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Primaire endodermique des cellules épithéliales de la Culture Yolk Sac Membrane de japonais Quail Embryons

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DOI :

10.3791/53624

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10 mars 2016

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1Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University

Dans cet article

Résumé

Pour étudier le mécanisme d’utilisation des lipides dans les membranes du sac vitellin pendant les derniers stades du développement embryonnaire aviaire, nous avons établi un système de culture de cellules épithéliales endodermiques embryonnaires primaires de caille japonaise.

Résumé

Nous avons établi un modèle épithélial de culture de cellules endodermiques (CEE) pour étudier la fonction de certaines enzymes et des protéines dans la médiation de l'utilisation des nutriments par les embryons aviaires au cours du développement. Fécondés oeufs de caille japonaise ont été incubées à 37 ° C pendant 5 jours, puis jaunes d'membranes sac (YSM) ont été collectées pour établir le système de culture CEE. Nous avons isolé la couche endoderme embryonnaire de YSM et tranché la membrane en 2 - 3 pièces mm et partiellement digéré avec de la collagénase avant le semis dans des plaques de culture de 24 puits. Les CPE prolifèrent sur le tissu et sont prêts pour les études de culture cellulaire. Nous avons constaté que les CPE a des caractéristiques typiques de YSM in vivo, par exemple, l' accumulation de gouttelettes lipidiques, l' expression de la stérol O-acyltransférase et la lipoprotéine lipase. Le traitement de la digestion partielle a augmenté de manière significative le taux de réussite de la culture CEE. Utilisant les CPE, nous avons démontré que l'expression de SOAT1 a été réglementé par le AMPc dla protéine kinase A ependent voie connexe. Ce système de culture caille japonaise CEE primaire est un outil utile pour étudier le transport des lipides embryonnaire et de clarifier le rôle des gènes impliqués dans la médiation de l'utilisation des nutriments dans YSM pendant le développement embryonnaire aviaire.

Introduction

La ressource nutritive majeure de l'embryon aviaire est le jaune, composé de 33% de lipides, 17% de protéines et 1% de cendres. 1 Au cours du développement embryonnaire, la membrane de la vésicule ombilicale (YSM) croît de l' intérieur de la cavité abdominale de l' embryon et recouvre progressivement le jaune d' oeuf surface. Commençant à jour embryonnaire 2, l' expression des gènes associés au métabolisme des lipides et de l' angiogenèse est progressivement augmentée en YSM et le YSM développe lentement projections villosités-like. 8,9 Ces projections augmentent l' absorption des nutriments de jaune pour soutenir le développement embryonnaire. Le YSM est un tissu extra - embryonnaire qui contient trois couches germinales, endoderme, mésoderme et ectoderme. 14 L'ectoderme jaune sac fait face à l'albumen et des liens avec la membrane vitelline pour couvrir délicatement le sac jaune. Les cellules épithéliales endodermiques sont confrontés directement vers le jaune d'œuf et servent de portails d'utilisation des éléments nutritifs. 6 Comme étend la YSM, endodermique cellules épithéliales (CPE) peut être divisé par shape et la fonctionnalité en deux groupes, zone vitellines et la zone vasculosa. 7

Zone vitelline est composé de cellules endodermiques et est éloigné de l'embryon; zone vasculosa est composé de cellules mésodermiques et couvre les CPE différenciées avec les vaisseaux sanguins et les tissus conjonctifs. Par jour embryonnaire 5, le jaune est totalement couvert par l'ectoderme et l'endoderme de YSM et la région vasculaire a connu une croissance rapide. La YSM absorbe, recompose et libère les lipides (comme le jaune dérivé très lipoprotéines de basse densité) et des protéines dans le système circulatoire embryonnaire. 9, 2 Par conséquent, nous avons mis en place un système primaire japonais de caille embryonnaire endodermique épithéliales de culture cellulaire, pour étudier les mécanismes de lipides l'utilisation en YSM pendant le développement embryonnaire aviaire.

Lipides tels que les triacylglycérols, de la lécithine, un phospholipide et un ester de cholestérol (EC) sont les principales sources d'énergie pour les embryons aviaires. Aux premiers stades de leur développement, les lipides du jaune sont composed de seulement 1,3% CE et il monte à 10-15% à mi-parcours du développement embryonnaire aviaire 3, 11 ester de cholestérol. est synthétisée à partir du cholestérol par stérol O-acyltransférase 1 (SOAT1) dans aviaire embryon YSM. 4

La forme de stockage du cholestérol est CE, C'est effectuée dans les lipoprotéines, et les lipoprotéines sont transportées par la circulation vers les tissus. 13 Une semaine avant l' éclosion il y a une croissance rapide des embryons d' oiseaux. Environ 68% du contenu en lipides restant dans le jaune sont absorbés au cours de cette étape. 10 Le mécanisme par lequel les lipides sont utilisés jaune d' oeuf peut être clarifiée par un modèle de recherche CEE. Un protocole de culture CEE du poulet a été mis en place pour atteindre cet objectif de recherche. 2, 9 Toutefois, en raison du faible taux de réussite des explants de tissus, une procédure de culture cellulaire CEE améliorée est nécessaire pour étudier la fonction de certaines enzymes et des protéines dans la médiation de l' utilisation des nutriments par embryons d'oiseaux au cours du développement.

