir dans un 37 Incubateur ° C avec 3% de O _2/5% de CO _2.
   Remarque: Pour la réussite de ce protocole, il est pas nécessaire de maintenir hPSCs dans un incubateur faible teneur en oxygène; cependant il est important de noter que hPSCs prolifèrent plus rapidement dans un environnement de haute O _2, de sorte que les temps et le nombre de cellules doivent être ajustées en conséquence. Il convient également de noter que hPSCs maintenus en faible teneur en oxygène ont des taux inférieurs de différenciation spontanée ^33.
   1. To rendre les médias 500 ml de CSEh combiner 380 ml de DMEM / F12, 75 ml de sérum fœtal bovin (FBS), 25 ml KnockOut Serum Replacement (KSR). Ajouter glutamine (1 mM concentration finale), 5 ml 100x acides aminés non essentiels, 100 unités / ml de pénicilline-streptomycine (P / S), le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF) (4 ng / ml de concentration finale), et le 2- mercaptoéthanol (5,5 uM de concentration finale).
2. Changer médias en enlevant volume entier de presse (3 ml) à l'aide d'une pipette de verre et de vide. Remplacez-les par les médias de CSEh 3 ml tiède à l'aide d'une pipette sérologique. Répéter les médias changent tous les jours jusqu'à hPSCs sont environ 50% de confluence (jour -1).
3. Un jour avant le ciblage (jour -1), changer de support de CSEh, en supprimant les anciens médias et ajout de médias de CSEh chaudes complété avec 10 uM Y-27632.
4. Aussi le jour -1, préparer un à deux à 6 puits ou plaques de 10 cm de résistants des cellules nourricières MEF de drogue provenant de souris DR4 (2,4 × 10 ⁶ cellules / plaque) ^34.
   Remarque: En général, les plaques à 6 puits sont advantageous plus de plaques de 10 cm, comme ils accueillent plus de médias. Plaques à 6 puits assurent également que différents clones de différents puits sont indépendants. Toutefois, une plaque de 10 cm permet prélèvement plus facile, en fonction du microscope disponible pour ce processus.

