Un modèle microfluidique de Biomimetically respiration pulmonaire acineuse Airways

Résumé

La lithographie douce a été utilisée pour produire un modèle représentatif à l’échelle réelle des voies respiratoires alvéolées pulmonaires qui se dilatent et se contractent périodiquement, imitant le mouvement physiologique de la respiration. Cette plate-forme recrée les flux acineux respiratoires sur une puce et devrait faciliter l’étude expérimentale de la dynamique des aérosols inhalés et du dépôt dans l’acinus pulmonaire.

Résumé

Quantifier caractéristiques d'écoulement des voies respiratoires dans les profondeurs acineuses pulmonaires et leur influence sur le transport des aérosols inhalés est essentielle à l'optimisation des techniques drogues par inhalation, ainsi que la prédiction des modèles de dépôt des particules en suspension potentiellement toxiques dans les alvéoles pulmonaires. Ici, les techniques soft-lithographie sont utilisées pour fabriquer des structures des voies respiratoires complexes acineuses-like à la longueur des échelles anatomiques véridiques qui reproduisent les phénomènes d'écoulement acineuses physiologiques dans un système optique accessible. Le dispositif microfluidique dispose de 5 générations de bifurquant conduits alvéolaires avec expansion périodiquement et parois contractantes. l'actionnement de paroi est réalisée en modifiant la pression à l'intérieur des chambres remplies d'eau entourant les minces PDMS canal acineuses parois à la fois sur les côtés et le dessus de l'appareil. Contrairement aux dispositifs microfluidiques multicouches communes, où l'empilement de plusieurs PDMS moules est nécessaire, une méthode simple est présentée pour fabriquer la partie supérieurechambre en intégrant la section de canon d'une seringue dans le moule PDMS. Cette configuration microfluidique roman offre des mouvements de respiration physiologiques qui à leur tour donnent lieu à acineuses air-flux caractéristiques. Dans l'étude actuelle, micro particules d'image vélocimétrie (μPIV) avec des particules liquides en suspension a été utilisée pour quantifier tels flux d'air sur la base hydrodynamique similitude correspondant. Le bon accord entre les résultats μPIV et les phénomènes d'écoulement acineuses attendus suggèrent que la plate - forme microfluidique peut servir dans un proche avenir comme attrayant outil vitro pour étudier le transport des particules représentant directement dans l' air et le dépôt dans les régions acineuses des poumons.

Introduction

Une quantification détaillée de la dynamique des flux respiratoires dans la partie distale, les régions alvéolaires des poumons est primordiale dans la compréhension de flux d' air dans le mélange acinus pulmonaire et prédire le sort des aérosols inhalés dans le plus profond des voies respiratoires ^1-3. Ce dernier aspect est particulièrement préoccupant lorsque traiter d'une part les risques de particules de polluants inhalés ou inversement dans la recherche de nouvelles stratégies pour améliorer et ciblée délivrance de médicaments thérapeutiques inhalés à des sites localisés du poumon ^{4, 5,} ainsi que pour l' administration systémique.

À ce jour, les flux respiratoires dans les régions acineuses pulmonaires profondes ont été généralement étudiés in silico en utilisant la dynamique des fluides computationnelle (CFD) ou alternativement in vitro avec des modèles expérimentaux échelle-up suivants hydrodynamique similitude correspondant. Au cours des dernières décennies, les méthodes CFD ont été de plus en plus appliquée pour étudier les phénomènes d'écoulement acineuses, de single modèles alvéolaires ^{6, 7} et alvéolaires conduits ^8-12 au plus élaboré dans les modèles silico qui capturent anatomiquement réalistes structures d'arbres acineuses avec plusieurs générations de conduits alvéolaires et jusqu'à plusieurs centaines de alvéolaires individuels ^13-15.