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Protocole

NOTE: Cette procédure est une modification d'un modèle de poulet protocole de culture développé par Bauer et al 2013 et Nakazawa et al, 2011. 2,9..

1. Préparer sain Embryonic Jour 5 Embryons de Quail japonaise

  1. Placer 1 mâle et 3 femelles sexuellement matures caille japonaise ensemble dans la même cage. Aliments pour animaux d'approvisionnement et de l' eau ad libitum. Ajustez la lumière dans la salle des animaux à 14 h de lumière et 10 heures d'obscurité.
  2. Collecter les œufs fécondés dans des sacs en plastique chaque jour dans l'après-midi et les garder dans un 16 ° C réfrigérateur pour retarder le taux d'embryons de croissance.
  3. Après avoir recueilli un nombre suffisant d'oeufs dans un délai de deux semaines, incuber les oeufs fécondés dans un incubateur à 37 ° avec une bonne ventilation pendant cinq jours.

2. Préparer Basal Medium et Wash Solutions

  1. Utiliser DMEM / F-12 (ajusté à pH 7,2) comme milieu de croissance, et la compléteravec 10% de nouveau sérum de veau né (NBCS) et 1% Pen-Strep Ampho. Solution (PSA; Pénicilline, 10 5 unités / L; streptomycine, 100 mg / L; amphotéricine B, 0,25 mg / L).
  2. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration 10 fois pour le stockage; utiliser la solution 1x PBS (contenant du NaCl, 137,93 mM, KCl, 2,667 mM, KH 2 PO 4, 1.471 mM, Na 2 HPO 4 7H 2 O, 8,06 mM; ajuster le pH à 7,2) pour laver et humidifier le jaune sac membrane tout séparer l'endoderme du jaune d'oeuf et de l'albumine.
  3. Utiliser un milieu DMEM (ajusté à pH 7,2) afin de remettre en suspension les granulés de l'endoderme.

3. Collection de CPE primaire de YSMs Quail japonais

  1. Incuber les œufs récoltés pendant 5 jours (étape 1.3). Examinez les oeufs par un candler d'oeuf pour confirmer le développement embryonnaire normal.
    NOTE: Le jour embryonnaire 5, la limite de YSM mésoderme est très clair et les couches embryonnaires 3 sont moins étroitement liés entre eux, de sorte qu'il est facile d'obendoderme tain. Utilisez uniquement les oeufs montrant le développement de la circulation capillaire normale pour les collections YSM.
  2. Nettoyez la coquille soigneusement à l'aide d'eau douce et 75% d'éthanol. Ouvrez la coquille de la position de la cellule de l'air par une paire de ciseaux, retirez délicatement sur et recueillir la totalité YSM par des pinces et les placer dans une boîte de culture de 10 cm rempli de 37 ° C 1x PBS.
  3. En utilisant une paire de ciseaux supprimer l'embryon, le jaune et le blanc d'oeuf, et doucement laver le YSM avec 1x PBS trois fois et placer YSM en solution PBS dans une boîte de culture de 10 cm.
  4. Utilisez une pince et une paire de ciseaux pour enlever l'ectoderme de YSM. Utiliser 2 forceps, une pour maintenir fermement la couche de cellules d'origine endodermique, et l'autre pour maintenir le mésoderme capillaire.
  5. Sous un microscope à dissection, séparer et on sépare l'endoderme du bord du mésoderme dans la direction vers l'embryon. Collecter l'endoderme jaune clair dans 50 ml tubes de centrifugation en utilisant un compte-gouttes et dans 15 ml de milieu de croissance dans un C wat 37 °bain er jusqu'à ce que toutes les collections de tissus sont terminés.

