Bioprinting cellularisées Constructs Utilisation d'un spécifique de tissu Hydrogel Bioink

Summary

Nous décrivons un ensemble de protocoles qui fournissent ensemble un hydrogel bioink de tissus imitant avec lesquels des constructions fonctionnelles et viables 3-D tissus peuvent être bioprinted pour une utilisation dans des applications in vitro de dépistage.

Abstract

La bio-impression est apparue comme une approche de biofabrication polyvalente pour créer des constructions d’organes issus de l’ingénierie tissulaire. Ces constructions ont une utilisation potentielle en tant que remplacements d’organes pour l’implantation chez les patients, et aussi, lorsqu’elles sont créées à plus petite échelle, en tant que modèles « organoïdes » pouvant être utilisés dans des systèmes in vitro pour le dépistage de médicaments et de toxicologie.

Malgré le développement d’une grande variété de dispositifs de bio-impression, l’application de la technologie de bio-impression peut être limitée par la disponibilité de matériaux qui accélèrent les procédures de bio-impression et soutiennent la viabilité et la fonction des cellules en fournissant des indices spécifiques aux tissus. Nous décrivons ici un système d’hydrogel polyvalent à base d’acide hyaluronique (AH) et de gélatine composé d’un protocole de réticulation en 2 étapes, qui peut fournir des signaux biochimiques spécifiques aux tissus et imiter les propriétés mécaniques des tissus in vivo.

Les facteurs biochimiques sont fournis par l’incorporation de matériaux de matrice extracellulaire dérivés de tissus, qui comprennent de puissants facteurs de croissance. Les propriétés mécaniques tissulaires sont des combinaisons contrôlées de réticulants à base de PEG avec des poids moléculaires, des géométries (linéaires ou à plusieurs bras) et des groupes fonctionnels variables pour produire des bio-encres extrudables et des valeurs finales de rigidité au cisaillement de construction sur une large plage (100 Pa à 20 kPa). À l’aide de ces paramètres, des bio-encres d’hydrogel ont été utilisées pour bio-imprimer des sphéroïdes hépatiques primaires dans une bio-encre spécifique au foie afin de créer des constructions hépatiques in vitro avec une viabilité cellulaire élevée et une production fonctionnelle mesurable d’albumine et d’urée. Cette méthodologie fournit un cadre général qui peut être adapté pour la personnalisation future des hydrogels pour la biofabrication d’un large éventail de types de construction tissulaire.

Introduction

Au cours des dernières années, une variété de technologies sont devenues disponibles qui répond au besoin de sources alternatives d'organes et de tissus fonctionnels en cherchant à fabriquer, ou biofabricate, eux. Bioprinting a émergé comme l'un des plus prometteurs de ces technologies. Bioprinting peut être considéré comme une forme de robotique additif fabrication de pièces biologiques, qui peut être utilisé pour construire ou modèle viable structures d' organes similaires ou tissus comme en 3 dimensions. ¹ Dans la plupart des cas, bioprinting emploie 3 dimensions (3 -D) de dispositif d'impression qui est dirigée par un ordinateur pour déposer des cellules et des biomatériaux dans des positions précises, récapitulant ainsi anatomiquement imitant les architectures physiologiques. ² Ces dispositifs impriment un "bioink", qui peut prendre la forme d'agrégats de cellules, cellules encapsulées dans des hydrogels ou des fluides visqueux ou des microsupports de cellules ensemencées, ainsi que des polymères exempts de cellules qui fournissent une structure mécanique ou d'agir comme pla acellulaireceholders. ^3,4 Après le processus de bioprinting, la structure résultante peut être mûri dans des structures de tissus ou d' organes fonctionnels, et utilisés pour son application finale prévue. ^5,6 A ce jour, une application totalement fonctionnelle organe humain de taille complète n'a pas été imprimé, mais il reste le principal objectif à long terme de bioprinting recherche et développement. ² Toutefois, à petite échelle constructions de tissu "organoïdes" sont actuellement mises en œuvre dans un certain nombre d'applications, y compris la modélisation de la pathologie, le développement de médicaments, et le dépistage de la toxicologie.

L'un des principaux obstacles que les chercheurs ont rencontrées dans l'application de la technologie de bioprinting est que très peu de matériaux ont été développés dans le but explicite de bioprinting. Pour réussir efficacement à bioprinting, un biomatériau doit répondre à 4 exigences de base. Le biomatériau doit avoir 1) les propriétés mécaniques appropriées pour permettre le dépôt (que ce soit l'extrusion à travers une buse sous forme de gel ou d'un inkjet comme une gouttelette), 2) la capacité de tenir sa forme en tant que composante d'une structure 3-D après le dépôt, 3) la capacité de contrôle de l'utilisateur des 2 caractéristiques antérieures, et 4) une cellule environnement amical et solidaire du tout phases de la procédure de bioprinting. ⁷ Historiquement, bioprinting travail a souvent essayé d'employer biomatériaux traditionnelles existantes dans les dispositifs de bioprinting sans tenir compte de leur compatibilité, au lieu de concevoir un biomatériau pour avoir les propriétés nécessaires pour bioprinting et les applications post-impression ultérieures.

