La culture tridimensionnelle dans des billes d’alginate, en raison de sa simplicité et de sa reproductibilité, a été choisie pour maintenir les cellules de l’adénome hypophysaire. Les procédures comprenaient une digestion enzymatique initiale et une dissociation mécanique du tissu tumoral, et la suspension cellulaire ultérieure a été encapsulée dans des billes d’alginate.
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Article de méthode
Tridimensionnelle Alginate-perle culture de cellules humaines adénome hypophysaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Un procédé de culture en trois dimensions est décrit dans lequel les cellules d'adénome hypophysaire primaire sont cultivées dans des billes d'alginate. L'alginate est un polymère dérivé d'algues brunes de la mer. En bref, le tissu tumoral est coupé en petits morceaux et soumis à une digestion enzymatique avec de la collagénase et de trypsine. Ensuite, une suspension cellulaire est obtenue. La suspension de cellules tumorales est mélangé avec de l'alginate de sodium à 1,2% et est tombé dans une solution de CaCl 2, et la suspension d'alginate / cellule est gélifiée au contact du CaCl 2 pour former des billes sphériques. Les cellules incluses dans les billes d'alginate sont alimentées en nutriments sont fournis par des milieux de culture enrichi avec 20% de FBS. culture tridimensionnelle dans des billes d'alginate maintient la viabilité des cellules d'adénome pendant de longues périodes de temps, jusqu'à quatre mois. En outre, les cellules peuvent être libérés de l'alginate par lavage des billes avec du citrate de sodium et ensemencées sur des lamelles en verre pour d'autres analyses immunocytochimiques. L'utilisation d'une cell modèle de culture permet la fixation et la visualisation du cytosquelette d'actine avec désorganisation minimal. En résumé, des billes d'alginate fournissent un système de culture fiable pour le maintien de cellules hypophysaires adénome.
Introduction
Échafaudages tridimensionnels ont été largement utilisés dans la culture de cellules, car ils fournissent un support structural tridimensionnel de cellules mises en culture et le maintien de la cellule à cellule communication 1. des matières polymères d'origine naturelle ont été utilisés pour fabriquer des échafaudages tridimensionnels dont collagène de type I, le chitosane et l'alginate. Alginate est un polymère naturel dérivé de l'algue Macrocystispyrifera de mer brune (varech). Ce polymère est composé d'unités répétées de β-D-mannuronique (M) et α-L-guluronique (G) 2 et forme des gels stables en présence de certains cations divalents tels que le calcium et le baryum. (CaCl 2) de solutions de chlorure de calcium sont couramment utilisés en tant que réactif de réticulation pour former des billes d'alginate. Des solutions d'alginate a chuté en CaCl2 former immédiatement gels sphériques tridimensionnels. Lorsque la solution d'alginate est mélangé avec des cellules, les cellules sont encapsulées dans l'alginate bEADS 3.
Alginate a des propriétés qui lui ont permis d'être utilisés comme matrice pour l'encapsulation d'une grande variété de cellules, y compris les chondrocytes 4, 5 myoblastes squelettiques et les cellules souches neurales 6. Il est un matériau inerte et permet la diffusion de nutriments, de l'oxygène et des produits métaboliques qui maintiennent la survie et la fonction des cellules; En outre, contrairement à d'autres systèmes de culture à base de gel, les cellules cultivées à l'intérieur des perles d'alginate peuvent également être libérés de l'échafaudage à l'aide des chélateurs de calcium, tels que le citrate de sodium, et les cellules peuvent ensuite être récoltées pour de plus amples investigations 7.
adénomes hypophysaires sont généralement des tumeurs bénignes avec des taux de prolifération faible. Rat lignes de cellules d'adénome hypophysaire ont été cultivées avec succès dans un système bidimensionnel 8. Cependant, cette culture de tumeurs sécrétoires de cellules de l'hypophyse humains ne sont pas un développement efficace; cellules pituitaires de tumeur dispersées poussent maldans la culture, les cellules présentent attachement limitée et la diffusion, et les cellules se forment généralement agrégats flottants dans la boîte de culture 9,10.