4. Digestion de l'endoderme tranches par collagénase Digestion

  1. Fraîchement dissoudre 6,5 unités de collagénase de type IV dans 10 ml de DMEM.
  2. Centrifuger les tubes de 50 ml (3,4) à 130 g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le milieu et placer tous les endoderme dans une boîte de culture de 6 cm à l'aide d'une pipette. Ajouter une solution de collagénase 1 ml à cette boîte de culture.
  3. Trancher l'endoderme recueillies à partir de 2 embryons de caille avec une paire de ciseaux courbes jusqu'à ce que la taille de chaque tranche est d'environ 2 à 3 mm. Utilisez un compte-gouttes, de collecter toutes les tranches dans un tube centrifuge de 50 ml le long avec 9 ml de solution de collagénase fraîche.
  4. Digest le tissu avec de la collagénase pendant 30 min dans un bain-marie agitateur 37 ° C à 175 tours par minute. Cette digestion partielle avec de la collagénase est utilisée pour améliorer la prolifération des cellules des explants.
  5. Centrifuger à 130 g pendant 3 min à température ambiante et retirez délicatement la fraction de surnageant à l'aide d'une pipette. Laver le culot en suspension dans 20 ml de DMEM et de retirer la fraction de surnageant après centrifugation à 130 x g pendant 3 min.
  6. Remettre en suspension le culot avec 12 ml de milieu de croissance (DMEM / F12 avec 10% de NBCS et 1% de PSA) et des semences doucement et également dans une plaque à 24 puits (chaque solution de cellules bien avec 500 ul).
  7. Incuber des explants de tissu à 37 ° C dans 5% de CO2 dans l' air pendant 2 jours pour permettre aux cellules de proliférer sur des tissus.
  8. Laisser incuber les cellules pendant 2 jours et caractériser la viabilité des cellules par un protocole de dosage de la viabilité cellulaire. 15
    NOTE: les cellules vivantes maintiennent un environnement réducteur dans le cytosol. Résazurine, l'ingrédient actif, est un composé perméable aux cellules non-toxique qui est de couleur bleue et pratiquement non-fluorescent. Lorsqu'ils sont ajoutés à des cultures de cellules, la résazurine est réduite à la résorufine dans le cytosol par les enzymes mitochondriales. Résorufine est de couleur rouge et très fluorescent. Les cellules viables convertissent de façon continue à la résazurine résorufine, increAsing la fluorescence globale et la couleur du milieu de culture des cellules environnantes.
  9. Effectuer endoderme cellules épithéliales isolement de l' ARN total, la transcription inverse et quantitative PCR en temps réel du gène marqueur expression de l' ARNm comme décrit. 16,17
    1. Utiliser la PCR transcriptase inverse pour détecter SOAT1 ARNm (sens: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; anti-sens: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; produit PCR = 168 pb) comme marqueur spécifique des cellules CEE. Utilisez β-actine ARNm (sens: 5'TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; antisens: 5'GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; produit PCR = 151 pb) comme un gène de ménage et de contrôle interne.
    2. Utiliser une électrophorèse sur gel pour détecter la taille du produit de la RT-PCR quantitative. Préparer 1% de gel d'agarose, et mélanger 10 ul produit qPCR avec 2 ul colorant de chargement. Charge 10 mélange ul dans chaque puits dans le gel d'agarose à 1%, et exécuter le gel par 100V pendant 30 min.

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Résultats

Afin d'atteindre l'objectif d'établir un modèle cellulaire cohérente et utile, nous devons développer et stabiliser le taux et le rendement des CPE aviaires prolifération. Nous avons comparé l'incubation directe de l'endoderme sans digestion enzymatique avec l'endoderme partiellement digéré avec des enzymes protéolytiques, telles que la collagénase ou collagénase plus 0,6 U de dispase. Dispase est un groupe amino-endopeptidase qui hydrolyse les liaisons peptidique...

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Discussion

Parce que le système de culture précédente a qu'un succès limité, un meilleur système de culture est nécessaire. La caille YSM endoderme japonaise nécessite un traitement avec des enzymes protéolytiques telles que la collagénase pour desserrer les jonctions cellule-cellule pour obtenir une meilleure performance de la croissance dans les explants ex-vivo. Nos données montrent que le nombre de cellules provenant du traitement de digestion partielle ont été supérieures à partir de la culture de tissu non digéré après l...

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Déclarations de divulgation

Il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts. Nous n’avons reçu aucun financement d’une entreprise privée.

Remerciements

Le financement pour le développement du protocole actuel est particulièrement soutenue par "But du Plan Université Top" de l'Université nationale de Taiwan, Taiwan (subvention ID-104R350144), ainsi que le Ministère de la science et de la technologie de Taiwan (subvention ID: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). Nous remercions tout particulièrement le Centre de biotechnologie de l'Université nationale de Taiwan pour fournir une salle d'animaux et de l'espace de laboratoire pour l'étude en cours.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dulbecco’s Modified Eagle MediumGibco de Life technologies12800-017 10 X 1 LPour laver les granulés EECs
D-MEM/F-12Gibco de Life technologies12400-024 10 X 1 LComme milieu de base dans la culture des EECs
NBCSGibco de Life technologies16010-159Comme sérum d’approvisionnement dans la culture des EECs
Pen-Strep Ampho. SolutionBI (Biological Industries)03-033-1B 100 mlPour atténuer l’infection possible  ;
Collagénase Type IVGibco de Life technologies17104-019 1 g  ; La collagénase est une protéase avec une spécificité pour la liaison entre un acide aminé neutre (X) et la glycine dans la séquence Pro-XGly-Pro. Comme protéase pour la dissociation des cellules du tissu primaire.
Plaque 24 puitsFALCON® ; REF-353047Pour les CEE pour fixer et raccorder des
tubes à centrifuger en PP de 50 mlCorning® ; CentriStarTM430829Pour le transport des membranes et la digestion enzymatique
50 ml Tube à fond conique avec capuchonPRO TECHCT-50-PL-TWPour le transport des membranes et la digestion enzymatique
Bain d’agitation réciproqueDEAGLESB302Pour une meilleure digestion enzymatique sur les membranes

Références

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Mots-clés

Digestion la collag naseessai de prolif ration cellulaireanalyse par RT qPCRaccumulation de gouttelettes lipidiquesexpression de SOAT1r gulation de la voie de l AMPcd veloppement embryonnaire aviaire

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