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Article de méthode

Induction de la mère Immune Activation chez la souris à mi-gestation scène avec Viral Mimic Poly (I: C)

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DOI :

10.3791/53643

⸱

25 mars 2016

 ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

L’activation immunitaire maternelle (MIA) est un modèle pour un facteur de risque environnemental de l’autisme et de la schizophrénie. L’objectif de cet article est de fournir une procédure étape par étape sur la façon d’induire une MIA chez les souris enceintes afin d’améliorer la reproductibilité de ce modèle.

Résumé

Le modèle d’activation immunitaire maternelle (AMI) est de plus en plus apprécié comme modèle de rongeur pour le facteur de risque environnemental de divers troubles psychiatriques. De nombreuses études ont démontré que le modèle MIA est capable de montrer la valeur faciale, conceptuelle et prédictive qui sont pertinentes pour l’autisme et la schizophrénie. Pour modéliser l’AIM, les chercheurs utilisent souvent l’imitation virale polyinosinique :acide polycytidylique (poly(I :C)) pour activer le système immunitaire chez les rongeurs enceintes. Généralement, la progéniture de la digue activée par le système immunitaire présente des anomalies comportementales et des altérations physiologiques associées à l’autisme et à la schizophrénie. Cependant, l’injection poly(I :C) avec différents dosages et à différents moments pourrait conduire à des résultats différents en perturbant le développement du cerveau à différents stades. Nous présentons ici une méthode détaillée pour induire une MIA par injection intrapéritonéale (i.p.) de 20 mg/kg de poly(I :C) à 12,5 jours embryonnaires au milieu de la gestation (E12.5). Il a été démontré que cette méthode induit une réponse inflammatoire aiguë dans l’axe mère-placentaire-fœtal, ce qui entraîne finalement les perturbations cérébrales et les phénotypes comportementaux associés à l’autisme et à la schizophrénie.

Introduction

Le concept de l' activation immunitaire maternelle (MIA) provient des études épidémiologiques sur l'association de l' infection maternelle avec l' autisme et la schizophrénie 1. En raison de l'absence d'agents pathogènes viraux replication détectables dans le placenta ou le cerveau du fœtus après l' infection virale de la mère 2,3, l'effet de l'infection sur la descendance est supposée être provoquée par l'activation du système immunitaire maternel plutôt que les agents pathogènes eux - mêmes .

Pour élucider la relation et de cause à effet entre MIA et les troubles psychiatriques, l'injection de synthétisé chimiquement, viral mimique à double polyinosinique ARN brin: acide polycytidylique (poly (I: C)) dans les rongeurs enceintes a été largement utilisé comme modèle animal pour MIA 4,5. Poly (I: C) est reconnu par Toll-like récepteur 3 (TLR3), et l'administration systémique de poly (I: C) induit une réponse inflammatoire aiguë de type viral. L'un des mécanismes par lesquels le poly (I: C) produces anomalies comportementales et neuropathologies chez la progéniture est en provoquant un déséquilibre de cytokines pro - inflammatoires et anti dans l'axe de la mère-placentaire-foetal 6. Plusieurs groupes ont adopté le modèle MIA pour comprendre l'étiologie des troubles psychiatriques 7, et en raison de la diversité des intérêts entre les groupes de recherche, divers points de temps d'activation immunitaire ont été utilisés pour réaliser différentes perturbations sur le développement du cerveau et les comportements 7.

Le laboratoire Paul H. Patterson à l'Institut de Technologie de Californie adopte la stratégie d'injection de poly (I: C) dans des souris enceintes à embryonnaires 12,5 jours (E12.5), qui a démontré avec succès que MIA est capable d'induire des comportements, neurologique, et des modifications immunologiques chez la progéniture qui sont associés à l' autisme et la schizophrénie 11/08. Nos travaux antérieurs montrent que MIA progéniture afficher des anomalies du comportement (par exemple, impairmen sociauxt, le déficit de communication, comportement répétitif, le comportement à l' anxiété, et latente déficit d'inhibition 8,10,12), immunitaire dysrégulation et cytokines déséquilibre 8,13,14, altération de l' expression des gènes du cerveau du fœtus 15, la perte de cellules de Purkinje dans lobule VII du cervelet 11, altération des propriétés synaptiques dans l' hippocampe 9, gène x environnement interaction 13, altération de la perméabilité intestinale, et la composition du microbiote intestinal 16. En outre, des stratégies thérapeutiques et prophylactiques sont également développés à partir de ce 13,16,17 système modèle. En induisant MIA à E12.5, d' autres ont montré que MIA produit l' activation du fœtus microglie et l' altération du développement cholinergique cerveau antérieur basal 18, souche spécifique interaction 19, le cerveau synaptosomiques cérébrale anomalies ultrastructurales, cérébrales mitochondriales respiratoires abnormalties chaîne hyperfonctionnement, la régulation négative de molécules synaptosomiques cérébrales 17 ,comportements dépressifs-like, déficience de la cognition et hippocampique potentialisation à long terme (LTP), et le déficit de la neurogenèse hippocampique adulte 20.