Une variété de bioinks ont été développés récemment pour améliorer l'interface avec le matériel de dépôt et la fabrication. systèmes d'hydrogel standard posent des problèmes importants car ils existent généralement soit comme précurseur des solutions fluides avec des propriétés mécaniques insuffisantes, ou hydrogels polymérisés que si imprimés peuvent obstruer les buses ou deviennent rompu sur le processus d'extrusion. Notre équipe, ainsi que others, ont exploré diverses formulations d' hydrogel pour résoudre ces problèmes bioprinting, y compris l' impression sphéroïde cellulaire dans des substrats d'hydrogel, ^5,8 cellulaire et hydrogel filament extrusion de tubes microcapillaires, ^9-11 extrudables acide hyaluronique (HA) -Gold hydrogels de nanoparticules ayant des propriétés dynamiques de réticulation , ¹² contrôle temporel de la rigidité d'hydrogel en utilisant photopolymérisable méthacrylatée HA et de la gélatine, ¹³ réticulation à base de fibrinogène-thrombine, ^14,15 échange ionique gels d'alginate-collagène, ¹⁶ et récemment polymérisation rapide de la lumière ultraviolette (UV) réticulation -initiated, ¹⁷

Ces exemples démontrent la faisabilité des matériaux générant qui peuvent par bioprinted efficacement. Cependant, en plus de l'intégration avec le matériel, afin de générer avec succès des constructions viables et fonctionnelles des tissus en 3-D, les biomatériaux doivent contenir les indices biochimiques et mécaniques qui aident à maintenir cellulairela viabilité et la fonction. Ces facteurs supplémentaires, profils biochimiques et mécaniques, peuvent avoir une influence significative sur la fonction réussie des constructions de tissu bioprinted.

Les deux cellules et la matrice extracellulaire native (ECM) sont chargés de présenter une large gamme de molécules de signalisation telles que des facteurs de croissance et d'autres cytokines à d'autres cellules. La combinaison de ces signaux varie d' un tissu à l'autre , mais il peut être extrêmement puissant et influent dans la régulation du comportement cellulaire et tissulaire. ¹⁸ En utilisant des composants ECM spécifiques de tissus provenant de différents organes et la mise en oeuvre comme un hydrogel ou dans le cadre d'un hydrogel a été explorée avec succès. ^19-21 Cette approche, qui est constituée d'un tissu donné décellularisation, la pulvérisation, et le dissoudre, peut être utilisé pour produire des signaux biochimiques spécifiques aux tissus de tous les tissus et peuvent être incorporés dans les trois dimensions des constructions d'hydrogel. ²²

De plus,il est largement documenté que les tissus dans le corps occupent une large gamme de raideurs. ²³ Par conséquent, la possibilité de régler les propriétés mécaniques des biomatériaux, tels que le module d' élasticité E 'ou module élastique de cisaillement G' est un outil utile dans l' ingénierie tissulaire . Comme décrit ci-dessus, le contrôle des propriétés mécaniques bioink permet biofabrication à base extrusion utilisant un gel mou, qui peut alors en outre manipulé par réticulation secondaire à un stade ultérieur, à quels niveaux de module élastique peuvent être atteints qui correspondent à celle du type d'organe cible. Par exemple, les biomatériaux peuvent être personnalisés pour correspondre à une rigidité de 5-10 kPa comme un foie natif, ²³ ou correspondre à une rigidité de 10-15 kPa comme tissu cardiaque native, ^24,25 en théorie augmenter la capacité de ces organites à fonctionner d'une manière similaire à celle de leurs homologues natifs de tissus. L'influence de la rigidité de l'environnement sur le phénotype cellulaire a été explored au cours des dernières années, en particulier en ce qui concerne les cellules souches. Engler et al. , Ont démontré que le substrat élasticité assistée dans la conduite des cellules souches mésenchymateuses (MSC) vers lignages avec l' élasticité des tissus correspondant à celle du substrat. ²⁵ Ce concept a été étudiée plus à la différenciation en muscle, la fonction cardiaque, phénotype hépatique, souche hématopoïétique prolifération cellulaire et le maintien du potentiel thérapeutique des cellules souches. ^24,26-29 Etre capable de régler un hydrogel à différents modules d' élasticité est une caractéristique importante d'un biomatériau qui sera utilisé pour biofabricate constructions de tissu. ³⁰

Nous décrivons ici un protocole qui représente une approche polyvalente utilisée dans notre laboratoire pour formuler un système d'hydrogel qui peut être extrusion bioprinted et adapté à 1) contiennent le profil biochimique d'un type de tissu particulier et 2) mimer le module d'élasticité de ce type tissulaire . En répondant à ces exigences, nous visons à pournir un matériau qui peut récapituler les caractéristiques physico - chimiques et biologiques in vivo des tissus. ³¹ Le système composite d'hydrogel modulaire décrit ici tire profit d'une approche multi-réticulation pour donner bioinks extrudables et permet une réticulation secondaire pour stabiliser et augmente la rigidité de la les produits finis pour correspondre à une variété de types de tissus. personnalisation Biochemical est remplie en utilisant des composants ECM spécifiques de tissus. En guise de démonstration, nous employons une variété de ce système d'hydrogel spécifique du foie à BioPrint foie fonctionnelle des constructions organoïdes. Le protocole décrit utilise un dispositif de bioprinting 3-D personnalisé. En général, ce protocole peut être adapté à la plupart des imprimantes à base extrusion, les paramètres d'impression spécifiques varient considérablement pour chaque type d'appareil et nécessitent des tests par l'utilisateur.