2. Modification de cellules souches pluripotentes

1. Préparer des solutions de transfection par aspiration 5 ug de chaque ZFN 1 et 2, TALEN 1 et 2, ou 15 pg de l'CRISPR / cas9 codant px330 plasmide (figure 1) dans un tube de 1,5 ml. Introduire à la pipette 30 pg du plasmide de réparation dans ce tube ainsi. Finalement, une pipette 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le tube pour amener le volume à 300 ul.
   Note: Préparer les plasmides en tant que Midiprep (n'importe quel kit est approprié) avec une concentration minimale de 300 ng / pl pour maintenir le volume total de la solution de transfection moins de 300 ul. Il est pas nécessaire d'effectuer une extraction au phénol / chloroforme, pour linéariser le plasmide, ou d'utiliser un endotoxin plasmide libre kit de préparation.
2. Retirez le support du hPSCs aide d'une pipette de verre et de vide. Pipette 2 ml chaude 1x PBS dans chaque puits pour se laver les cellules.
3. Retirez le PBS immédiatement en utilisant une pipette en verre et le vide. Ajouter 0,5 ml de 0,25% solution de trypsine-EDTA directement sur les cellules dans chaque puits. Placer à l'étuve (37 ° C / 5% CO ₂ / O ₂ à 3%) pendant environ 10 min. ou jusqu'à ce que la couche d'alimentation commence à décoller la plaque.
4. Ajouter 2 ml de milieu chaud esWash (470 ml de DMEM / F12, 25 ml de FBS, 100 unités / ml P / S) à chaque puits pour arrêter la réaction de la trypsine.
5. Veiller à ce que des cellules nourricières se détacher comme une feuille. Pipeter le contenu de chaque puits dans un seul tube conique de 50 ml, en combinant tous les puits. Broyez les cellules en utilisant une pipette de 10 ml sérologique. Il est pas nécessaire de briser la couche d'alimentation; hPSCs se détache de la couche d'alimentation par trituration douce. Il devrait être d'environ 15 ml de la suspension cellulaire.
6. Ajouter 25 ml de milieu esWash sur le tube pour amener le volumoi jusqu'à 40 ml au total. Permettre aux gros morceaux de desserte à se déposent au fond du tube pendant 1-2 min. Eliminer le surnageant (~ 38 ml) à partir du tube en utilisant une pipette sérologique et dépôt dans un nouveau tube conique de 50 ml.
7. Isoler pendant 5 min à 190 x g. Retirer le surnageant du tube en utilisant une pipette en verre et le vide. Soyez sûr de ne pas perturber le culot cellulaire. Reprendre les cellules dans 500 ul PBS 1x. Mélanger avec une solution de transfection plasmidique préparé plus tôt. Compter les cellules à cette étape. Utilisez 5-10 millions de cellules par électroporation.
8. Introduire à la pipette la totalité de la suspension de 800 pi dans une cuvette d'électroporation de 4 mm, placer sur la glace pendant 3-5 min. L'électroporation des cellules en utilisant le programme exponentielle sur le système d'électroporation avec les paramètres suivants: 250 V, 500 uF, résistance ∞, 4 mm et la taille de la cuve. Après électroporation, placer la cuvette de retour sur la glace pendant 3 min.
   Remarque: Respecter la constante de temps de l'électroporation sur le système d'électroporation. La constante de tempsvarie en fonction du nombre de cellules et la pureté de l'ADN. Transfections réussissent ont généralement une constante de temps entre 10-14 ms en utilisant les conditions énumérées et un pulseur de gènes II. Une efficacité moindre d'électroporation peuvent se produire lorsque des constantes de temps varie de ces valeurs.
9. Reprendre cellules électroporées dans 18 ml chaude CSEh milieux supplémentés avec 10 uM Y-27632. Planche 3 ml de cette suspension cellulaire unique dans chaque puits d'une plaque à 6 puits avec des cellules nourricières DR4. Retour à l'incubateur (37 ° C / 5% CO _2/3% de O 2).

3. Sélection des colonies positives

1. Jour 2, retirez tous les médias à l'aide d'une pipette de verre et de vide. Remplacez-les par 3 ml de milieu de CSEh chaudes complété avec 10 uM Y-27632. Jour 3, retirez tous les médias à l'aide d'une pipette de verre et de vide. Remplacer avec 3 ml de milieu de CSEh chaud sans y compris Y-27632. Jour 4, retirez tous les médias à l'aide d'une pipette de verre et de vide. Remplacer avec 3 ml de milieu de CSEh chauds complétés avec des antibiotiques pour selectisur. Retour à l'incubateur (37 ° C / 5% CO _2/3% de O 2).
   Remarque: Le type d'antibiotique utilisée dépendra de la cassette de résistance incluse dans le modèle de réparation. Lorsque l'on travaille avec WIBR # 3 hPSCs (NIH registre 0079), 0,5 pg / ml de puromycine, 70 ug / ml de G418 (généticine), et 35 ug / ml d'hygromycine ont été utilisés avec succès. Les concentrations de sélection devraient être déterminées empiriquement en établissant la concentration minimale d'antibiotique nécessaire pour tuer les cellules de type sauvage en environ une semaine.
2. 5-12 jours, changent quotidien des médias, en remplacement de vieux médias à chaque fois avec les médias de CSEh chauds complétés avec des antibiotiques.
   Remarque: Attendez-vous à une grande quantité de la mort cellulaire. Des colonies individuelles apparaîtront autour du jour 8-10. Médias CSEh régulière sans antibiotiques peut être utilisée après 12-14 jours de sélection continue. Si la densité cellulaire est élevée ou la mort cellulaire est lente, l'acidification des médias devrait être évitée et il peut être nécessaire d'augmenter les volu médiasmoi (jusqu'à 4-5 ml) pendant les quelques premiers jours de sélection.

