Article de méthode

Suivi des cellules dans le poisson zèbre transgénique de la GFP-Utilisation du système photoconvertible PSmOrange

DOI :

10.3791/53604

⸱

5 février 2016

 ,  ,  , 
1Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, 2COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, 3Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

Dans cet article

Résumé

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Nous avons établi le système photoconvertible PSmOrange comme un outil puissant, simple et peu coûteux pour le suivi cellulaire in vivo dans les fonds transgéniques GFP. Ce protocole décrit son application dans le système modèle du poisson zèbre.

Résumé

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Le développement rapide d’embryons de poisson-zèbre transparents (Danio rerio) en combinaison avec des marquages fluorescents de cellules et de tissus permet de visualiser les processus de développement tels qu’ils se produisent chez l’animal vivant. Les cellules d’intérêt peuvent être marquées en utilisant un promoteur spécifique au tissu pour stimuler l’expression d’une protéine fluorescente (FP) pour la génération de lignées transgéniques. L’utilisation de protéines photoconvertibles fluorescentes à cette fin permet en outre de suivre avec précision des structures définies dans le domaine d’expression. L’éclairage de la protéine dans la région d’intérêt modifie son spectre d’émission et met en évidence une cellule ou un amas de cellules particulier, laissant les autres cellules transgéniques dans leur couleur d’origine. Une limitation majeure est l’absence de promoteurs connus pour un grand nombre de tissus chez le poisson zèbre. À l’inverse, les criblages de pièges à gènes et à amplificateurs ont généré d’énormes ressources transgéniques étiquetant discrètement toutes les structures embryonnaires, principalement avec de la GFP ou, dans une moindre mesure, des FP rouges ou jaunes. Une approche pour suivre des structures définies dans de tels milieux transgéniques serait d’introduire en outre une protéine photoconvertible ubiquitaire, qui pourrait être convertie dans la ou les cellules d’intérêt. Cependant, les protéines photoconvertibles disponibles impliquent un état d’émission vert et/ou moins fréquemment un état d’émissionrouge 1 et ne peuvent donc souvent pas être utilisées pour suivre les cellules dans le fond FP des lignées transgéniques existantes. Pour contourner ce problème, nous avons mis en place le système PSmOrange pour le poisson-zèbre2,3. Une simple micro-injection d’ARNm synthétique codant pour une forme nucléaire de cette protéine marque tous les noyaux cellulaires avec une fluorescence orange/rouge. Lors de la photoconversion ciblée de la protéine, elle bascule son spectre d’émission en rouge lointain. L’efficacité quantique et la stabilité de la protéine font de PSmOrange un excellent outil de suivi cellulaire pour le poisson-zèbre et peut-être d’autres espèces téléostéennes.

Introduction

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Les techniques d’imagerie en amélioration exponentielle permettent de suivre les processus de développement sur des périodes allant jusqu’à environ quatre jours consécutifs3. Chez le poisson-zèbre et de nombreux autres systèmes modèles animaux, des cellules, des tissus, des structures axonales ou vasculaires spécifiques sont marqués par des protéines fluorescentes vertes transgéniques ou parfois rouges ou jaunes pour faciliter la visualisation. Cependant, dans la plupart des lignées transgéniques, le transgène n’est pas spécifiquement exprimé dans les cellules d’intérêt, mais également dans des structures supplémentaires, ce qui entrave le suivi précis, par exemple, de cellules uniques ou de groupes de cellules.