Protocol

1. hydrogels Bioink Formulations et préparation

1. Afin de fournir des profils biochimiques spécifiques aux tissus, la préparation spécifique d' un tissu d'ECM des solutions de digestion comme décrit précédemment pour le foie. ²⁰
   Remarque: En général, cette digestion ECM comprendra 40% du volume de bioink d'hydrogel final qui est utilisé. Plusieurs centaines de millilitres de solution ECM digest peuvent être préparés, aliquotés et congelés à -80 ° C pour une utilisation future.
2. Avant l'hydrogel formulation, on dissout un photo-initiateur, la 2-hydroxy-4 '- (2-hydroxyéthoxy) -2-méthylpropiophénone, dans l'eau à 0,1% p / v.
   Note: Les volumes de la gamme 50-100 ml peuvent être préparés à l'avance et stocké à l'abri de la lumière à 4 ° C pendant plusieurs mois.
3. Pour former bioinks hydrogel, d'abord dissoudre les composants matériels de base de l'acide hyaluronique (HA) kits d'hydrogel dans la solution eau-photoinitiateur.
   1. Dissoudre la gélatine thiolé HA et thiolée séparément dans de l'eau-psolution hotoinitiator (étape 1.2) pour faire 2% p / v solutions.
   2. Dissoudre le diacrylate de polyethylene glycol (PEGDA), l'agent de réticulation dans les kits d'hydrogel dans une solution d'eau-photoamorceur (étape 1.2) pour fabriquer une solution à 8% p / v.
   3. Dissoudre le polyéthylène glycol (PEG) alcyne 8-Bras (10 kDa MW) dans une solution d'eau photoinitiateur (étape 1.2) pour faire une solution à 8% p / v.
4. En général, former des hydrogels en utilisant le schéma suivant, bien que la personnalisation supplémentaire est possible.
   1. Combinez 4 parties 2% thiolé HA, 4 parties de 2% gélatine thiolé, 1 partie réticulant 1, 1 partie réticulant 2 avec 8 parties de solution d'ECM de tissus et 2 parties milieux de culture des hépatocytes (HCM) (ou 10 parties d'eau en tant que non-tissu générique un hydrogel spécifique de).
      Note: HA supplémentaires non modifié ou de la gélatine peuvent être ajoutés pour rendre le extruder de bioink plus en douceur. Ceci est décrit ci-dessous.
5. Vortex le mélange obtenu sur la haute (vitesse 10 sur 10) pendant 10 secondes pour mélanger avant utilisation.
6. Utilisation d'un hydrogel bioink
   1. Pour l'extrusion ou les essais de bioprinting, transférer le mélange dans une cartouche de seringue ou de l'imprimante et laissez-le réticule spontanément pendant 30 min (étape 1 réticulation) à 37 ° C.
   2. Pour les mesures rhéologiques, et transférer le mélange dans une boîte de Petri de 35 mm et lui permettre de se réticuler pendant 30 minutes.
      Remarque: Le mélange commence immédiatement à se réticuler par formation d'une liaison thiol-acrylate et commencera à augmenter la viscosité. Le mélange doit être transféré dans une seringue, une cartouche d'impression, ou d'un emplacement cible à l'intérieur de 10 minutes pour éviter le colmatage d'une pipette ou d'une seringue pendant le transfert.
   3. Lors de la réticulation secondaire (stade 2) est souhaitée, irradier le stade 1 de gels réticulés avec de la lumière ultraviolette (365 nm, 18 W / cm ²⁾ pour initier une réaction de polymérisation de thiol-alcyne.
      Remarque: La durée de l'irradiation dépend de la surface spécifique du matériau. En général, un centimètre carré de matériau ne nécessite que 1-2 secondes d'exposition aux UV à cette puissance UV.

2. Compatibilité imprimante Test

1. Avant les essais d'intégration avec des dispositifs de bioprinting, les caractéristiques d'extrusion d'essai sur le banc de laboratoire avec des tests d'extrusion simples en utilisant des seringues standard et petites pointes d'aiguille de calibre 20-30 (écartement).
   1. Poussez le bioink à travers une seringue standard pour obtenir des filaments extrudés en douceur d'hydrogel avec peu ou pas de bosses. Extrusion de lignes ou de motifs simples est suffisante pour déterminer le succès.
2. Pour l'intégration de bioprinter, charger bioink préparations en les pipetage dans des cartouches d'imprimante, et permettre à 30 min pour le bioink à subir spontanée étape 1 réticulation dans la cartouche.
   Note: Le volume de bioink dépend de l'application spécifique et doit être déterminée par l'utilisateur. Les cartouches d'imprimante peuvent ressembler ou être des seringues qui sont compatibles avec le dispositif de bioprinter.
3. Évaluer la compatibilité d'extrusionpour bioprinting en imprimant un motif simple en utilisant le bioink. Par exemple, imprimer un motif 7 x 7 mm composé de lignes parallèles. Appliquer une pression (par exemple 20 kPa , pression pneumatique) , tandis que la tête d' impression se déplace dans le plan XY à une vitesse approximative de 300 mm / min.
   Remarque: Les diamètres des buses des têtes d'impression de différentes tailles peuvent être utilisées, mais avec des ouvertures coniques, des buses d'un diamètre de 400 à 500 um sont optimales pour l'impression sphéroïdes dans la plage allant de 250 à 350 pm.
   1. Si les matériaux extrudés sont bosselés ou irrégulière, voir l'étape 2.4, ou de réduire la quantité de PEGDA pour ramollir le matériau réticulé étape 1. formulations bioink adéquatement préparées extruder en douceur, ce qui permet un dépôt précis dans des modèles ou des architectures souhaitées.
      Note: Les procédures de bioprinting utilisation décrit un dispositif de bioprinting 3-D conçu sur mesure en interne spécifiquement pour les tissus construire l' impression ³² En tant que tels, les paramètres d'impression spécifiques varient considérablement pour chaque type d'appareil et nécessitent testin.g par l'utilisateur.
4. Pour améliorer les propriétés d'extrusion, de compléter et de la gélatine non modifiée HA aux bioinks (1,5 mg / ml et 30 mg / ml, respectivement).

3. Validation par Bioprinting avec primaire du foie Constructs

1. Préparer 3-D sphéroïdes de foie de cellules primaires par pendaison méthodes de dépôt en tant que composant cellulaire ³³
   Remarque: Bioprinting peut être effectuée sans sphéroïdes, mais au contraire avec les cellules individuelles en suspension dans l'hydrogel bioinks aussi bien. Spheroids sont employés ici pour accélérer les interactions cellule-cellule et construire fonctionnalité. Le nombre de sphéroïdes ou des cellules utilisées dépend de l'application spécifique et doit être déterminée par l'utilisateur. Ces étapes doivent être effectuées dans des conditions stériles, en utilisant des fournitures stériles.
   1. Préparer HCM en ajoutant le contenu décongelés du kit de composants de complément HCM aux médias hépatocytes basale (HBM) et le filtrage stérile.
      1. Décongeler les composantes de suppléments nontil liquide.
      2. Ajouter les composants du complément (acide ascorbique, 0,5 ml, sérum-albumine bovine [acide gras libre], 10 ml, gentamicine sulfate / amphotéricine B, 0,5 ml, hydrocortisone 21-hémisuccinate, 0,5 ml, insuline, 0,5 ml, facteur de croissance épidermique humain recombinant , 0,5 ml, transférer 0,5 ml) à 500 ml HBM.
      3. Filtre stérile à travers un filtre de 0,45 um um ou 0,22 en utilisant une unité de filtration sur flacon ou un filtre à embout de la seringue.
   2. Déterminer la densité de cellules d'hépatocytes primaires humains, les cellules de Kupffer et les cellules étoilées par comptage sur un hémocytomètre après chaque type cellulaire a été décongelée selon les instructions du fabricant.
   3. Combiner les hépatocytes primaires humains, les cellules de Kupffer et les cellules étoilées dans un rapport 80:10:10 par le nombre de cellules dans un milieu HCM qui a été chauffé à 37 ° C dans un tube conique.
      Remarque: Le volume des médias à utiliser dépend du nombre total de cellules spécifiques à l'application et devrait être déterminé par ee utilisateur.
   4. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 520 xg à 20 ° C.
   5. Aspirer le surnageant, en laissant le culot cellulaire.
   6. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu HCM pour obtenir une suspension de cellules contenant 1.000 cellules par 40 ul support. Le volume total est fonction du nombre de sphéroïdes sont produites.
   7. Transférer la suspension cellulaire à des plaques de chute format de suspension à 96 puits. Ajouter un total d'environ 1000 cellules à chaque puits dans HCM et maintenir à 37 ° C, dans 5% de CO ₂ pendant 3 jours au cours de laquelle sphéroïdes multicellulaires forment.
   8. Collecter sphéroïdes de foie de la plaque de goutte suspendue à l'aide d'une pipette. Transférer dans un tube de 15 ml conique stérile.
2. sphéroïdes hépatiques Bioprint dans spécifique du foie hydrogel bioink
   1. Préparer une formulation contenant du foie ECM hydrogel bioink comme décrit dans l'étape 1, en utilisant 8% et 8% PEGDA 8-bras PEG alcyne comme réticulants. Utilisez cette combinaison pour sa capacité à resulting dans un hydrogel à proximité du module d'élasticité de cisaillement dans les tissus du foie natif.
   2. Laissez les sphéroïdes se déposent au fond du tube conique dans laquelle ils ont été placés à l'étape 3.1.7. Cela varie en fonction de la taille et de la densité sphéroïde, mais se produit généralement dans les 1-2 min. Retirez tous les médias par soigneusement aspiration ou avec une pipette.
   3. Transférer le volume désiré de solution fraîchement préparée hydrogel bioink dans le tube conique contenant les sphéroïdes. En général, un volume approprié est de 10% à 25% supérieur au volume de la construction en 3-D à imprimer. Pipetter prudemment haut et bas pour remettre en suspension les sphéroïdes dans la solution hydrogel bioink. Transférer une cartouche de bioprinter à l'aide d'une pipette ou d'une pipette sérologique.
   4. A l'intérieur de la cartouche de bioprinter, laisser la solution à subir la première phase de réticulation (réaction de l'acrylate de thiol) pendant 30 min.
      Remarque: En fonction de la taille sphéroïde, la cartouche peut avoir besoin d'être lentement tourné ou peut-être besoin d'être mélangé avec le contenuune spatule stérile pour maintenir les sphéroïdes distribuées dans toute la bioink au cours de l'étape 1 réticulation. Ceci est moins d'une nécessité pour bioinks préparés avec des cellules en suspension au lieu de sphéroïdes.
      Note: Suite à l'étape 1 réticulation, les utilisateurs ont une fenêtre d'exploitation de plusieurs heures. Toutefois, il est recommandé d'effectuer rapidement le processus de bioprinting pour améliorer la viabilité des cellules.
   5. Après l'étape 1 réticulation, utiliser un dispositif de bioprinting pour créer des structures d'hydrogel souhaitées contenant les sphéroïdes hépatiques primaires (ou d'autres cellules).
      Remarque: Cette technologie fournit un système pour biofabricating une grande variété de structures. Des paramètres tels que volume total, le nombre de cellules ou sphéroïdes, la géométrie de la structure imprimée, et le substrat sur lequel sont imprimés des constructions sont fortement tributaires des objectifs de l'utilisateur.
   6. Après le dépôt dans la configuration désirée, à administrer une lumière UV pendant 2-4 secondes pour amorcer le mécanisme de réticulation secondaire, la stabilisation de la constructs et en augmentant la rigidité au niveau souhaité.
      Remarque: la concentration de PEG-alcyne, et donc la densité totale de réticulation finale, contrôle essentiellement la rigidité de la construction finale.
   7. Répétez les étapes 3.2.4 et 3.2.5 afin de créer des constructions multi-couches.