Plusieurs tentatives ont été faites pour obtenir une suspension de cellules de la tumeur pituitaire, y compris une approche enzymatique et la dispersion mécanique 11, une méthode de dispersion uniquement mécanique 12 et la mise en culture des explants tumoraux 10. Avec ces approches, différents auteurs ont obtenu des cultures adhérentes viables pour les différentes périodes de temps. Les capacités des cellules sécrétoires de la tumeur pour survivre dans ces systèmes à deux dimensions dépendent du type de tumeur et de leur taux de prolifération 9. Toutefois, dans des cultures à long terme, les cellules ayant des phénotypes de fibroblastes prédominent 11,13. Le présent document décrit un procédé d'obtention d'une culture primaire de cellules d'adénome hypophysaire encapsulés dans des billes d'alginate qui les libère en outre de l'échafaud d'alginate qui permet des analyses détaillées deaspects de leur biologie cellulaire, par exemple, leurs arrangements cytosquelette.
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Protocole
Cette étude a été approuvé pour l'utilisation de matériel humain par les comités d'éthique locaux de l'institution médicale et le Centre de recherche et Advance études de l'Institut National Polytechnique.
Acquisition de l'échantillon 1. tumorale
- Obtenir la biopsie de tissu hypophysaire adénome d'un patient grâce à une intervention chirurgicale trans-sphénoïdal 14.
- Recueillir l'échantillon hypophyse adénome et le placer dans une bouteille en verre stérile contenant 50 ml de frais 199 milieu de culture (M199) enrichi avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 0,6 mg / bicarbonate de sodium ml, 2,4 mg / ml de HEPES et 1% des antibiotiques (pénicilline / streptomycine) à pH 7,4. Maintenir l'échantillon dans une bouteille en verre sur la glace.
Remarque: Le tissu tumoral peut être traité plusieurs heures après la chirurgie. - Transporter l'échantillon de tumeur au laboratoire dans la bouteille en verre sur de la glace.
2. Préparation de la dissociation enzymatique des tissus Solutions, laSolution d'inhibiteur de la trypsine et les solutions d'alginate
Note: Avant la procédure de culture cellulaire Préparer les solutions suivantes. Filtrer toutes les solutions en utilisant un filtre à membrane de 0,22 pm avant utilisation.
- Préparer une solution de collagénase à 1% en dissolvant 5 mg de collagénase (type I) dans 5 ml de sérum-M199 libre.
- Préparer une solution de trypsine à 0,01% par dissolution de 0,01 g de trypsine dans 10 ml de PBS-EDTA 0,3%.
- Préparer une solution d'inhibiteur de trypsine à 0,1% en dissolvant 2 mg d'inhibiteur de trypsine de soja dans 20 ml de sérum-M199 libre.
- Préparer une solution de DNAse en dissolvant 20 ul de DNase I 134 U / ml dans 4 ml de la solution d'inhibiteur de trypsine.
- Préparer une solution d'EGTA (1,2 M) en dissolvant 22,8 mg d'EGTA dans 40 ml de NaCl 155 mM. Ajuster le pH à 7,4. Continuer jusqu'à un volume final de 50 ml.
- Préparer une solution HEPES (20 mM) en dissolvant 238 mg dans 50 ml de HEPES de NaCl 155 mM.
- Préparer la solution d'alginate de 1,2% par dissolution de 1,2g d'alginate de sodium dans 100 ml de solution de HEPES. Autoclave la solution d'alginate.
- Préparer une solution de calcium (102 mM) en dissolvant 750 mg de CaCl 2 dans 50 ml de solution de HEPES, ajuster le pH à 7,4
3. Primary Cell Culture et Alginate Encapsulation
- L'intérieur d'une hotte à flux laminaire, placer le tissu tumoral dans une boîte de Petri de 35 mm contenant environ 20 ml de PBS Ca2 + et Mg2 +, pH 7,4 (PBS *).
- Prenez le tissu avec une pince chirurgicale et le placer dans une autre boîte de Pétri contenant du PBS frais *, laver délicatement le tissu. Répéter cette étape jusqu'à ce que les globules rouges et les débris sont éliminés.