Ici, nous fournissons une méthode détaillée de la façon d'induire MIA à E12.5 par poly (I: C), ainsi que les paradigmes de la façon d'appliquer ce modèle pour étudier l'étiologie de l'autisme et la schizophrénie. Il est important de noter que la MIA est un facteur de risque pour une variété de troubles 4, et ses résultats sont extrêmement sensibles au temps et un procédé d'induction ainsi que l'élevage des femelles gravides. En tant que tel, même des incohérences mineures entre les laboratoires aboutissent souvent à faible reproductibilité et / ou différents phénotypes de la progéniture. Notre méthode est spécifiquement conçu pour les personnes intéressées à étudier MIA comme un facteur de risque environnemental pour l'autisme et la schizophrénie, et la description détaillée fournie aidera les chercheurs à améliorer la reproductibilité de leurs données.

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Protocole

Tous les protocoles ont été réalisées sous l'approbation du California Institute of Care Committee et l'utilisation des animaux Institutionnel Technologie (IACUC).

1. Préparation des paires Timed-accouplement

  1. Utilisez au moins 6 barrages pour des expériences comportementales et 3 pour l'analyse de l'expression des gènes.
    REMARQUE: Utilisez le double du nombre de souris femelles estimés, puisque seulement environ 50% des souris sera branché du chronométré-accouplement.
  2. Utilisez la souris femelle sans grossesse préalable et à 8-16 semaines d'âge.
    NOTE: Des souris femelles qui ont une exposition sexuelle avant les souris mâles, mais ne l'ont pas été enceintes sont acceptables.
  3. Maison les souris femelles ensemble et placer les cages à côté de l'autre afin de synchroniser leur cycle oestral. Utilisez une cage de souris standard avec une hauteur de plus de 5,5 pouces et un plancher intérieur de 75 pouces carrés pour permettre le logement de 5 souris adultes. Étiquetez chaque souris femelle en utilisant un poinçon de l'oreille.

2. Mise en place Timed-mating pair

  1. Mettre en place le chronométré-accouplement 0-2 heures avant le début du cycle d'obscurité. Placez deux souris femelles dans chaque cage. Sortez les souris et les peser individuellement. Enregistrer le poids corporel de chaque souris femelle.
  2. Placez une souris mâle dans chaque cage avec les deux souris femelles. Utilisez trio accouplement pour réduire au minimum l'effet paternel confondant.

3. Vaginal Plug-Check (E0.5)

  1. Vérifiez la femelle souris 0-4 h après la fin du cycle d'obscurité. Soulevez doucement la souris femelle de la base de la queue et laissez la souris pour attraper la grille métallique, haut de la cage, ou le bord de la cage.
  2. Rechercher des signes de bouchon vaginal: bouchon vaginal est une masse blanchâtre visible dans l'ouverture vaginale. Si la fiche est pas évident, insérez délicatement une pointe de pipette 200 pi dans l'ouverture vaginale. La résistance de la coagulation confirme la formation d'un bouchon vaginal. Vérifiez le bouchon vaginal une fois par jour.
    NOTE: bouchon vaginal est seulement une indication que la copulation a eu lieu, et donc ne pas ggrossesse arantie. bouchon vaginal peut être difficile d'identifier dans certaines souches de souris. Demander de l'aide d'un soignant de souris expérimenté pour augmenter la précision de l'identification de la fiche.
  3. Déplacez les souris branchés à une nouvelle cage et le groupe loger eux. Définir le jour de vaginal apparition de fiche embryonnaire 0,5 jours (E0.5).

4. Sur E10.5-11.5, Vérifiez la grossesse

  1. Soulevez doucement la base de la queue et laissez la souris pour attraper la grille métallique, haut de la cage, ou le bord de la cage. Observez la région de l' abdomen pour vérifier les signes de la grossesse, par exemple, un renflement dans l'abdomen (Figure 1).
    NOTE: Le signe de grossesse est toujours plus évidente à E11.5 qu'à E10.5.
  2. Peser les souris pour vérifier la grossesse. La souris enceinte pèse généralement environ 20% plus lourd à E10.5 et 30% plus lourd à E12.5 par rapport à une souris non enceintes (Figure 2). Maison de la souris enceintes dans des cages propres.

