Développement d'un Backbone peptide cyclique Bibliothèque en tant que potentiel Antiparasitaires Therapeutics Utilisation irradiation micro-ondes

Summary

Une méthode simple et générale de synthèse de peptides cycliques par irradiation par micro-ondes est décrite. Cette procédure permet la synthèse de peptides cycliques de squelette avec une collection de conformations différentes tout en conservant les chaînes latérales et les fractions pharmacophoriques, et permet donc de dépister la conformation bioactive.

Abstract

Interactions protéine-protéine (IPP) sont intimement impliqués dans la plupart des processus biologiques et sont liées à de nombreuses maladies humaines. Par conséquent, il ya un effort important de cibler les IPP en recherche fondamentale et dans l'industrie pharmaceutique. Interfaces protéine-protéine sont généralement de grande taille, plat, et manquent souvent des poches, ce qui complique la découverte de petites molécules qui ciblent ces sites. Les approches de ciblage alternatifs utilisant des anticorps ont des limitations dues à la biodisponibilité orale pauvre, faible perméabilité cellulaire, et l'inefficacité de la production.

Utilisation de peptides pour cibler interfaces PPI présente plusieurs avantages. Les peptides ont flexibilité conformationnelle plus élevée, une sélectivité accrue, et sont généralement peu coûteux. Cependant, les peptides ont leurs propres limites, y compris une mauvaise stabilité et l'inefficacité de traverser les membranes cellulaires. Pour surmonter ces limitations, un peptide cyclisation peut être effectuée. Cyclisation a été démontré pour améliorer la sélectivité peptide, La stabilité métabolique et la biodisponibilité. Cependant, la prédiction de la conformation bioactive d'un peptide cyclique est pas trivial. Pour surmonter ce défi, une approche attrayante pour cribler une banque ciblée à l'écran dans lequel tous les peptides cycliques de squelette ont la même séquence primaire, mais diffèrent dans les paramètres qui influent sur leur conformation, tels que la taille et la position de l'anneau.

Nous décrivons un protocole détaillé pour la synthèse d'une bibliothèque de peptides cycliques backbone ciblant IPP de parasites spécifiques. En utilisant une approche de conception rationnelle, nous avons développé des peptides dérivés du récepteur L eishmania de protéines d'échafaudage C-kinase activée (manque). Nous émettons l'hypothèse que les séquences A défaut qui sont conservés dans parasites, mais pas dans l'homologue hôte de mammifère, peuvent représenter des sites d'interaction pour des protéines qui sont essentiels pour la viabilité des parasites. Les peptides cycliques ont été synthétisés par irradiation micro-ondes pour réduire les temps de réaction et d'augmenterEfficacité. Développer une bibliothèque de peptides cycliques backbone avec différentes tailles d'anneaux facilite un écran systématique de la conformation active plus biologique. Cette méthode fournit une manière générale, rapide et facile à synthétiser des peptides cycliques.

Introduction

Interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle central dans la plupart des processus biologiques, de transduction du signal intracellulaire à la mort cellulaire ^1. Par conséquent, en ciblant les IPP est d'une importance fondamentale à la recherche fondamentale et les applications thérapeutiques. IPP peuvent être réglés par des anticorps spécifiques et stables, mais les anticorps sont coûteux et difficiles à fabriquer et ont une faible biodisponibilité. Alternativement, les IPP peuvent être ciblées par de petites molécules. Les petites molécules sont plus faciles à synthétiser et à bon marché par rapport à des anticorps; cependant, ils sont relativemen....

Protocol

1. Matériel et réactifs Préparation

1. Préparation de l'équipement
   1. Effectuez toutes les étapes à l'intérieur d'une hotte en utilisant un équipement de protection adéquat.
   2. Synthétiser chimiquement les peptides sur support solide en utilisant un synthétiseur de peptides à micro-ondes avec un module supplémentaire de Discover équipé d'une sonde de température à fibre optique pour commander la fourniture de micro-ondes de puissance dans un récipient de réaction en Téflon (30 ml, avec une fritte de verre) ou dans un polypropylène à usage unique Cartouche (12 ml, avec une fritte grossier).
   3. Pour un mélange correct, connec....

Results

Nous décrivons ici le développement d'une petite bibliothèque ciblée de la colonne vertébrale des peptides cycliques qui ciblent spécifiquement les IPP vitaux du parasite Leishmania et agir en tant qu'agents antiparasitaires (pour avis sur les peptides qui ciblent les IPP comme agents antiparasitaires ^87). Grâce à la synthèse de nouveaux backbone peptides cycliques, pharmacophores sont conservées dans un échafaudage de taille extensible. La force de la bibliothèque focalisée proposé ici est la possib.......