Results

Lorsque les procédures décrites ci - dessus sont suivies correctement, les hydrogels doivent contenir un profil biochimique spécifique au type de tissu cible, ²⁰ permettent un degré élevé de contrôle sur bioprinting et module d' élasticité finale, ³⁴ et soutenir des cellules fonctionnelles viables dans des constructions de tissus.

Hydrogel Personnalisation
Pour mieux foie natif mimique, l'bioink d'hydrogel a été complétée par des solutions d'ECM de foie et d' une matrice de facteur de croissance, ²⁰ solutions ECM contiennent une grande variété de facteurs croissance et de cytokines (indiquées en pg / ml, la figure 1A). Ceux-ci comprennent brain-derived neurotrophic factor (BDNF), le bFGF, une protéine morphogénétique osseuse 5 (BMP-5), le FGF-4, la protéine de liaison du facteur insulinique de croissance analogue à 2 (IGFBP-2), TGF-b1, BMP-7, EGF L'hormone de croissance (GH), le FGF-7, EGF liant l'héparine-like growth factor (HB-EGF), le HGF et neurotrophin 3 (NT-3). En outre, les solutions ECM contiennent des éléments de structure supplémentaires, qui sont analysées par des analyses colorimétriques. ²⁰ Pour les solutions ECM du foie, la teneur totale en collagène de solutions ECM du foie était de 91,33 ± 0,58 mg / ml, la teneur en élastine était 189,33 ± 48,40 mg / ml, et glycosaminoglycanes (GAG) contenu était 86,00 ± 53,45 mg / ml (Figure 1B).

Hydrogel bioink propriétés mécaniques peuvent être caractérisées par un test cisaillement de balayage (0,6 à 10 Pa, la fréquence d'oscillation de 1 Hz) sur le rhéomètre. ^10,12,13,34 En permettant l' étape 1 thiol-acrylate chimie spontanée se produise à un pH neutre, un hydrogel mou avec un G 'de 113,66 ± 22,59 Pa est formé. Après l' initiation de la phase 2 thiol-alcyne réticulation par photopolymérisation UV, G 'augmente à environ 10 kPa (10.637 ± 113.83 Pa, Figure 1C), imitant le foie élasticité des tissus. Manipulation supplémentaire des concentrations, des poids moléculaires, et des géométries de réticulants peut atteindre une large gamme de valeurs de stade 2 G ^'34.

Qualité d'hydrogel bioprinted
Stratégie chimique et la mise en œuvre de la phase 1 et la phase 2 réticulation des bioinks d'hydrogel est décrit dans la figure 2. En général, des agents de réticulation tels que Extralink, qui sont basés sur des polymères de PEG acrylés, réagissent spontanément avec des groupes thiol sur l'HA et les chaînes de gélatine à neutre pH (étape 1) en présence de cellules pour former un hydrogel mou extrudable. Cet hydrogel mou peut être bioprinted comme bioink, après quoi la lumière UV est utilisée pour initier la photopolymérisation de thiols ayant pas réagi et les agents de réticulation secondaire à base de polymères modifiés par alcyne PEG. Les poids moléculaires particuliers et géométries des réticulants vontvern la rigidité finale de la construction bioprinted. Un motif mm 7 x 7 a été mis en œuvre à des fins de test (figure 3A). Des essais initiaux ont montré que les formulations initiales étaient extrudable, mais semblaient irrégulière agglomérée et pendant et après l' extrusion (figure 3B). Pour améliorer les propriétés d'extrusion, non modifié et de la gélatine HA a été complété à l'bioinks (1,5 mg / ml et 30 mg / ml). L'amélioration de la structure lisse imprimée est montrée sur la figure 3C.

Viabilité et fonction de base des constructions bioprinted hépatiques humains primaires
En utilisant la 3-D bioprinter l'hydrogel bioactif bioink spécifique du foie a été utilisé pour encapsuler et déposer sphéroïdes hépatiques humains primaires, préalablement préparées en suspendant les cultures de gouttes, sur des lamelles en plastique. Etre imprimé sur des lamelles en plastique autorisées pour la manipulation et le transfert robuste pour une variété d'environnements de culture cellulaire. Après bioprinting, salutla viabilité des cellules gh dans les constructions du foie a été observée après DIRECT DEAD la viabilité / cytotoxicité coloration et / microscopie confocale (figure 4A). Dans des conditions environnementales optimales viabilité doit être supérieure à 85%. hépatocytes humains primaires sont généralement considérés comme sensibles aux contraintes mécaniques et chimiques, ce qui nécessitait une certaine optimisation des variables environnementales.

À la suite bioprinting et la vérification de la viabilité, des constructions de foie supplémentaires qui sont placées en culture peuvent être évaluées pour la fonctionnalité par l'analyse des aliquotes de médias enlevés au jour 3, jour 7, jour 10 et jour 14 pour l'analyse de l'urée et de l'albumine sécrétée. L'urée colorimétrique des tests révèlent un niveau relativement constant de la sécrétion de l' urée à partir des constructions du foie au cours du temps de 14 jours, restant entre 15 et 20 ng / ml (figure 4B). taux d'urée détectées ne sont pas significativement différents les uns des autres à différents tempspoints. Le test ELISA humain Albumine révèle que la production d' albumine à partir des constructions reste également relativement constante au fil du temps, reste stable entre 125 et 140 ng / ml (Figure 4C). En outre, lorsqu'elles sont colorées pour les marqueurs indicatifs de tissu hépatique, l'expression positive de l'albumine intracellulaire, CYP3A4 (par une isoforme de cytochrome P450 impliquées dans le métabolisme), E-cadhérine (une protéine d'adhésion cellule-cellule épithéliale) et la dipeptidylpeptidase-4 (une protéine exprimée hautement dans le foie) sont observées (Figure 4D-F). Pris ensemble, cette viabilité et des données fonctionnelles suggèrent que les aides à l'hydrogel bioink spécifiques aux tissus dans le maintien de la viabilité et la fonction des constructions hépatiques primaires bioprinted à base de cellules.

Figure 1. Hydrogel de caractérisation des composants et l' évaluation de la rigidité. A) Facteur de Croissance etl' analyse des cytokines par protéomique des tableaux pour des solutions ECM préparées à partir de foie. B) Colorimétrie dosage quantification du collagène, des glycosaminoglycanes, et le contenu d' élastine dans les solutions ECM de foie. C) Démonstration de la capacité de contrôler la rigidité bioink. Après l'étape 1 réticulation, le gel est relativement souple et apte à être extrudé en douceur. Après l'étape 2 réticulation par la lumière UV, module d'élasticité augmente de plus d'un ordre de grandeur, imitant les tissus du foie module d'élasticité. Les barres d'erreur indiquent l' écart type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Employant plusieurs agents de réticulation à base de PEG pour l' extrusion bioprinting et de contrôle sur les tissus construire des propriétés mécaniques. STRATEGIE de la formulation de bioinks imprimables comprenant des agents de réticulation à base d'acrylate (réticulantes 1), des agents de réticulation à base alcyne (agent de réticulation 2) thiolée HA, la gélatine thiolé, les matériaux ECM de tissu, et non modifiée de HA et de la gélatine. La formulation est préparée et bioink réticule spontanément par l'acrylate de thiol de liaison, résultant en un matériau extrudable doux. Bioprinting est effectuée. Enfin, les couches sont fusionnées bioprinted, stabilisées, et amenées au module d'élasticité du foie. Ce processus peut être répété pour générer des structures multicouches. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Test de Bioprinting de bioinks. A) Un motif d' enroulement mm 7 x 7 a été utilisé pour l' essai d'extrusion de bioinking dans le bioprinter. B) La formulation initiale d'un PEGDA et 8-bras PEG bioink alcyne a entraîné le dépôt irrégulier. C) Ajout brut HA et de la gélatine améliorée extrusion, résultant dans l' extrusion lisse du bioink. Barre d' échelle -. 1 mm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Démonstration de la viabilité et de la fonction de sphéroïdes du foie bioprinted dans l'hydrogel bioink spécifiques du foie. A) Mise en œuvre du bioink du foie pour bioprinting, a donné lieu à des constructions de haute viabilité. Vert - calcéine AM-tachée cellules viables; Rouge - éthidium homodimère tachés cellules mortes B) Urée et C) l' albumine sécrétée par des constructions de foie de plus de 14 d.ays dans la culture, quantifiés par des tests colorimétriques et ELISA, respectivement. Les barres d'erreur indiquent l'écart type. Immunocoloration des marqueurs associés aux tissus du foie: D) CYP3A4, E) , l' albumine intracellulaire et F) DPP4 et E-cadhérine. Vert ou rouge - tache indiquée; Blue -. DAPI S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Il y a plusieurs éléments qui sont essentiels à considérer lors de la tentative de biofabricate constructions de tissu 3-D, pour une éventuelle utilisation chez les humains ou pour des applications in vitro de dépistage. En utilisant les composants cellulaires appropriés détermine la fonctionnalité potentielle d'extrémité, tandis que le dispositif de biofabrication lui-même détermine la méthodologie générale pour parvenir à la construction finale. La troisième composante, le biomatériau, est tout aussi important, car il sert un double rôle. Plus précisément, le composant biomatériau doit être compatible avec le matériel de biofabrication (c. -à- bioprinters) et prennent également en charge les composants cellulaires biologiques potentiellement fragiles. Optimisation de ces deux exigences peut être difficile, en tant que matériaux bioprintable doivent répondre à plusieurs paramètres clés: 1) possèdent des propriétés chimiques appropriées, mécaniques et temporelles pour faciliter l'impression efficace et sans entraves; 2) la viabilité des cellules de support au cours des phases de préparation et bioprinprocédure ting; 3) et de fournir un environnement accueillant qui améliore le mieux la viabilité cellulaire et la fonction de construction de tissu éventuelle suite à la bioprinting. Nous utilisons le système hydrogel bioink modulaire décrit dans la méthodologie décrite ici pour répondre à ces exigences. Tout d'abord, en intégrant des facteurs de croissance, les collagènes, GAG et elastins dérivés de l'ECM d'un type de tissu particulier, nous pouvons obtenir un profil biochimique qui rappelle le type de tissu cible. D'autre part, en utilisant des 2 réactions de reticulation similaires mais indépendantes, nous sommes en mesure de réaliser un matériau extrudable souple qui est compatible avec la plupart à base extrusion, qui peut être en outre modifiée à la seconde étape de réticulation pour accéder à un module d'élasticité de la matière déterminée qui correspond à une cible tissus de choix. ³⁴

La caractéristique essentielle de ce système qui rend utile est la possibilité de supporter de multiples réactions chimiques qui peuvent être mises à profit pour manipuler le polymela cinétique d'risation et les propriétés mécaniques du système bioink. En utilisant 2 types de réaction indépendantes, thiol acrylate et thiol alcyne, nous obtenons la capacité d'effectuer un thiol-acrylate d'étape de réaction 1 qui résulte en un matériau souple qui peut être extrudé à travers un dispositif de seringue ou bioprinting, et d'un thiol étape 2 -alkyne réaction, qui est seulement amorcé lors de l'exposition aux UV, en présence d'un photoinitiateur, qui détermine le module d'élasticité de la construction bioprinted finale. Ces étapes multiples résultent en une matière bioprintable. En tant que tel, dans le but de parvenir à un bioink stable qui supporte l'extrusion et après le module d'élasticité de personnalisation, le maintien de ces types de réactions distinctes est importante.

Le tirage au sort primaire à l'aide du système de biofabrication est sa facilité de personnalisation, qui se fait soit par la manipulation du module d'élasticité d'extrémité à travers l'agent de réticulation secondaire, ou par l'inclusion de différents matériaux ECM dérivées du tissu ou des cocktails de facteurs de croissance. L'ECM dans les tissus contient une variété de facteurs de croissance et d'autres cytokines, qui varient souvent dans la répartition globale entre les différents types de tissus. Nous pensons que ces facteurs sont essentiels pour le maintien de la fonction de certains types de cellules, telles que les hépatocytes humains primaires. La mise en œuvre de ce concept a déjà été démontré pour augmenter la viabilité et la fonction des hépatocytes humains primaires dans les cultures sandwich d'acide hyaluronique héparinisés. ²⁰ En combinant les chaînes d'héparine dans l'hydrogel avec des facteurs de croissance liant l' héparine, ainsi que d' autres composants de l' ECM de l' ECM du foie, nous avons pu de présenter ce profil biochimique spécifique du foie des hépatocytes humains primaires, le maintien de la viabilité et la fonction in vitro pendant une longue période de temps. Cette approche peut facilement être étendue à d'autres types de tissus, ce qui permet aux chercheurs d'atteindre récapitulation de ces facteurs spécifiques de tissus par décellularisation et solubilisation d'autres tissus.

tente "> Les utilisateurs doivent être conscients que , tandis que les composants de base de ce système de bioink ont été mis en œuvre dans bioprinting précédemment, ^10,12,17 mais dans des approches spécifiques des tissus moins nuancées, ainsi qu'une variété d'autres applications de la médecine régénérative, ^{35- 45} biofabrication n'a pas été tenté pour tous les types de tissus. en tant que tel, il peut y avoir un certain développement et le dépannage nécessaire afin de créer de telles constructions de tissus supplémentaires. Cependant, un système modulaire tel que décrit ici peut très bien être adaptable. Autre potentiel limitations comprennent des affinités naturelles que certains types de cellules peuvent avoir à l'égard des biomatériaux spécifiques. En général, nous avons trouvé que les composants de base à base de PEG-acide, la gélatine et hyaluroniques de ce support de système d'hydrogel cultures viables d'une grande variété de types de cellules, mais il peut-être certains types de cellules qui fonctionnent mieux dans les milieux artificiels de différentes compositions, telles que le collagène, qui présente une fibre inhérente nature, ou l'élastine, qui est par nature plus élastique. En tant que tel, la considération pour le matériau optimal pour un type de tissu donné et application finale est importante, et le système hydrogel bioink décrit ici peut ne pas être suffisant pour tous les usages. En outre, il est important de tenir compte des conditions environnementales dans lesquelles bioprinting est effectué. Lors de l'élaboration de ce protocole, nous sommes passés de près ambiante (température ambiante) conditions d'utilisation bioinks sans aucun milieu cellulaire, ce qui conduit à une mauvaise viabilité si le temps de préparation et de l'impression a été trop étiré, des protocoles plus rapides de moins de 37 ° C en utilisant bioinks avec un composant de support, ce qui augmente considérablement la viabilité cellulaire.