5. 20 mg /kg Poly (I: C) Préparation

  1. Utilisez au moins 6 barrages par groupe pour des expériences comportementales et 3 par groupe pour l'analyse de l'expression des gènes. Préparer la quantité correspondante de poly (I: C) solution.
  2. Peser le poly (I: C) en poudre dans un tube conique de 50 ml pour obtenir une concentration finale de 40 mg / ml. Afin de minimiser et de normaliser le stress causé par le volume d'injection, injecter 5 ul de poly (I: C) une solution pour chaque gramme de poids corporel de souris (5 ul / g, soit 5 ml / kg). Pour induire MIA, on injecte 20 mg de poly (I: C) par kg.
    Remarque: la concentration de poly (I: C) est une solution nécessaire (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Étant donné que le poly (I: C) de poudre contient 10% de poly (I: C), nous avons besoin de faire une concentration finale de (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / ml de poly (I: C) solution.
    ATTENTION: Le poly (I: C) la poudre est très léger. Veillez à ne pas perdre de poudre pendant le transfert de la spatule pour le tube conique.
  3. Ajouter le volume correspondant de chlorure de sodium à 0,9% (solution saline) dans la cuve coniquee et fermer le bouchon. Dissoudre la poudre en faisant rouler délicatement la gouttelette de solution saline dans le poly (I: C) jusqu'à ce que la poudre la solution est limpide. Centrifuger le tube conique à 800 g pendant 1 min (figure 3C). Filtrer le poly (I: C) une solution de filtre de 0,22 um. Transférer le poly (I: C) solution à un tube de 1,5 ou 2 ml microcentrifugeuse. Facultatif: Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer le rapport 260/280 du poly (I: C) solution. Assurer que le rapport est compris entre 1,54 à 1,82 (figure 3) comme décrit par le fabricant. NOTE: La solution saline utilisée pour dissoudre le poly (I: C) poudre et servir injection de contrôle doit être de qualité stérile et pharmaceutique.

6. Saline ou poly (I: C) Injection sur E12.5

  1. Peser la souris sur l'échelle et le mettre dans la cage. Utiliser la formule suivante pour calculer le volume de l'injection à la fois du sérum physiologique et le poly (I: C) chez la souris: Poids corporel (g), multiplié par 5 = volume d'injection désirée (pi). Utilisez un 0,3 ml isolen seringue pour établir le volume calculé de solution saline ou 20 mg / kg de poly (I: C) solution, par exemple, 150 pl pour une souris de 30 g.
  2. ramasser délicatement la souris par la base de la queue et le placer sur le dessus de la cage. Manipulez la souris doucement pour éviter les effets de confusion induits par le stress. Insérer l'aiguille biseau vers le haut, à environ 20 ° par rapport à la souris dans le centre de ses deux tétons supérieurs (figure 4), et injecter le sérum physiologique ou le poly (I: C) la solution. REMARQUE: L'aiguille doit être remplacé pour chaque souris après l'injection.
  3. Placez la souris à sa cage. Placer les cages dans un quartier calme, chambre basse du trafic pour éviter les autres effets confondants.

7. The Day After Poly (I: C) Injection (E13.5)

  1. Vérifiez les souris injectées le lendemain matin. Utilisez une échelle pour mesurer le poids corporel.
    NOTE: Poly (I: C) injecté les souris enceintes gagnent habituellement moins de poids que la solution saline injectée souris le jour après injection.
  2. Ne pas déranger les souris jusqu'à ce que la progéniture est née.

8. Jauge de MIA Offspring

  1. Afin de minimiser les effets confondants de MIA induction, suivez les instructions ci-dessous pour évaluer l'utilisation de MIA progéniture.
    1. Exclure les portées de prématuré ou la naissance tardive, ou si la taille de la portée est inférieure à 5.
    2. Euthanasier les chiots excessifs par CO 2 si la taille de la portée est plus grande que 10.

9. Facultatif: Examiner la réponse inflammatoire aiguë Après MIA

  1. Sacrifiez l'enceinte souris 3 h après une solution saline ou de poly (I: C) injection en utilisant la méthode décrite dans le protocole approuvé par le Comité de protection des animaux de l'institution.
    NOTE: La dislocation cervicale est souvent préférée car elle minimise l'effet du CO 2 médicaments / d'euthanasie sur le barrage et de l' embryon.
  2. Collecter la rate des souris enceintes adultes et d'isoler le placenta et soutien-gorge foetaldans le cadre du stéréomicroscope.
    1. Pour la collecte de la rate, poser la souris sur la plaque de dissection et pulvériser éthanol à 70% sur la région abdominale des souris enceintes. