Primaire endodermique des cellules épithéliales de la Culture Yolk Sac Membrane de japonais Quail Embryons

Résumé

Pour étudier le mécanisme d’utilisation des lipides dans les membranes du sac vitellin pendant les derniers stades du développement embryonnaire aviaire, nous avons établi un système de culture de cellules épithéliales endodermiques embryonnaires primaires de caille japonaise.

Résumé

Nous avons établi un modèle épithélial de culture de cellules endodermiques (CEE) pour étudier la fonction de certaines enzymes et des protéines dans la médiation de l'utilisation des nutriments par les embryons aviaires au cours du développement. Fécondés oeufs de caille japonaise ont été incubées à 37 ° C pendant 5 jours, puis jaunes d'membranes sac (YSM) ont été collectées pour établir le système de culture CEE. Nous avons isolé la couche endoderme embryonnaire de YSM et tranché la membrane en 2 - 3 pièces mm et partiellement digéré avec de la collagénase avant le semis dans des plaques de culture de 24 puits. Les CPE prolifèrent sur le tissu et sont prêts pour les études de culture cellulaire. Nous avons constaté que les CPE a des caractéristiques typiques de YSM in vivo, par exemple, l' accumulation de gouttelettes lipidiques, l' expression de la stérol O-acyltransférase et la lipoprotéine lipase. Le traitement de la digestion partielle a augmenté de manière significative le taux de réussite de la culture CEE. Utilisant les CPE, nous avons démontré que l'expression de SOAT1 a été réglementé par le AMPc dla protéine kinase A ependent voie connexe. Ce système de culture caille japonaise CEE primaire est un outil utile pour étudier le transport des lipides embryonnaire et de clarifier le rôle des gènes impliqués dans la médiation de l'utilisation des nutriments dans YSM pendant le développement embryonnaire aviaire.

Introduction

La ressource nutritive majeure de l'embryon aviaire est le jaune, composé de 33% de lipides, 17% de protéines et 1% de cendres. ¹ Au cours du développement embryonnaire, la membrane de la vésicule ombilicale (YSM) croît de l' intérieur de la cavité abdominale de l' embryon et recouvre progressivement le jaune d' oeuf surface. Commençant à jour embryonnaire 2, l' expression des gènes associés au métabolisme des lipides et de l' angiogenèse est progressivement augmentée en YSM et le YSM développe lentement projections villosités-like. ^8,9 Ces projections augmentent l' absorption des nutriments de jaune pour soutenir le ....

Protocole

NOTE: Cette procédure est une modification d'un modèle de poulet protocole de culture développé par Bauer et al 2013 et Nakazawa et al, 2011. ^2,9..

1. Préparer sain Embryonic Jour 5 Embryons de Quail japonaise

1. Placer 1 mâle et 3 femelles sexuellement matures caille japonaise ensemble dans la même cage. Aliments pour animaux d'approvisionnement et de l' eau ad libitum. Ajustez la lumière dans la salle des animaux à 14 h de lumière et 10 heures d'obscurité.
2. Collecter les œufs fécondés dans des sacs en plastique chaque jour dans l'après-midi et les garder....

Résultats

Afin d'atteindre l'objectif d'établir un modèle cellulaire cohérente et utile, nous devons développer et stabiliser le taux et le rendement des CPE aviaires prolifération. Nous avons comparé l'incubation directe de l'endoderme sans digestion enzymatique avec l'endoderme partiellement digéré avec des enzymes protéolytiques, telles que la collagénase ou collagénase plus 0,6 U de dispase. Dispase est un groupe amino-endopeptidase qui hydrolyse les liaisons peptidique.......

Discussion

Parce que le système de culture précédente a qu'un succès limité, un meilleur système de culture est nécessaire. La caille YSM endoderme japonaise nécessite un traitement avec des enzymes protéolytiques telles que la collagénase pour desserrer les jonctions cellule-cellule pour obtenir une meilleure performance de la croissance dans les explants ex-vivo. Nos données montrent que le nombre de cellules provenant du traitement de digestion partielle ont été supérieures à partir de la culture de tissu non digéré après l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco de Life technologies	12800-017 10 X 1 L	Pour laver les granulés EECs
D-MEM/F-12	Gibco de Life technologies	12400-024 10 X 1 L	Comme milieu de base dans la culture des EECs
NBCS	Gibco de Life technologies	16010-159	Comme sérum d’approvisionnement dans la culture des EECs
Pen-Strep Ampho. Solution	BI (Biological Industries)	03-033-1B 100 ml	Pour atténuer l’infection possible  ;
Collagénase Type IV	Gibco de Life technologies	17104-019 1 g	; La collagénase est une protéase avec une spécificité pour la liaison entre un acide aminé neutre (X) et la glycine dans la séquence Pro-XGly-Pro. Comme protéase pour la dissociation des cellules du tissu primaire.
Plaque 24 puits	FALCON® ;	REF-353047	Pour les CEE pour fixer et raccorder des
tubes à centrifuger en PP de 50 ml	Corning® ; CentriStarTM	430829	Pour le transport des membranes et la digestion enzymatique
50 ml Tube à fond conique avec capuchon	PRO TECH	CT-50-PL-TW	Pour le transport des membranes et la digestion enzymatique
Bain d’agitation réciproque	DEAGLE	SB302	Pour une meilleure digestion enzymatique sur les membranes