Ensemble, les efforts numériques ont joué un rôle essentiel à faire la lumière sur le rôle et l'influence du mouvement de la paroi lors de la respiration des mouvements sur les motifs qui a suivi acineuses de flux d'air. En l'absence de mouvement respiratoire, statique alvéole fonction recirculation circule dans leurs cavités qui présentent aucun échange d'air entre le conduit acineuses et l'alvéole ^{6, 7} convective; en d'autres termes, les flux alvéolaires seraient entièrement isolés des flux dans les arbres acineuses et l'échange d'air se traduirait uniquement à partir des mécanismes de diffusion. Avec l'existence d'extensions cycliques du domaine alvéolaire, cependant, les topologies de flux alvéolaires sont considérablement modifiés et le resulting modèles d'écoulement à l' intérieur des alvéoles sont intimement liés à l'emplacement d'un alvéole le long de l'arbre acineuse (par ex., proximale par rapport à des générations distales).

En particulier, il a été émis l'hypothèse dans les simulations que les modèles de flux alvéolaires sont fortement influencés par le rapport alvéolaire canalaire des débits tels que les générations proximales de l'arbre acineuses pulmonaire, où ce ratio est relativement importante suivant la conservation de masse à travers une structure arborescente, fonction recirculation complexe circule à l'intérieur des cavités alvéolaires avec pathlines fluides irréversibles. Avec chaque génération acineuses plus profond, le rapport alvéolaire des débits canalaires diminue progressivement de sorte que les générations acineuses distales présentent des lignes de courant radiales comme qui rappellent inflations simples et dégonflage d'un ballon. Avec les progrès dans les modalités modernes d'imagerie, les données d'imagerie du poumon ^{16, 17} des rongeurs, y compris le rat et la souris, ont donné lieu à une partie de la première simul CFDations des flux acineuses anatomiquement reconstruits dans les alvéoles reconstruites. En dépit de ces progrès prometteurs, ces études récentes sont encore limitées pour traiter les phénomènes d'écoulement d'air dans des sacs alvéolaires terminaux seulement ^{18, 19} ou quelques alvéoles entourant un seul conduit ^20. En conséquence, les enquêtes sur les phénomènes d'écoulement respiratoires dans les acinus state-of-the-art restent dominées par des études portant sur ​​des géométries génériques anatomiquement inspirées de l'environnement acineuses ^2.

Du côté expérimental, diverses configurations comportant une voie aérienne avec un ou plusieurs alvéoles ont été développés au cours des années ^21-24. Pourtant, il existe pas de modèles expérimentaux de bifurquant voies respiratoires alvéolaires qui sont capables de mimer la respiration physiologique par dilatation et de contraction de façon respiratoire-like. Compte tenu de l'absence de plates-formes expérimentales attrayantes à portée de main, l'étude des phénomènes de transport acineuses reste limitée en ce qui concerne validating Etudes de calcul et critique, il reste un manque de données expérimentales disponibles. . Au cours des dernières années, Ma et al (2009) ont construit un modèle à parois rigides à échelle d'un acinus composé de trois générations acineuses; Cependant, le manque de mouvement de la paroi dans ce modèle limité sa capacité à capturer des modèles de flux alvéolaires réalistes dans des conditions de respiration.

D' autres expériences échelle-up , y compris un modèle de paroi mobile basée sur des données anatomiques de fonte réplique ont été récemment mis en place ^25; cependant, puisque le modèle ne capturé les deux dernières générations acineuses (ie., les sacs terminaux), il n'a pas réussi à capter les flux de recirculation complexes qui caractérisent les générations acineuses plus proximales. Ces derniers exemples d'expériences à échelle jusqu'à soulignent en outre les limitations en cours avec de telles approches. Plus précisément, aucune expérience existante a ainsi mis en évidence la transition loin émis l'hypothèse de remise en circulation des flux radiaux le long del'acinus et ainsi confirmer les prédictions numériques de topologies de flux hypothétiques d'exister dans de vrais arbres acineuses pulmonaires ^{7, 15.} Peut-être plus important encore , des expériences à échelle-up sont extrêmement limitées dans les enquêtes par inhalation des particules de transport et de dépôt dynamique ²⁶ en raison de difficultés à faire correspondre tous les non pertinents les paramètres de dimension (par ex., la diffusion des particules, un mécanisme de transport critique pour les particules submicroniques, est complètement négligé).