4. Cueillette colonies sélectionnées (Jour 12-14)

1. Observez les colonies sur les jours 12-14. Observez les colonies qui sont prêts à prendre sur un microscope de dissection et veiller à ce qu'ils ne contiennent pas de cellules qui commencent à se différencier. La taille approximative devrait être 800-1200 uM. Si les colonies atteignent cette taille avant le jour 12, il est recommandé qu'ils soient cueillis alors.
   Remarque: Pour chaque expérience de ciblage, ramasser autant de colonies que nécessaire pour assurer le génotype souhaité est isolé. A titre d'exemple, AAVS1 montage avec le modèle de réparation AAV-EGFP-CAGGS a montré intégration cohérente robuste, et ne nécessite que de 12 à 24 colonies à prélever pour obtenir environ 5 à 10 hétérozygote clones ciblés. D'autres expériences de ciblage peut exiger plus de colonies à être ramassés (tableau 1). La fréquence des événements de ciblage correct dépend de facteurs tels que l'efficacité de la SSN à introduire un ORD, la taille de l'insert, et la stratégie de sélection. Dans le cas de l'approche de piégeage de gènes pour le locus AAVS1 présentée ici, le marqueur de sélection est exprimé uniquement lorsqu'il est correctement intégré au site cible, réduisant le nombre de colonies requises pour obtenir un clone bien ciblée.
2. Un jour avant la cueillette, préparer des plaques à 12 puits de MEF (2,4 × 10 ⁶ cellules / plaque, un puits seront utilisés pour chaque colonie ramassé).
3. Le jour de la cueillette, retirez tous les supports des plaques à 12 puits MEF utilisant une pipette en verre et le vide et le remplacer par 1 ml de milieu de CSEh. Aussi le jour de la cueillette, changer CSEh médias sur les plaques 6 puits qui vont être repris.
4. Tirer pipettes en verre pour la dissociation mécanique des colonies individuelles à partir de la couche d'alimentation. Abaisser les pipettes sur un brûleur Bunsen capot et adoucie au point d'expansion jusqu'à ce verre est malléable. Enlever rapidement de la flamme et tirez la pipette créer en dehors d'un point angulaire. Casser lesignaler environ 2 cm de l'axe plié, laissant un étroit canal. Polir l'extrémité du canal par exposition à une flamme de 1 à 2 sec.
   Remarque: ramasser option colonies une pointe de pipette de p20, cependant, cela peut réduire la clonalité de la culture, comme la pointe terne peut déloger plus grandes quantités de cellules de chaque colonie dans les médias, potentiellement contaminant cueillettes ultérieures.
5. Assemblez Dispositif de prise en prenant une pipette pointe de filtre p1000 et fixer une ampoule d'aspiration à l'extrémité étroite. Insérez la pipette en verre tiré à la fin de large.
6. Placer une plaque de 6 puits de hPSCs à être capté sur la scène d'un microscope de dissection monté dans une hotte de culture de tissus. Comprimer le bulbe du dispositif de prélèvement et exciser doucement et coupez une colonie individuelle en 10-20 morceaux de taille égale, en prenant soin de ne pas libérer morceaux dans les médias. Prenez morceaux HPSC excisés de la colonie dans la pipette en libérant l'ampoule. Essayez de prendre aussi peu que possible les médias pendant le transfert.
7. Transfer la colonie individu à un seul puits d'une plaque MEF 12 puits, en comprimant l'ampoule à nouveau directement dans le puits, libérant la colonie désormais rompu. Étiqueter chaque puits pour permettre l'identification unique d'une seule cellule clones dérivés. Répétez l'opération pour autant de colonies que nécessaire, en changeant la pipette de verre à chaque fois.
   Remarque: Cueillette colonies peuvent prendre un certain temps pour apprendre. Il est recommandé que la pratique de l'expérimentateur sur certaines cellules de contrôle avant de tenter d'isoler des colonies ciblées.
8. Retourner plaques de 12 puits à l'étuve (37 ° C / 3% de O _{2/5% CO} 2), secouant délicatement la première plaque pour éviter l'accumulation de cellules dans le milieu de chaque puits.
9. Le lendemain et les jours suivants avec, supprimer plein volume de support à l'aide d'une pipette de verre et le vide et le remplacer par 1,5 ml de milieu de CSEh chaud jusqu'à ce que les cellules sont d'environ 50% de confluence (cela prend habituellement 10-12 jours).
10. Après 10-12 jours, en choisir un à deux colonies de chaque puits et transférer aux nouvelles plaques MEF-12 ainsi retourbage étapes 4.1-4.8 pour générer une plaque de réplique.
11. Extraire l'ADN (voir ci-dessous) à partir des colonies restantes dans chaque puits des plaques originales MEF.
    1. Retirez le support de tous les puits à l'aide d'une pipette de verre et de vide. Pipette de 1 ml PBS 1X ONTO chaque puits pour laver les cellules. Retirer PBS en utilisant une pipette de verre et de vide. Introduire à la pipette 250 ul de tampon de lyse cellulaire (les concentrations finales dans H ₂ O: Tris HCl 10 mM, EDTA 5 mM, 0,2% de SDS, 200 mM de NaCl, 0,08 mg / ml de protéinase-K) sur chacun des puits. Placer dans un incubateur (37 ° C / 3% de O _2/5% CO ₂₎ O / N.
    2. Le jour suivant, le contenu de la pipette dans chaque puits des tubes de 1,5 ml individuels. Introduire à la pipette 250 ul de l'alcool isopropylique dans chaque tube pour précipiter l'ADN. Agiter le tube vigoureusement. Un précipité blanc doit être visible.
    3. Spin chaque tube bas pendant 3 min à 13000 rpm dans une centrifugeuse de dessus de table. Après rotation vers le bas, éliminer le surnageant par décantation dans les déchets liquides. Un petit culot d'ADN doit rester collé à la partie inférieure dele tube. Pipeter 250 ul de 70% d'éthanol dans chaque tube à laver le culot d'ADN. Secoue vigoureusement. Spin chaque tube bas pendant 3 min à 13000 rpm dans une centrifugeuse de dessus de table.
    4. Après tourner vers le bas, éliminer le surnageant par décantation dans les déchets liquides. Un petit culot d'ADN doit rester collée au fond du tube. Pipeter le reste du surnageant de sorte qu'il n'y a pas de liquide dans le tube gauche. Laissez tube ouvert à sécher sur paillasse pendant 5-10 min. Après séchage, remettre en suspension l'ADN dans du tampon TE 250 ul. Placez à 37 ° C pendant 6 heures pour permettre à l'ADN pour dissoudre.
12. Génotype chaque échantillon en utilisant une stratégie de pré-optimisée PCR ou par transfert de Southern.
    Remarque:.. Pour AAVS1 ciblage en utilisant le modèle de réparation AAV-CAGGS-EGFP, la stratégie de transfert de Southern peut être trouvée dans Hockemeyer et al, 2009 ⁴ Un protocole de transfert de Southern complète peut être trouvée dans le sud 2006 ³⁵ Pour multiplex génotypage par PCR de. la même expérience, les amorces et les conditions peuvent êtretrouvé dans le tableau 2 ^36.
13. Jeter puits qui ne sont pas bien ciblées et de continuer à changer médias CSEh sur les cellules ciblées correctement tous les jours. Congeler bas les cellules quand ils sont environ 50% de confluence, voir ci-dessous pour la congélation protocole.
    1. Un jour avant la congélation, changer médias CSEh, en supprimant les anciens médias et ajout de médias de CSEh chaudes complété avec 10 uM Y-27632.
    2. Le jour de gel préparer 0,5 ml de chaque solution A et de solution B par puits d'une plaque à 12 puits qui est en cours de congélation dans 15 ml deux tubes coniques. La place des solutions sur la glace. Solution A: 50% des médias CSEh et 50% de FBS; Solution B: 80% de FBS et 20% diméthylsulfoxyde (DMSO).
    3. Dissocier les colonies HPSC en cellules individuelles avant de les congeler. Suivez les étapes de 2,2-2,8 pour ce faire, mise à l'échelle des volumes en conséquence. Culot cellulaire entièrement remettre en suspension dans 0,5 ml de solution A.
    4. Ajouter 0,5 ml de solution B à la suspension de cellules, une pipette de haut en bas pour faire la suspension de cellules homogène. Take au volume total de la suspension de cellules (~ 1 ml) et de dépôt dans un cryotube de 2 ml. Visser hermétiquement le couvercle.
    5. Lieu cryotube dans un congélateur à -80 ° C O / N. Le jour après la congélation, à éliminer les cellules congelées en provenance de -80 ° C congélateur et placer immédiatement dans le réservoir de l'azote liquide pour le stockage à long terme.

Résultats

Ici, nous démontrons un protocole compatible avec trois plateformes de SSN différents pour créer des lignes HPSC génétiquement modifiés. Nous avons ciblé WIBR # 3 cellules souches embryonnaires humaines au niveau du locus AAVS1 utilisant ZFNs publiés antérieurement ^{4, 5 et} TALENs CRISPR / Cas9s ³⁷ en utilisant un modèle de réparation qui introduit une journaliste de l'EGFP et une cassette de résistance à la puromycine ^4.

Nous avons cultivé nos hPSCs sur MEF pour un flux de production de culture cellulaire permettant le maintien et l'expansion de hPSCs indifférenciées (Figure 2), qui est également rentable et évolutive. Si les cellules sont cultivées plus longtemps que nécessaire, il existe un risque accru de différenciation, ce qui réduit le nombre de cellules pluripotentes qui sont transfectées et par conséquent le nombre de colonies obtenues HPSC correctement ciblées.

Nous electropest filmée 5.0 x 10 ⁶ cellules par plate-forme SSN et les plaqués cellules de chaque ciblage sur une seule plaque de 6 puits de DR4 MEF. Après sélection, chaque plate-forme a donné lieu à des colonies de EGFP-positives (figure 3) et une combinaison de clones non ciblées, homozygote et hétérozygote ciblées ciblées (figure 4A, B; tableau 3). Dans les conditions présentées ici, nous constatons que le AAVS1 TALENs a entraîné dans la plupart des clones EGFP-positifs. Le modèle de réparation utilisés pour cette expérience se compose d'un site accepteur d'épissage en amont du reporter et résistance à la puromycine la cassette EGFP. En utilisant cette stratégie «gène-piège" (figure 1), le produit d'assemblage doit insérer dans le premier intron du locus AAVS1, en ​​utilisant le promoteur endogène pour diriger l'expression de la cassette de résistance à la puromycine. L'absence d'un promoteur dirigeant l'expression du gène de résistance à la puromycine à l'intérieur du modèle de réparation doit empêcher l'expression de la cas de l'intégration aléatoire.

Par conséquent, nous nous attendons à ce que tous les clones de puromycine résistant seraient ciblés sur le site AAVS1. Il convient de noter qu'un sous-ensemble de clones portent des intégrations aberrants dans le locus AAVS1 qui sont détectables par transfert de Southern en utilisant une sonde interne, mais pas par la plupart des stratégies de PCR (figure 1; la figure ⁴ 4C). Ces événements d'intégration sont probablement le résultat d'événements ciblant hétérologues menant à de multiples intégrations du plasmide donneur ^4. Nous avons choisi 24 colonies de chaque expérience SSN et a constaté que toutes les plateformes efficacités très élevées de ciblage et ont montré des différences minimes. Comme interrogé par PCR, CRISPR / cas9 donné les clones les plus correctement ciblée tandis que la plateforme avait TALEN les clones les plus homozygote ciblées (tableau 3).

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Figure 1. Schéma d'un gène modifié locus AAVS1 en utilisant le modèle de réparation AAV-CAGGS-EGFP. Modifié à partir Hockemeyer et al., 2009. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Colonies de WIBR # 3 cellules. Images de champ lumineux représentatifs de colonies de WIBR # 3 cellules souches embryonnaires humaines avant de ciblage. Notez l'absence de différenciation et de la séparation claire de la couche d'alimentation dans une colonie idéale (à gauche), par opposition à un non-idéal (à droite). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. EGFP positif WIBR # 3 cellules. Des images représentatives de WIBR # 3 cellules ciblées avec un modèle de réparation exprimant EGFP au locus AAVS1. Images de colonies représentatives éditées avec ZFNs, TALENs et CRISPR / cas9 sont présentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. stratégies de génotypage pour confirmer ciblage correct. (A) les résultats de génotypage Représentant PCR montrant clones ciblés non ciblées, hétérozygotes et homozygotes à travers les trois plates-formes SSN. WT CTL = contrôle de type sauvage. (B) repréRésultats du Sud représentatives blot montrant une hétérozygote ciblée clone et un clone homozygote ciblée détecté avec une sonde externe 3 '. Les tailles des fragments: WT-6,5 kb, édité-6.9 ko. (C) des résultats de Southern blot représentatif montrant un clone correctement révisés, et un clone hétérozygote avec un double-intégration non-aléatoire. Les tailles des fragments. Correctement édités-6.9 ko, aberrante supplémentaire intégration-5 kb S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Faire des études	Gène ciblé	Plate-forme	Réparation type de modèle	# De clones choisi	Efficacité du ciblage
Sexton et al., 2014	TPP1	ZFN	GFP-Puro	non déclarée
Sexton et al., 2014	TERT	ZFN	Hygromycine	non déclarée	non déclarée
Hockemeyer et al., 2009	POU5F1	ZFN	GFP-Puro	31	39,0%
Hockemeyer et al., 2009	Pitx3	ZFN	GFP-Puro	74	14,9%
Hockemeyer et al., 2011	POU5F1	TALEN	GFP-Puro	68	91,0%
Hockemeyer et al., 2011	Pitx3	TALEN	GFP-Puro	96	13,0%
Merkle et al. 2015	VASA	Cas9	Reporter-Geneticin	139	94,0%
Merkle et al. </ em> 2015	CRH	Cas9	Reporter-Geneticin	30	93,0%
Merkle et al. 2015	HCRT	Cas9	Reporter-Geneticin	154	92,0%
Merkle et al. 2015	HMX2	Cas9	Reporter-Geneticin	11	45,0%
Forster et al., 2014	LRG5-Nterm	ZFN	GFP-Puro	non déclarée	30,0%
Forster et al., 2014	LRG5-Cterm	ZFN	GFP-Puro	non déclarée	14,0%
Soldner et al., 2011	SNCA	ZFN	Puro	96	10%

non déclarée

Tableau 1. Description des autres gènes ciblés en utilisant cette méthode, avec Correpondant ciblant l'efficacité tirées d'études déjà publiées. ^4,5,38-41

Lieu	Séquence	Remarques
AAVS1-F amorce	CTCTAACGCTGCCGTCTCTC	Les conditions de PCR: T m = 57 ° C, 35 cycles
AAVS1-WT-R amorce	GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG	WT bande: 1273 pb
AAVS1 ciblées-R amorce	CGTCACCGCATGTTAGAAGA	Bande ciblée: 992 pb
Cas9-guide T2	GGGCCACTAGGGACAGGAT	Du Mali et al. 2013
AAVS1-ZFN-droit	TAGGGACAGGAT	De Hockemeyer et al., 2009
AAVS1-ZFN-Gauche	TGGGGTGTCACC	De Hockemeyer et al., 2009
AAVS1-TALEN-droit	TCCTAACCACTGTCTTT	De Hockemeyer et al., 2011
AAVS1-TALEN-Gauche	CCCCTCCACCCCACAGT	De Hockemeyer et al., 2011

Tableau 2. Liste des amorces et SSN séquences de ciblage.

Construction de ciblage	Nombre de EGFP + Colonies	Clones choisis ciblées (PCR vérifiée)	Précédent efficacité de ciblage correct Rapporté (par transfert de Southern)
ZFN	150	86,9% (73,9% het / 13,0% homo)	56% (50% het / 6% homo)
TALEN	412	91,3% (47,8% het / 39,1% homo)	47% (37,5% het / 9,3% homo)
CRISPR-cas9	235	95,7% (69,5% het / 26,3% homo)	non déclarée

Tableau 3. Les chiffres correspondants de EGFP-positif et ciblées TALEN, ZFN et CRISPR / colonies de cellules souches humaines cas9. PCR vérifiées intégrations au locus AAVS1 pour cette expérience sont comparés à Southern vérifié intégrations simples appropriées dans les expériences précédentes ^{de 4,5.}

Discussion

La méthode présentée ici pour isoler des populations homogènes de cellules souches pluripotentes humaines gène modifié est une approche puissante pour générer des lignées isogéniques HPSC qui diffèrent seulement au niveau du locus ciblé. Ces cellules sont un système idéal pour sonder les mécanismes de différenciation cellulaire humaine et le développement ainsi que pour la compréhension de la physiopathologie des maladies monogéniques dans un cadre génétique contrôlée. Comme démontré ici, il est possible d'utiliser trois stratégies de conception SSN indépendants (ZFNs, TALENs, et CRISPR / cas9) pour réaliser l'intégration ciblée au locus AAVS1. Chacune de ces méthodes a ses propres avantages et inconvénients. Un avantage potentiel de ZFN et, dans une certaine mesure, TALENs est leur souplesse de conception, ce qui permet ingénierie itératif afin d'améliorer la nucleases domaines de liaison à l'ADN ⁴² individuels. Cette optimisation de la nuclease peut augmenter la spécificité des ZFN et TALENs au-delà de ce qui est réalisable avec le CRISystème SPR / cas9. Une telle sélectivité peut être important pour les applications cliniques nécessitant un degré élevé de spécificité de cible. Le principal avantage du système / cas9 CRISPR est sa facilité d'utilisation. Bien que des kits de construction Talen et ZFN ont été mis à la disposition du public (par exemple, par le biais Addgene ^21), / SNA à base de cas9 CRISPR sont nettement plus faciles à construire, comme la seule personnalisation nécessaire est une paire oligonucléotide 20 de base (en utilisant le plasmide px330 conception ^14). Cette simplicité se révèle être avantageux pour les laboratoires de recherche qui cherchent à inclure édition du génome dans leurs études.

Il existe des techniques de transfection alternatives, y compris nucléofection ^43, pour créer des lignes HPSC gène modifié; cependant électroporation a été montré pour être efficace ^4,5,25 cohérente et de coût. Nucléofection peut être utilisé pour transfecter directement les complexes ARN-ribonucléoprotéine cas9 guidage dans le noyau, ce qui augmente l'efficacité d'un SSNd fidélité ^44. Grandir hPSCs sur MEF est une méthode robuste et peu coûteux à entretenir hPSCs dans un état pluripotent sans différenciation excessive. En outre, elle permet l'isolement facile pour des colonies génétiquement identiques. Alternativement, il est possible de hPSCs de culture sans MEF, mais ces conditions de culture peuvent être plus chers que les cultures à base de desserte. En outre, l'ensemble du processus est extensible, ce qui permet l'isolement d'événements d'édition de très rares ou la génération de nombreuses lignées cellulaires dans des expériences distinctes de montage parallèles.

Le protocole décrit ici est robuste; Mais il ya plusieurs étapes clés qui influent sur l'efficacité avec laquelle clones correctement édités peuvent être obtenus. L'élément le plus important de cette méthode est d'avoir MEF de haute qualité et résistant aux médicaments MEF DR4. La survie de hPSCs simples est ténue, et MEF faible qualité nuira à l'isolement des lignes HPSC indifférenciées. Deuxièmement, l'utilisation de Y-27632 est égalementclé pour permettre la survie de la cellule unique sans générer une pression sélective pour les cellules avec un caryotype anormal ^45. Troisièmement, prélèvement de colonies bien espacées assure l'homogénéité génétique des lignées cellulaires dérivées. Enfin, il est important de préparer des pipettes en verre de sorte que l'ouverture est suffisamment petite pour briser la colonie en plusieurs morceaux plus petits, en sorte que de multiples colonies se développer dans le nouveau puits. Ceci permet à la cueillette des sous-clones bien espacés pour une plaque de réplique d'avoir dans la culture, en laissant la plaque originale de colonies isolées de génotypage. Une partie difficile dans ce protocole est la traction manuelle des pipettes en verre; ce doit être pratiquée à l'avance. Il convient de noter qu'il existe de multiples techniques de cueillette clone qui ne nécessitent pas une pipette en verre. Les expérimentateurs sont encouragés à trouver celui qui fonctionne le mieux pour eux.

Il ya des limites à ce protocole qui peut être surmonté par de simples modifications. Une expérience destinée à oeuls perturber le locus d'intérêt sans réparation ou dont la réparation modèle ne contient pas de cassette de sélection, doivent utiliser une autre méthode d'enrichissement pour les cellules qui ont été éditées. A noter que le nombre de colonies qui doivent être sélectionnées pour trouver un clone positif augmente considérablement en l'absence de sélection. Une stratégie visant à améliorer le rendement consiste à co-transfecter un plasmide non-intégration qui exprime une protéine fluorescente. Après avoir laissé les cellules de récupérer pendant deux jours, les cellules ciblées peuvent être triées sur la fluorescence positive en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence et réétalées ^29. Ce procédé pour enrichir des cellules qui ont été transfectées avec les plasmides par électroporation et augmente la probabilité d'un événement de modification simultanée de la cellule de ce fait.

Les techniques décrites ici peuvent être étendues à utiliser plusieurs ARN guides pour cibler simultanément plusieurs ^14,46,47 loci. De nombreux protocoles ont été établis pour différencier hPSCsdans les types de cellules distinctes, ce qui permet diverses manipulations génétiques dans les types d'intérêt ³⁰ cellulaires. Dans l'ensemble, nous avons démontré le potentiel d'efficacité édition du génome dans hPSCs indépendamment du choix SSN. Nous proposons que cette technique peut être adaptée pour créer des lignées isogéniques HPSC qui ont été édités gène à tout locus génomique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F12	Life Technologies	11320082
Sérum fœtal bovin (HI)	Life Technologies	10082-147
Knockout Serum	Life Technologies	10828-028
Facteur de croissance des fibroblastes - basic	Life Technologies	PHG0261
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122
Glutamine	Life Technologies	25030-081
MEM NEAA	Life Technologies	11140-050
2-mercaptoéthanol	Life Technologies	21985-023
Y-27632	Calbiochem	688000
Plaques 6 puits	Corning	3506
Plaques 12 puits	Corning	3512
4 mm Cuvettes d’électroporation	Bio-rad	165-2081
Pulser de gène X-cel II	Bio-rad	165-2661
0,25 % Trypsine-EDTA	Life Technologies	25200-056
10× ; Saline tamponnée au phosphate (PBS) pH7,4  ;	Life Technologies	70011-044
Puromycin	Life Technologies	A11138-02
Pipettes Pasteur, bouchées	VWR	14672-412
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	S5941
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Proteinase-K	Life Technologies	AM2544
Éthanol	VWR	TX89125-172SFU
Alcool isopropylique	VWR	MK303216
TE Buffer	Life Technologies	12090-015
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
1,8 ml Cryotubes	ThermoScientific	377267