La protéine c-FOS détection immunohistologique: Un outil utile comme marqueur des voies centrales impliquées dans les réponses physiologiques spécifiques<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; Ex Vivo</em

Résumé

Ici, nous présentons un protocole basé sur la détection immunohistologique de la protéine c-FOS, une technique classique utilisée pour l’identification de populations neuronales impliquées dans des réponses physiologiques spécifiques in vivo et ex vivo.

Résumé

De nombreuses études cherchent à identifier et cartographier les régions du cerveau impliquées dans les règlements physiologiques spécifiques. Les c-fos proto-oncogène, un gène précoce immédiat, est exprimé dans les neurones en réponse à divers stimuli. Le produit protéique peut être facilement détectée par des techniques d'immunohistochimie conduisant à l'utilisation de la détection c-FOS pour cartographier des groupes de neurones qui affichent des changements dans leur activité. Dans cet article, nous nous sommes concentrés sur l'identification des populations du tronc cérébral neuronales impliquées dans l'adaptation ventilatoire à l'hypoxie ou hypercapnie. Deux approches ont été décrites pour identifier les populations neuronales impliquées in vivo chez l' animal et ex vivo dans les préparations du tronc cérébral déafférenté. In vivo, les animaux ont été exposés à des mélanges de gaz hypercapniques ou hypoxiques. Ex vivo, les préparations déafférenté ont été perfusées avec hypoxiques ou liquide céphalo - rachidien artificiel hypercapnique. Dans les deux cas, soit le contrôle des animaux in vivo ou ex vivo préparations ont été maintenues dans des conditions normoxiques et normocapnie. La comparaison de ces deux méthodes permettent la détermination de l'origine de l'activation neuronale ie, périphérique et / ou central. In vivo et ex vivo, tronc cérébral ont été prélevés, fixés et découpés en sections. Une fois que les sections ont été préparées, la détection immunohistochimique de la protéine c-FOS a été faite afin d'identifier les groupes de cellules activées tronc cérébral par des stimulations hypoxiques ou hypercapnie. Les cellules marquées ont été comptées dans les structures respiratoires du tronc cérébral. Par rapport à la condition de contrôle, l'hypoxie ou hypercapnie augmenté le nombre de cellules marquées c-fos dans plusieurs sites du tronc cérébral spécifiques qui sont donc constitutive des voies neuronales impliquées dans l'adaptation de l'entraînement respiratoire centrale.

Introduction

Le gène fos c- a été identifié pour la première fois au début de 1980 ^1,2 et son produit a été caractérisé en 1984 comme une protéine nucléaire ayant des propriétés gène activateur ^3,4. Elle participe à des mécanismes à long terme associés à la stimulation des neurones. En effet, les variations de l' activité neuronale conduisent à des seconds messagers de signalisation en cascade qui induisent l'expression du gène précoce immédiat c-fos, ce qui induit la production du facteur de transcription c-fos. Ce dernier initie l'expression des gènes tardifs et participe ainsi à des réponses adaptatives du système nerveux à d....

Protocole

Remarque: la détection c-FOS est une procédure normalisée comportant plusieurs étapes (figure 1). Toutes les expériences ont été réalisées sur des rats ou des souris. Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité d'éthique de l'expérience animale Charles Darwin (CE5 / 2011/05), fait conformément aux Communautés européennes Directive du Conseil du 22 Septembre, 2010 (2010/63 / UE) pour les soins aux animaux, et conduites en accord avec les lois françaises pour les soins aux animaux.

1. Préparation des solutions

1. Préparer un tampon de phosphate de sodium 0,2 M: ajouter 6,24 g de NaH ₂

Résultats

La détection c-FOS est un outil utile qui permet d' identifier des groupes de cellules activées dans des conditions spécifiques , telles que l' hypoxie et l' hypercapnie in vivo (figure 2A) ou dans des situations qui imitent ces conditions ex vivo (figure 2B). In vivo, nouveau - né, jeune ou des rongeurs adultes ont été placés dans une boîte étanche à l' air , dans lequel le milieu gazeux est continuellement ren.......

Discussion

C-fos est un gène précoce immédiat, et la détection de son produit, la protéine c-fos, sont classiquement utilisés pour identifier les populations de neurones impliqués dans la réponse des voies respiratoires spécifiques in vivo et ex vivo ^{11,13,25,28 16-18, 27,32,33.}

Étapes critiques Dans le Protocole

Soyez prudent lors de l'étape de perfusion. La solution PFA 4% doit être bi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque de culture cellulaire 12 puits	Costa	35/3
15 mm Inserts Netwell avec membrane en polyester Corning		3477	Les inserts de puits de 15 mm de diamètre ont 74µ ; Semelles en maille de polyester m fixées à des inserts en polystyrène
Anticorps primaire (anticorps polyclonal de lapin contre la protéine c-Fos)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT  ;	Vector laboratories	PK-6101
(Anticorps IgG secondaires de lapin)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldéhyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Saccharose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Éthylène-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tétrachlorhydrate  ;	Rockland	DAB50
Sulfate de nickel et d’ammonium	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide  ;	Thermo-scientifique	1014356190	Superfrost ultraplus
Verre de protection	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153