- En utilisant une pince chirurgicale, maintenir le tissu hypophysaire adénome, et avec un petit ciseau chirurgical, le couper en petits morceaux. Avec une pipette Pasteur avec des bords arrondis, transférer les fragments de tissus et le PBS * dans un tube de 15 ml, Centrifuger à 68 xg pendant 10 min à température ambiante.
Remarque: Pour arrondir les bords d'un Pasteurpipette, flamme légèrement la pointe de la pipette dans un brûleur Bunsen. - Retirer la PBS * à l'aide d'une pipette de Pasteur et ajoute 3-5 ml de la solution de collagénase (environ 5 ml à 65 mm3 de tissu), mélanger deux à trois fois par inversion. Incuber le tissu de la collagénase pendant 30 minutes à 37 ° C en rotation constante.
- Centrifuger le tube à 68 g pendant 10 min à température ambiante et retirez la collagénase avec une pipette Pasteur.
- Ajouter 5 ml de DNAse et mélanger deux à trois fois par inversion, puis centrifuger le tube à 68 g pendant 10 min à température ambiante.
Remarque: Si le tissu est pas complètement dissocié, effectuer une seconde digestion enzymatique avec la trypsine pendant 3 min à 37 ° C. Arrêter la digestion par addition de 2 volumes de solution d'inhibiteur de trypsine. - Aspirer le surnageant avec une pipette Pasteur et le jeter. Re-suspendre le culot dans 1 volume de solution d'EGTA et mélanger avec 2 volumes de solution d'alginate.
- Mélanger délicatement la suspension cellulaire et de l'alginatepar aspiration avec une pipette Pasteur. Prendre une seringue stérile avec une aiguille 21 G, retirez le piston; utiliser une pipette pour charger la seringue avec la solution d'alginate et la cellule.
- Insérez délicatement le piston dans la seringue et soigneusement distribuer la solution d'alginate cellules goutte-à-goutte dans un récipient en verre contenant environ 30 ml de la solution riche en calcium.
- Placer l'aiguille de la seringue jusqu'à environ 5 cm de la solution de CaCl 2. Les gels d'alginate suspension de cellules au contact du CaCl 2, pour former des billes sphériques. Maintenir les billes d'alginate de calcium de la solution pendant 5 minutes.
Remarque: Agiter le récipient en verre dans laquelle les billes sont abandonnées. Déplacez lentement avec la main en mouvements circulaires, pour les empêcher de coller les uns aux autres. - Retirez délicatement la solution de calcium avec une pipette Pasteur, et laver les billes deux fois avec 3-5 ml de M199 enrichi avec 20% de FBS.
- Transférer les billes d'alginate dans une culture régulière de tissu T25fiole à l'aide d'une spatule stérile, ajouter 5.4 ml de M199 enrichi avec 20% de FBS et incubées à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2. Changer le milieu de culture tous les trois jours.
4. Libérer cellules de l'alginate
Remarque: avant de libérer les cellules à partir des billes d'alginate, le manteau 13 lamelles mm de diamètre avec des poly-D-lysine.
ATTENTION: L'acide sulfurique est un ACIDE hautement corrosifs et APTS PEUT IRRITER LES YEUX ET LA PEAU. Utilisez des gants de latex pour MANIPULER ces réactifs.
- Dans une hotte, avec une pince à épiler point plonger les lamelles dans une boîte de Pétri en verre contenant 20% d'acide sulfurique aqueux pendant 1 heure à température ambiante.
- Décanter l'acide sulfurique, et laver les lamelles cinq fois avec de l'eau distillée pendant 5 minutes chacun. L'utilisation d'un lieu point de pince Les lamelles propres dans une boîte de Pétri contenant du NaOH 0,1 M pendant 5 min à température ambiante 15.
- Décanter le NaOH et laver une fois avec distillerl'eau conduit, aspirer l'eau et sécher les lamelles.