Jusqu'à récemment, peu de matériaux ou systèmes de matériaux ont été développés spécifiquement pour l'interface avec les systèmes de bioprinting. En conséquence, la plupart des matériaux sont simplistes, en tirant parti de leurs caractéristiques biologiques soit pour soutenir les cellules, ou, leur compatibilité avec biofabricationMatériel. Peu de matériaux sont optimales dans les deux domaines. Le système décrit dans cette méthodologie découple ces caractéristiques, permettant ainsi la personnalisation de la caractérisation biologique, tout en facilitant les propriétés mécaniques nécessaires pour l'extrusion bioprinting. Une distinction supplémentaire de ce système hydrogel bioink est qu'il peut mimer les paramètres biochimiques et physiques des tissus cibles, il est utilisé pour biofabricating. Cela soutient un niveau impressionnant de flexibilité, permettant récapitulation des facteurs biochimiques de presque tous les tissus, ainsi que le module d'élasticité correspondant de tout tissu mou. L'attention à ces deux aspects d'un tissu ont rarement été exploré en tandem.

La modularité de cette technologie offre une flexibilité pour être mis en oeuvre dans une grande variété d'applications. La capacité à imiter divers types de tissus offre la possibilité de biofabricate pas seulement des constructions de foie utilisées comme exemple dans ce travail, mais construct représentant la plupart des autres tissus dans le corps. Peut-être la plus large application évidente à l'aide de ces paramètres est la capacité de faire correspondre les deux aspects d'un tissu particulier pour optimiser la fonction de fin d'assemblage conçues pour les applications réelles, telles que l'implantation ou le médicament et le criblage toxicologique. Alors que la génération des tissus humains de taille pour l'implantation chez les patients est l'objectif final pour de nombreux chercheurs, en raison d'obstacles réglementaires, l'approvisionnement de la cellule, et les limites de la capacité de fabriquer des vascularisation fonctionnelle dans les organes de l'ingénierie tissulaire, ce noble objectif exigera la poursuite du développement et le temps à réaliser. Toutefois, des technologies telles que la méthodologie décrite ici sont actuellement commencent à être mises en œuvre pour générer «organites» pour les plates - formes in vitro. Notre équipe, ainsi que d'autres, utilise actuellement organoide biofabrication pour créer des systèmes de modèles dans lesquels les études toxicologiques sont effectuées. En outre, ces organites peuvent être utilisés pourétudier les pathologies et la progression de la maladie, comme le cancer, ⁴⁶ et tester des traitements thérapeutiques potentiels. Enfin, ce système prend également en charge une autre utilisation importante. En manipulant ces paramètres indépendamment, les chercheurs peuvent effectuer des expériences scientifiques de base pour déterminer l'importance relative des facteurs biochimiques par rapport mécaniques.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acide hyaluronique	Sigma	53747
Gélatine	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4&prime ;-(2-hydroxyéthoxy)-2-méthylpropiophénone	Sigma	410896
Kit hydrogel d’acide hyaluronique et de gélatine (HyStem-HP)	Le kit ESI-BIO	GS315	contient les composants Heprasil (acide hyaluronique thiolé et hépariné), Gelin-S (thiolated gélatine) et Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alcyne, 10  ; kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Hépatocytes humains primaires	Triangle Research Labs	HUCPM6
Cellules stellaires hépatiques humaines primaires	ScienCell	5300
Cellules Kupffer humaines primaires	Life Technologies	HUKCCS
(HBM)	Lonza	CC-3199
Milieux hépatocytaires Kit de supplément	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kits (contient de l’acide ascorbique, 0,5   ; Ml; albumine sérique bovine [sans acides gras], 10  ; Ml; sulfate de gentamicine/amphotéricine B, 0,5 ; Ml; hydrocortisone 21-hémisuccinate, 0,5   ; Ml; insuline, 0,5  ; Ml; facteur de croissance épidermique recombinant humain, 0,5 ; Ml; transfert, 0,5  ; ml)
Triton X-100	Sigma	T9284	Les autres fabricants sont ok.
Hydroxyde d’ammonium	Fischer Scientific	A669	Les autres fabricants sont ok.
Tissu de cadavre porcin frais	n/a n	/a
Lyophiliseur	n’importe quel	n/a
Broyeur à congélateur	n	/a
Bioimprimante	n/a n	/a n/a	La bio-imprimante décrite dans le présent document a été fabriquée sur mesure à l’interne. En général, d’autres appareils sont adéquats à condition qu’ils prennent en charge l’impression par extrusion contrôlée par ordinateur de matériaux hydrogel.
Plaque de culture de cellules tombantes suspendue	InSphero	CS-06-001 Plate-forme	de culture 3D InSphero GravityPlus