Les protéines photoconvertibles fluorescentes sont bien adaptées au suivi cellulaire au cours du développement embryonnaire. Les conditions préalables à l’application de ces protéines sont une nature à longue durée de vie, une plage d’émission bien séparée lors de la conversion et une fluorescence brillante. Les protéines photoconvertibles disponibles comprennent celles qui changent de plage d’émission lors de la conversion, telles que Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 ou Dendra27 et d’autres qui ne sont fluorescentes que lorsqu’elles sont photoactivées (PAmCherry8, PAGFP9 ou PATagRFP10). Leurs applications pour suivre les cellules chez les animaux transgéniques FP existants sont toutefois limitées car elles impliquent souvent un état fluorescent vert ou ne remplissent pas tous les critères ci-dessus. Ce n’est que récemment que Subach et ses collègues ont signalé la protéine PSmOrange, qui change son émission de l’orange/rouge au rouge lointain lors de la photoconversion et a été appliquée avec succès dans des cellules en culture et des cellules cultivées injectées dans des souris2.

Pour étudier l’aptitude de la protéine au suivi cellulaire dans un embryon vivant, nous avons généré une construction d’expression pour la micro-injection de H2B-PSmOrange marqué par un noyau nucléaire dans des embryons de poisson-zèbre. Nous constatons que la protéine remplit toutes les conditions préalables pour un suivi cellulaire réussi dans les milieux transgéniques GFP pendant les 4 premiers jours (et peut-être plus) du développement embryonnaire du poisson-zèbre. Pendant ce temps, la plupart des événements de migration cellulaire se produisent chez les poissons, ce qui fait du système PSmOrange un excellent ajout à la boîte à outils du poisson-zèbre.

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Protocole

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1. H2B-PSmOrange ARNm de transcription in vitro et la purification de l'ARNm

  1. Linéariser le H2B-PSmOrange contenant pCS2 + plasmidique en utilisant l'enzyme de restriction Notl, selon les instructions du fabricant.
    Remarque: effectuer les étapes suivantes à l'aide de protections appropriées telles que des gants et une blouse de laboratoire pour éviter la contamination et de la dégradation de l'ARNm.
  2. Purifier l'ADN linéarisé en utilisant une PCR méthodes basées sur un kit de purification ou au phénol-chloroforme selon les protocoles du fabricant.
  3. En utilisant 1 ug d'ADN matrice linéarisé pour Sp6-transcription de l'ARNm selon les instructions du fabricant.
  4. Éliminer l'ADN en ajoutant 1,0 U RNase DNase I pendant 10-20 min à 37 ° C.
  5. Nettoyer l'ARNm en utilisant une ARN nettoyer Kit selon le protocole du fabricant.
  6. Pour augmenter la pureté et la concentration de l'ARNm, l'ARNm précipiter par addition de 6 ul d'acétate de sodium (3,0 M, pH 5,2) et 150 ul de 96% d'éthanol. Incuber le mixe solution à -20 ° C pendant au moins 30 minutes et jusqu'à 24 heures.
  7. Recueillir l'ARNm en faisant tourner la solution à 18,407 g pendant 45 min à 4 ° C. Jeter le liquide et le remettre en suspension dans 150 pi d'ARNm 70% d'éthanol. Mélanger et centrifuger la solution pendant 15 min à 4 ° C. Jeter le liquide, sécher le culot pendant 5 minutes sur de la glace et remettre l'ARNm dans 20 ultrapure pi RNase eau libre.
  8. Évaluer la concentration et la pureté de l'ARNm par la mesure photométrique d'un mélange 1: ARNm de dilution 100 (1 pi d'ARNm dans l'eau exempte de RNase ultrapure 99 pi).
  9. Pour le stockage à court terme, maintenir la solution d'ARNm à -20 ° C. Pour le stockage à long terme, maintenir l'ARNm à -80 ° C.