Avec des défis expérimentaux en cours, de nouvelles plates-formes expérimentales qui permettent des enquêtes sur des voies respiratoires des flux d'air et la dynamique des particules dans les murs mobiles complexes réseaux acineuses sont recherchés. Ici, anatomiquement inspiration dans le modèle acineuses vitro est introduit. Cette acineuses pulmonaire imite la plate - forme microfluidique coule directement à l'échelle du acineuses représentant, et élargit la gamme croissante de modèles microfluidiques pulmonaires ^27, y compris le liquide bronchique plug-flows ^28-30 et la barrière alvéolo-capillaire ^31.

A savoir, les caractéristiques de la conception actuelle de cinq générations alvéolée arbre des voies aériennes simplifiée cycliquement en expansion et les murs, où les mouvements cycliques sont atteints par la pression de contrôle à l'intérieur d'une chambre d'eau qui entoure les PDMS minces parois latérales et où la paroi supérieure est déformée par une eau supplémentaire contractante chambre assis directement au-dessus de la structure acineuse. A la différence des dispositifs microfluidiques multicouches communs, cette chambre est simplement formée en intégrant la section cylindrique d'une seringue à l'intérieur du dispositif de PDMS, et ne nécessite pas de préparation d'un moule PDMS supplémentaire.

L'approche présentée ici miniaturisé offre un moyen simple et polyvalent pour la reproduction de structures acineuses compliquées avec des parois mobiles par rapport aux modèles à échelle jusqu'à tout en capturant les caractéristiques sous-jacentes de l'environnement de flux de acineuses. Cette plate-forme peut être utilisée pour flow la visualisation en utilisant des particules de liquide en suspension à l'intérieur des voies respiratoires (voir résultats représentatifs ci-dessous). Dans un proche avenir, le modèle sera utilisé avec les particules en suspension pour l'étude de la dynamique des particules acineuses inhalés.

Protocole

Fabrication 1. Master

1. Utiliser une gravure ionique réactive profonde (DRIE) de silicium sur isolant (SOI) plaquette pour fabriquer une plaquette de silicium maître tel que décrit dans des travaux antérieurs ^{32, 33.}
   NOTE: DRIE est préférable à la norme SU-8 micro-usinage en raison des caractéristiques de rapport d'aspect élevé (40 um de large et 90 um tranchées profondes).

2. Castings et scellement du dispositif microfluidique

1. Mélanger PDMS et un agent de durcissement à un ratio de 10: 1 de poids à l'intérieur d'un petit récipient propre, comme un plat en plastique pesant.
2. Dégazer le mélange dans un dessicateur sous vide jusqu'à ce que toutes les bulles d'air sont éliminées.
   NOTE: Préparer suffisamment de PDMS pour toutes les étapes ultérieures. Ci-dessous, l'acronyme "PDMS" se réfère toujours aux dégazés 10: 1 PDMS: mélange de durcissement agent qui a été préparé dans les étapes 2.1 et 2.2.
3. Verser le mélange-dégazé à une hauteur d'environ 1 mm au-dessus du maître plaquette. Degas encore une fois pour au moins40 min pour éliminer toutes les bulles d'air au-dessus de la plaquette et de minimiser les bulles en dessous de la plaquette.
   REMARQUE: Assurez-vous que la plaquette est aussi proche que possible du fond de la plaque. Si nécessaire, appuyez sur la plaquette doucement vers le bas à l'aide de 2 bâtons d'agitation et dégazer encore une fois.
4. Cuire au four à 65 ° C pendant 20 min dans un four à convection naturelle.
   NOTE: Après 20 min, le PDMS est durci et presque complètement durci. Alors qu'un temps de cuisson plus long est possible de cuisson pendant 20 minutes, un gain de temps et améliore l'adhérence de la deuxième couche en PDMS (voir ci-dessous) à la première.
5. Déposer la section de canon d'une seringue de 2 ml en plastique en utilisant un papier de sable fin de grain pour améliorer l'adhérence à PDMS. En outre, utiliser le papier de verre pour aplatir la base du corps de la seringue en plaçant le papier abrasif sur une surface plane et en faisant glisser la base du cylindre de la seringue au-dessus de celui-ci. Nettoyer la seringue avec de l'air sous pression.
6. Placer la partie de corps de la seringue au-dessus de la première couche de PDMS avec large ouverture faisant face à la surface du PDMS, et verser une seconde couche de PDMS au-dessus du premier à une hauteur d'environ 5 mm et dégazer le PDMS à nouveau dans un dessicateur.
   NOTE: La deuxième couche de PDMS doit être versé dans le petit récipient autour du canon, et ne doit pas entrer à l'intérieur.
7. Cuire l'ensemble de la configuration à 65 ° C pendant au moins 2 heures dans un four à convection naturelle.
   NOTE: Il n'y a pas besoin de tenir le canon en place au cours des processus de durcissement puisque le poids des PDMS en appui contre la grande base du canon détient le canon fermement en place.
8. Couper à travers le moule PDMS autour de la région à motif de la tranche de maître à l'aide d'un scalpel. Pendant la coupe, le scalpel devrait faiblement toucher la surface de la plaquette. Ensuite, insérez délicatement un outil mince tel qu'une pince de plaquette dans l'encoche créée par le scalpel, et décoller les PDMS exprimés par le maître tranche.
9. Placez la distribution sur une surface molle recouverte d'une feuille d'aluminium avec le côté à motifsvers le haut (ie., le canon doit pendre du bord de la table), et percer un trou dans le PDMS à l'entrée d'entrée de la chambre et le canal en utilisant une biopsie poinçon 1 mm.
10. Enduire une lame de verre propre avec un (dégazé) 10: 1 PDMS: mélange de durcissement-agent à l'aide d'une tournette programmée à 3000 rpm pendant 30 secondes, et cuire pendant> 1 heure à 65 ° C. Ensuite, nettoyer la lame et PDMS coulé en utilisant du ruban adhésif transparent.
11. Traiter la surface du moule et PDMS enduit lame de verre PDMS avec plasma O ₂ (par exemple, en utilisant un dispositif de traitement corona à main) pendant 1 min, puis appuyez doucement sur ​​les surfaces ensemble et cuire au four à 65 ° C pendant la nuit (O / N) .

3. Remplissage de périphériques et Actuation

1. Mélanger des particules de polystyrène fluorescentes de l'eau en suspension avec de l'eau et de glycérol dans un flacon en verre pour obtenir un (v / v) mélange 64/36 glycérol / eau avec 0,25% (poids / poids) des particules ..
2. Placer une goutte de la solution de glycérol au-dessus de l'entrée du canal et une goutte de DI water sur l'entrée de la chambre, puis placez l'appareil dans un dessiccateur et vide pendant environ 5 min.
   NOTE: Avant de libérer l'attente de vide pour les bulles qui se forment dans les gouttes de solution de glycérol et de l'eau DI à la pop. Lors de la libération sous vide les liquides sont aspirés dans les vides à l'intérieur de l'appareil. Si l' air résiduel reste à l' intérieur des canaux, l' éliminer en appliquant une pression externe sur les fluides (par exemple., En utilisant une seringue) et permettant à l'air de diffuser dans les PDMS.
3. Injecter ~ 2 ml d'eau DI dans la chambre supérieure (c. -à- corps de la seringue, Fig. 2b) jusqu'à ce qu'il soit complètement rempli d'eau. Puis couvrir la chambre supérieure avec une pointe de seringue émoussée de calibre 19, couper la pointe d'un autre bout de la seringue de calibre 19 émoussée et insérez cette astuce à l'entrée de la chambre de côté. Connecter les deux embouts de seringue à une seringue de 1 ml par tube mince de Teflon et un connecteur en forme de T.
   REMARQUE: Assurez-vous que la seringue de 1 ml, tube en Téflon, connecteur en T et la chambre supérieure (2 ml seringue barrel) sont tous remplis avec de l'eau sans bulles. Ceci peut être obtenu en ouvrant les points de connexion, en poussant l'eau à travers les sections vides du tube et reconnecter les points de connexion.
4. Connectez la seringue de 1 ml à une pompe de seringue pré-programmé pour imiter par exemple un cycle calme respiration marémotrice (avec une période de T = 4 sec) construit des rampes linéaires, à savoir, de zéro à 1,8 ml / min à 1 sec, à partir de 1,8 ml / min à -1,8 ml / min à 2 sec et de -1,8 ml / min à zéro en 1 sec.