- Utiliser une micropipette pour enrober les lamelles avec APTS (aminopropyltriéthoxysilane) pendant 4 min (utiliser 500 pi 6 lamelles) inonder la boîte de Pétri avec de l'eau distillée. aspirer rapidement l'eau et continuer à laver avec de l'eau distillée, le déplacement des lamelles au point des pinces pour permettre à l'eau de pénétrer sous.
- Aspirer l'eau et sécher les lamelles, en utilisant un endroit point de pince à épiler les lamelles dans une boîte de Pétri propre et les stériliser à l'intérieur du micro-ondes pendant 3 fois, 45 secondes chacun. Ajouter 1000 pi d'eau stérile pour 100 pg de poly-D-lysine (0,1 mg / ml).
- Incuber les lamelles avec environ 50 ul de poly-D-lysine pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le poly-D-lysine complètement.
Remarque: Ce point est important parce soluble poly-D-lysine dans le milieu de culture peut inhiber la prolifération cellulaire. - Rincer les lamelles cinq fois avec de l'eau stérile pendant 5 minutes chacun. Aspirer le sterile lamelles d'eau et laisser sécher l'intérieur d'une hotte à flux laminaire.
- Pour analyser le cytosquelette d'actine, libérer les cellules hypophysaires de l'alginate. Prendre certaines des billes d'alginate à partir de la fiole de culture en utilisant une pointe de pipette de 1 ml et on les place dans un tube de 15 ml.
- Ajouter 5 ml de citrate de sodium 55 mM (dissoudre 323,6 mg de Na 3 C 6 H 5 O 7, H 2 O 2 dans 20 ml de solution de HEPES) et centrifuger à 68 xg pendant 10 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et le jeter.
- Re-suspendre le culot dans 1 ml de chaud M199 enrichi avec 20% de FSB; mélanger délicatement la suspension de cellules avec une pipette Pasteur.
ATTENTION: phalloïdine ET DAPI sont toxiques. UTILISER gants pour manipuler ces réactifs. - Pour compter les cellules, transférer 125 ul de 0,4% Trypan solution bleue à un tube de 1,5 ml. Ajouter 75 pi de M199 et 50 pi de la suspension cellulaire obtenue dans la dernière étape (facteur de dilution = 5). Bien mélanger.
- Utiliser un embout de micropipette à place environ 10 ul de la suspension cellulaire au bleu Trypan dans la chambre d'hémocytomètre.
- Compter le nombre de cellules dans le compteur d'hémocytomètre en utilisant un microscope inversé avec un éclairage en contraste de phase. Comptez toutes les cellules de la place centrale de 1 mm et de quatre cases de coins 1 mm. Obtenir la densité de cellules par millilitre en multipliant le nombre moyen par mètre carré par le facteur de dilution -. 10 4 Par exemple, si les comptes moyens par carré est de 45 cellules x 5 x 104 = 2,25 x 106 cellules / ml.
Note: Compter les cellules en dix places de la chambre de hémocytomètre. Ne pas compter les cellules touchant la ligne médiane en bas et à droite. - Semences 35.000 cellules par 13 mm lamelles de verre de diamètre recouvertes de poly-D-lysine.
5. cytosquelette d'actine Arrangement
- Après 48 heures de culture, retirer le milieu de culture avec une pipette Pasteur et rapidement ajouter 500 pi par lamelle de PBS, retirer immédiatement la PBS.
- Fixer et perméabiliser til cellules avec 500 pi par lamelle de tampon de fixation (0,1 M PIPES, pH 6,75, 4% de PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM de MgSO 4, 0,5% de Triton X-100 et 2% formaldehyde) pendant 10 min à 37 ° C C
- Retirer le tampon de fixation et ajouter 500 ul par lamelle de 3,5% de paraformaldehyde dans du PBS pendant 30 min à température ambiante. Retirer la solution de paraformaldéhyde.
- Lavez les lamelles trois fois en ajoutant 500 ul par lamelle de PBS pendant 5 minutes chacun. Rincer les lamelles à la température ambiante, dans une agitation constante.
- Incuber les cellules avec 50 mM de chlorure d'ammonium pendant 10 min, aspirer la solution de chlorure d'ammonium et répéter l'étape 5.4.
- Incuber les cellules avec 1% de BSA (IgG-libre, libre protéases-) dans du PBS pendant 30 min, retirer la solution de BSA et répétez l'étape 5.4.
- Incuber les cellules avec 50 uM de rhodamine-phalloïdine conjuguée à 7 min à température ambiante, répétez l'étape 5.4.
- Incuber les cellules avec 255 uM de DAPI dilué dans du PBS pendant 5 min à température ambiante, répétez l'étape 5.4. t monter enfinil lamelles de avec un milieu de montage et de les sceller avec du vernis à ongles.
- Acquérir des images des arrangements actine du cytosquelette l'aide d'un balayage laser confocal microscope avec un objectif 63X à 541 nm, longueur d'onde d'excitation.
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Résultats
Ce protocole a été appliqué avec succès dans la culture et l'entretien des cellules hypophysaires adénome dans des billes d'alginate pour différentes périodes de temps Figure 1 montre les cellules incorporés dans des billes d'alginate au bout de trois mois. Ces cellules présentent des formes arrondies bi-réfringent sous un microscope optique inversé (figure 1). La figure 2 montre la localisation de la N-cadhérine dans les cel...
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Discussion
Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques. Le premier est la taille homogénéité bourrelet, qui est nécessaire pour maintenir les mêmes conditions de diffusion des nutriments et des gaz dans l'ensemble de la culture cellulaire. Dans notre expérience, l'utilisation d'une aiguille de 21 G pour rendre les perles d'alginate permet l'acquisition d'une culture efficace de taille uniforme de perles. Le deuxième facteur important est la distance entre l'aiguille; cette distance ne doit pas être...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions M. O. Rios pour son assistance technique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| fort ; | |||
| 199 Milieu de culture ; | Invitrogen ; | 31100-027 | Pour la culture, chaud dans un 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Sérum fœtal bovin ; | PAA | A15-751 | |
| Bicarbonate de sodium (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-N&aigu ;-2éthanesulfonique (HEPES) | Sigma ; | H-4034 | |
| Pénicilline/Streptomycine | PAA | P11-010 | |
| PBS (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco) | Invitrogen ; | 21600-044 | |
| Collagénase de type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsine ; | Invitrogen ; | 27250-018 | |
| Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Inhibiteur de la trypsine de sorbène ; | Invitrogen ; | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Acide alginique, de Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma ; | A-2158 | |
| Chlorure de calcium (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Citrate de sodium (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Pipérazine-N,N&prime ;-bis(2-éthanesulfonique) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyéthylène glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Éthylène acide tétraacétique glycol (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Sulfate de magnésium (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldéhyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma | P6148 | |
| d’ammonium (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Sérum bovin Albumine sans IgG | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloïdine&ndash ; Isothiocyanate de tétraméthylrhodamine B | Sigma | P1951 | Toxique. Utilisez des gants pour manipuler ce réactif ; |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole, chlorhydrate (DAPI) | Invitrogen ; | D1306 | Toxique. Utilisez des gants pour manipuler ce réactif ; |
| Acide sulfurique (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Très corrosif. Utilisez des gants pour manipuler ce réactif ; |
| Hydroxyde de sodium (NAOH) | Merck | 1.06498 | Peut provoquer une irritation des yeux et de la peau. Utilisez des gants pour manipuler ce réactif ; |
| (3-aminopropyl)triéthoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Bromhydrate de poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Bleu de trypan solution | Sigma | T8154 ; | |
| fort ; ; | Company ; | Numéro de catalogue ; | Comments |
| Equipment ; | Toxique : Peut causer le cancer. Utilisez des gants pour manipuler ce réactif ; | ||
| Rotateur ; | Centrifugeuse Boekel Scientific | modèle 230300 | |
| DuPont Corporation ; | Modèle sorvall TC6 | ||
| shaker ; | Instruments de laboratoire | Modèle 314-820²� ; |
Références
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Réimpressions et autorisations