2. H2B-PSmOrange ARNm microinjection dans des embryons de poissons zèbres

  1. Mettre en place l'accouplement paires la nuit avant l'injection en utilisant tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) deux de poissons transgéniques (ou tout autre GFP poisson transgénique). Laissez le poisson séparés en plaçant une entretoiseentre eux pour contrôler le temps de l'accouplement.
  2. Retirer l'entretoise dans la matinée de l'injection et de laisser le compagnon de poisson pendant 20 min.
  3. Pendant le temps de l'accouplement, diluer le H2B-PSmOrange ARNm à la concentration finale de 130 pg / nl (en RNase eau libre) et le transfert 6 solution d'injection de pi dans un capillaire de micro-injection à l'aide d'une pointe de microloader. Vérifiez le volume d'injection avec une lame de verre calibré. Régler la pression d'injection pour injecter 2 Solution de ARNm nl (260 p).
  4. Ramasser les oeufs dans une boîte de Petri en plastique stérilisée contenant embryon 1x (E3) moyen.
  5. Transférer 20 à 30 embryons dans un plat d'injection à l'aide d'une pipette en plastique de pasteur.
  6. Injecter 2 nl ARNm contenant une solution dans la cellule ou juste en dessous de la cellule dans le jaune d'oeuf à l'étape 11 une cellule.
  7. Transfert d'embryons injectés dans une boîte de Pétri contenant du milieu 1x E3, supprimer les embryons se développent normalement non fécondés ou non et se développent entre eux à 28 ° C.
    Remarque: Protection contre la lumière of les embryons ne sont pas requis pendant toute l'expérience.
  8. Soulever les embryons de poisson zèbre dans un milieu de 1x E3 et ajouter 0,2 mM PTU (1-phényl-2 thio) après la gastrulation pour inhiber la pigmentation. Changer le milieu deux fois par jour afin de minimiser le risque de contaminations bactériennes.

3. embryon Embedding

  1. Sélectionnez la GFP (vert) et PSmOrange embryons (orange / rouge) co-exprimant l'aide d'un microscope binoculaire équipé d'une lampe à fluorescence et les filtres d'émission appropriés. Transférer les embryons positifs dans une boîte de Pétri stérile contenant le milieu 1x E3.
  2. Embryons Dechorionate sous un microscope stéréoscopique en utilisant une pince 12.
  3. Transfert d'un embryon dans un tube de 1,5 ml contenant 1,0 ml de pré-chauffé 1,0% agarose bas point de fusion (LMA) préparé dans de l'eau ultra-pure à l'aide d'une pipette coupe-pointe (P200). Remarque: Chauffer le LMA à 80 ° C et refroidir pendant 3-5 min à température ambiante avant de l'intégrer l'embryon.
  4. Transférer l'embryon dans 150 ul LMA dans unchambré lamelle et d'ajuster l'orientation de l'embryon, par exemple face dorsale vers le bas dans l'expérience décrite pour le laser microscope confocal à balayage A1R inversé + (ou tout autre microscope approprié), en utilisant un bout de plastique bien. Lorsque le LMA est polymérisé, remplir la chambre avec de l'eau de poisson contenant mM PTU 0,2 et 0,02% éthyl méthanesulfonate 3-aminobenzoate (Tricaine) pour l'anesthésie.
  5. Avant l'imagerie de l'échantillon, attendre 15 min pour déterminer l'effet de Tricaine. L'anesthésie empêche les mouvements de l'embryon, qui peuvent être contrôlés au moyen d'un stéréomicroscope équipé d'un éclairage en fond clair.
    Remarque: Les chambres peuvent être réutilisés à deux reprises.