Discussion

La synthèse d'une bibliothèque focalisée du squelette des peptides cycliques dérivés de la protéine LACK du parasite Leishmania utilisant un synthétiseur à micro-ondes est décrit entièrement automatisé. Une bibliothèque de peptides cycliques ciblée a été développé avec pharmacophores conservées et divers linkers. L'addition de divers agents de liaison tels que l'anhydride glutarique, l'anhydride succinique, l'acide adipique, l'acide pimélique, la lysine, l'ornithine, et d'autres .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RÉACTIFS
Support solide, Rink Amide AM résine ML	CBL	BR-1330	Chargement : 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH	Advanced Chemtech	FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Advanced Chemtech	FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FN2152
Fmoc-ASP(OBut)-OH	Advanced Chemtech	FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Advanced Chemtech	FE2237
Fmoc-Gly-OH	Advanced Chemtech	FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FH2316
Fmoc-Ile-OH	Advanced Chemtech	FI2326
Fmoc-Leu-OH	Advanced Chemtech	FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FK2390
Fmoc-Met-OH	Advanced Chemtech	FM2400
Fmoc-Phe-OH	Advanced Chemtech	FF2425
Fmoc-Pro-OH	Advanced Chemtech	FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH	Advanced Chemtech	FY2563
Fmoc-Val-OH	Advanced Chemtech	FV2575
1-Méthyl-2-pyrrolidinone (NMP)	Sigma	328634	Prudence Toxique/Hautement inflammable/Irritant.
N,N-Diméthylformamide (DMF)	Alfa Aesar	43465	Prudence Toxique. Utilisez du DMF de haute qualité pour éliminer les réactions secondaires telles que l’élimination du Fmoc à la suite des traces de diméthylamine de la décomposition du DMF.
Dichlorométhane (DCM)	Sigma	D65100	Attention
Dibromométhane nocif (DBM)	Sigma	D41868	Attention
Acide trifluoroacétique nocif (TFA)	Sigma	T62200	Attention Corrosif/
Toxique Acide trifluoroacétique (TFA)	Sigma	91707	Attention Corrosif/Toxique
Diéthyléther	Sigma	31690	Attention Hautement inflammable/Nocif
Triisopropylsilane (TIS)	Sigma	233781	Attention Eau irritante/inflammable
, Grade HPLC	Sigma	270733
Acétonitroile, grade HPLC (ACN)	Fisher Scientific	A998-4	Prudence Inflammable/Irritant/Nocif
N,N-Diisopropyléthylamine (DIEA)	Sigma	3440	Attention Corrosif/Hautement inflammable
Piperidine	Sigma	W290807	Prudence Toxique/Hautement inflammable
Pyridine	Sigma	270970	Attention Hautement inflammable/Nocif
Éthanol (EtOH)	Sigma	459844	Attention Hautement inflammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydraté (HOBt)	Sigma	157260	Attention Hautement inflammable/Irritant/Nocif
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N&prime ;,N&prime ; - hexafluorophosphate de tétraméthyluronium (HBTU)	Sigma	12804	Attention Irritant/Nocif
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP)	Advanced Chemtech	RC8602	Prudence Irritant
Ninhydrine	Sigma		454044Attention Nocif
Phénol	Sigma	P3653	Attention Corrosif/
Toxique Cyanure de potassium (KCN)	Sigma	11813	Attention Très toxique
Hydroxyde de potassium (KOH)	Sigma	221473	Attention Toxique
N,N' -Diisopropylcarbodiimide (DIC)	Sigma	38370	Attention Inflammable/ Toxique
4-Diméthylaminopyridine (DMAP)	Sigma	522805	Attention Toxique/Irritant
Anhydride glutarique	Sigma	G3806	Attention Inflammable/Irritant/Nocif
Anhydride succinique	Sigma	239690	Attention Irritant/Nocif
Acide adipique	Sigma	A26357	Attention Toxique/Irritant
Acide pimélique	Sigma	P45001	Attention Toxique/Irritant
Chloranil	Sigma	23290	Attention Toxique/Irritant
Acétaldéhyde	Sigma	402788	Attention Inflammable/ Toxique
ÉQUIPEMENT
Centrifugeuse	Beckman Coulter	Allegra 6R Lyophilisateur
	Labconco	freezone 4.5
Pompe à vide	Franklin Electric	modèle 1101101416 avec 3/4 CV	Alcatel pompe avec moteur Franklin  ;
Cartouche en polypropylène 12 ml	Séparation appliquée	2419
Bouchon pour cartouche en polypropylène de 12 ml	Séparation appliquée	8157
Cartouche en polypropylène 3 ml	Séparation appliquée	2413
Bouchon pour cartouche en polypropylène de 3 ml	Séparation appliquée	8054
Robinets d’arrêt PTFE	Séparation appliquée	2406
Tubes plats, 50 ml	VWR	21008-240
Collecteur d’extraction, 20 pos, 16 tubes de 100 mm	Waters	WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixeur	Fisher scientific	22363152
Nalgene HDPE à col étroit IP2 flacons, 125  ; ml	Fisher scientific	03-312-8
Erlenmeyer	Fisher Scientific	FB-501, 500 ml
Bloc chauffant	Thermolyne	1760 bain
Tubes jetables en verre borosilicaté à extrémité lisse	Fisher Scientific	14-961-25
Micropipettes et pointes Finnpipette	Thermo	20&ndash ; 200 et 100&ndash ; 1 000 &mu ;
Flacons HPLC - micro vl pp 400 & micro ; l PK100  ;   ;	VWR	69400-124
Flacon HPLC - Bouchon Snap-It bleu	VWR	66030-600
Colonne HPLC analytique	Peeke Scientific	U1-5C18Q-JJ	ultro 120 5 µ ; m C18Q, 4,6 mm ID 150 mm
Colonne HPLC Prep, XBridge  ;	Eaux	OBD C18 5 & micro ; m colonne	19 mm × ; 150 mm
Spectromètre de masse	Applied Biosystems	Voyager DE-RP  ;
Dessiccateur
cylindre
Système analytique RP-HPLC Shimadzu LC-20			équipé de : contrôleur de système CBM-20A, détecteur SPD-20A, four à colonne CTO-20A, 2 x unité de distribution de solvant LC-20AD, passeur d’échantillons SIL-20AC, dégazeur DGU-20A5 (Shimadzu, MD, USA).
Système préparatif RP-HPLC Shimadzu LC-20			équipé de : contrôleur de système CBM-20A, détecteur SPD-20A, four à colonne CTO-20A, 2 unités de distribution de solvant LC-6AD et collecteur de fractions FRC-10A (Shimadzu, MD, États-Unis).