4. flux expériences de visualisation: Micro-particules vélocimétrie par image (μPIV)

1. Alors que le dispositif est actionné, obtenir une série de 9 - 12 à verrouillage de phase, des images à double trame du flux de particules ensemencées en utilisant un micro-particules d'image velocimetry système (μPIV) constitué par exemple d'une double exposition CCD de cadre multiple appareil photo (par exemple., 1600 × 1200 pixels pour atteindre une résolution suffisante), une double pulsée laser Nd-YAG (longueur d'onde: 532 nm, la production d'énergie 400 mJ, la durée de l'impulsion: 4 nsec), et un microscope inversé.
   REMARQUE: Un tel système est capable d'obtenir des paires de trames avec un décalage de temps de jusqu'à quelques microsecondes entre les première et seconde trames. Pour obtenir des images à double cadre à verrouillage de phase, il est utile d'acquérir une double série de trame à , par exemple., 10 Hz (paires de châssis sont séparés par 0.1 sec les uns des autres). Ensuite, les données peuvent être réorganisés de telle sorte que toutes les paires de châssis qui sont séparés par un temps de cycle complet (ici T = 4 sec) forment une nouvelle série chronologique. L' acquisition des images doit être répété plusieurs fois tout en modifiant le temps de latence entre les premier et second cadres de chaque paire de châssis (ie., 100 microsecondes à 0,1 sec) pour résoudre les différentes zones d'écoulement à l' intérieur de la cavité alvéolaire.
   Remarque: les configurations alternatives en ce qui concerne les meilleures combinaisons de systèmes d'acquisition d'image (. -À- dire, l' appareil photo) et éclairage sources (c. -à- lasers) à l' image telsmicroflux sont également disponibles ^{34, 35.}
2. Utiliser un algorithme de somme de corrélation pour calculer les vecteurs de vitesse des cartes à verrouillage de phase du champ d'écoulement résultant de la série d'images pour chaque décalage dans le temps utilisé. Répéter cette opération plusieurs fois avec des temps de latence variant entre les première et seconde trames dans chaque paire d'images pour résoudre les différentes zones d'écoulement à l'intérieur de la cavité alvéolaire. Ensuite, utilisez un programme d'analyse de données pour assembler les cartes de flux individuels dans une carte complète et de haute-détaillée des modèles d'écoulement en faisant la moyenne des points de données qui se chevauchent ^33.

Résultats

Conception assistée par ordinateur (CAO) et microscope images de la plate - forme in vitro en acineuses sont présentés sur la Fig. 1. Le modèle acineuses biomimétique dispose de cinq générations de ramification des canaux rectangulaires bordées de cavités cylindriques alvéolaires de type (Fig. 1). Ici, les générations de modèles sont numérotés de génération 1 (pour la génération la plus proximale) de génération 5 (pour la génération la plus distale). A noter que seule l'entrée ...

Discussion

Une caractéristique essentielle de la plate-forme acineuses microfluidique présentée ici est sa capacité à reproduire les mouvements de respiration physiologiquement réalistes qui donnent lieu à des profils et des vitesses d'écoulement physiologiques dans les conduits acineuses et dans les alvéoles. Etant donné que les canaux microfluidiques sont fabriqués avec un taux relativement faible d'aspect (ie., W _j / h ≈ 3,9, où w _j est la...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Polydiméthylsiloxane (PDMS) et agent de durcissement	Dow Corning	(240)4019862	Sylgard® ; 184 Kit d’élastomère de silicone
Plastipak Seringue de 2 ml	BD	300185
Norm-Ject Luer slip Seringue de 1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0
Poinçon de biopsie de 1 mm	Kai Medical	BP-10F
Laboratoire Corona Treater	Produits Electro-Technic	BD-20AC
PHD Ultra Pompe à seringue	Appareil de Harvard	703006
Particules fluorescentes rqueuses rouges teintées	Thermo-Scientific		Non catallogisé 0,86 & micro ; Des billes de
glycérine ont été utilisées, Glycérine, AR	Gadot	830131320
FlowMaster, MITAS, une vélocimétrie par image de microparticules (µ ; PIV)	LaVision	1108630