4. PSmOrange Photoconversion

  1. Placer l'échantillon sous le microscope confocal et analyser les échantillons pour identifier la zone à l'aide de photoconvert 488 nm et 561 nm lasers pour imager la GFP et PSmOrange respectivement.
    Remarque: Utilisez le confocal à balayage laser microscope A1R + inversé sur la sta inversége TiEcontrolled par le logiciel d'imagerie de microscope et équipées 488 nm, 561 nm et 640 nm pour les lasers photoconversion et d'imagerie. Toutefois, l'application est certes pas limitée à cette microscope aussi longtemps que les rayons laser et l'imagerie de conversion sont disponibles.
    1. Mettez l'objectif de l'air 20X en place (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
    2. Utiliser les paramètres suivants au microscope pour détecter la protéine PSmOrange avant photoconversion: 561 nm laser, 0,74 mW mesurée au plan focal de l'objectif ci-dessus.
      Remarque: ce qui correspond à 40% par rapport à ce système (mesure dans le plan de mise au point est le seul moyen pour déterminer la puissance effective). Régler la puissance du laser en fonction des besoins expérimentaux que l'efficacité des injections H2B-PSmOrange peut varier.
    3. Ajouter facteurs de zoom pour mettre en évidence la zone d'intérêt. grossissements plus élevés réduisent le temps d'acquisition d'image et donc la phototoxicité.
  2. Acquérir un z-stack couvrant la structures d'intérêt en utilisant 488 nm et 561 nm lasers à mode séquentiel (mode ligne 1-> 4). Fixer le z-étape entre 1,0 et 2,0 um. moyenne de la ligne et de la fréquence de balayage peuvent être utilisés pour optimiser la qualité d'image.
  3. Balayez l'échantillon et sélectionnez la région d'intérêt (ROI) outil pour mettre en évidence la zone à photoconvert. Fixer le retour sur investissement que la zone de stimulation. Sélectionnez le module photo Activation / Blanchiment, activer le laser de 488 nm en cochant la case correspondante et réglez le laser de 488 nm à 80% (de la puissance du laser 1 mW mesurée à l'objectif). Réglez la vitesse de balayage à 0,5 sec / cadre.
  4. Ouvrez l'utilitaire de photoconversion (ND Stimulation) et spécifier les paramètres de photoconversion.
    1. Cliquez sur la commande "Ajouter" pour indiquer le protocole de photoconversion.
    2. Set "Phase" 1 dans le menu "Acquisition / Stimulation" à "Acquisition" et indiquer le nombre d'images à être acquis avant photoconversion dans le menu "Loops".
    3. Réglez "Phase" 2 à "Stimulation "et entrez le nombre d'événements de stimulation à effectuer.
    4. Ajuster "Phase" 3 comme décrit pour "Phase" 1. En option, insérer une attente "Phase" après "Phase" 2 en entrant le temps à attendre avant la dernière ronde de l'acquisition d'images.
    5. Une fois que tous les paramètres sont réglés, appliquer le réglage de la stimulation et exécuter le photoconversion.
      Remarque: Puissance du laser, la fréquence de balayage et le nombre d'itérations pour chaque tour de photoconversion peut varier et diffère de l'embryon à l'embryon. Un cadre pour commencer est indiqué dans le tableau 1.
  5. Acquérir un z-stack final en utilisant 488 nm, 561 nm et 640 nm lasers appliquant les paramètres comme ci-dessus. Régler le laser 640 nm pour visualiser l'PSmOrange convertie, en utilisant la puissance de laser élevée (jusqu'à 4,5 mW).

5. Démonter embryon de LMA

  1. Retirer l'embryon chambre contenant du microscope. Retirez délicatement l'embryon de l'u agarosechanter forceps.
  2. Transférer l'embryon dans un nouveau plastique stérilisé boîte de Pétri ou dans une 6 puits plaque stérilisée contenant 1x E3 et mM PTU 0,2. Incuber l'embryon à 28 ° C jusqu'à ce que le stade de développement souhaité.

6. Analyse du destin de Photoconverted PSmOrange protéines cellules exprimant

  1. Re-intégrer l'embryon comme indiqué aux points 3.3 et 3.4.
  2. Placer l'échantillon sous le microscope confocal et analyser l'échantillon pour identifier les cellules photoconverted (640 nm) dans la structure transgénique GFP d'intérêt (488 nm).
  3. Acquérir un z-stack couvrant les structures d'intérêt en utilisant 488 nm, 561 nm et 640 nm lasers à mode séquentiel (mode ligne 1-> 4). Fixer le z-étape entre 1,0 et 2,0 um. moyenne de la ligne et de la fréquence de balayage peuvent être utilisés pour optimiser la qualité d'image.
  4. Utilisez l'une des méthodes suivantes pour identifier les cellules qui GFP co-express et la protéine photoconverted.
    1. Du sur mesure automatique Fidji imageJ 3 Macro
      1. Convolve la pile d'origine en utilisant le plugin "GaussianBlur" (→ Processus → Filtres → GaussianBlur) et soustraire les piles lisses de l'original à l'aide du plug-in "de la calculatrice de l'image" (→ Processus → Calculatrice de l'image). Cette étape permet de visualiser les structures d'intérêt et de réduire le temps de calcul pour l'analyse.
      2. Appliquer des seuils spécifiques aux canaux vert et rouge lointain afin de mettre en évidence les cellules photoconverted (→ Photo → Ajuster → Seuil). Utilisez l'outil "analyser des particules" pour détecter les zones de seuil avec un réglage approprié (→ Analyser → analyser des particules).
      3. Ouvrez le "calculateur d'image" plugin et afficher les ROI de chevauchement dans le canal vert et rouge lointain en jaune (→ Processus → Calculatrice de l'image).
    2. logiciel d'imagerie Microscope pour l'évaluation des données 3D
      1. Afficher la pile3D en utilisant la vue option Afficher le volume (→ 3D Visualization Menu → Afficher Volume View). Utiliser l'interface graphique pour sélectionner les canaux vert, rouge et rouge lointain, régler la luminosité et le contraste et recadrer la pile 3D pour mettre en évidence la zone photoconverted (Figure 1).
        Remarque: Des méthodes similaires pour analyser les données sont disponibles dans la plupart des logiciel commun pour l'analyse d'images.

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Résultats

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La figure 1 illustre un exemple de système PSmOrange de photoconversion. Le complexe pinéale est une structure conservée dans la dorsale diencéphale vertébrés. Comme dans beaucoup d'autres vertébrés, le complexe se compose de la glande pinéale dans le centre du diencéphale et les cellules parapineal du côté gauche. Expériences uncaging élégantes mais chronophages montré que les cellules parapineal originaires de la partie antérieure de la glande pinéale 13. En...

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Discussion

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embryons transgéniques portant reporters fluorescents ont contribué fondamentalement à comprendre le développement embryonnaire. Cependant, il y a encore le besoin essentiel pour les promoteurs pour faciliter la visualisation précise des structures particulières. En leur absence, les chercheurs comptent sur des techniques telles que la photoconversion de protéines fluorescentes de se renseigner sur l'origine et le développement de leur structure d'intérêt. Cela est une condition préalable essentielle pour identi...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions O. Subach d’avoir fourni le plasmide H2B-PSmOrange original et notre équipe de pisciculture pour les soins aux poissons. Nous sommes reconnaissants au Nikon Imaging Center de l’Université de Heidelberg de nous avoir donné accès à des équipements de microscopie et à des logiciels d’analyse. Nous remercions le soutien de la plateforme d’imagerie de cellules vivantes de Mannheim au CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). Ce travail a été soutenu par l’Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), l’Université de Heidelberg à C.A.B. et la Faculté de médecine de Mannheim de l’Université de Heidelberg et la DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 et 298/6-1) à M.C.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de purification PCRQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcriptionAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Kit de nettoyageQiagen74204
Plastique Pasteuralpha laboratoriesLW4000
Original H2B-PSmOrange PlasmideAddgene31920Le plasmide décrit dans l’article est disponible dans le laboratoire Carl
Micro-injecteur FemtoJetEppendorf5247 000.013
Pince (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambré #1.5 Système de Coverglass Allemand  ;Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH AllemagneSans numéro
Nikon PLAN Apo &lambda ; Objectif pneumatique 20X  ;Nikon GmbH AllemagneAucun numéro
NIS elements AR Software (v. 4.30.02)Nikon GmbH Allemagne/Laboratory ImagingNo Number

Références

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Mots-clés

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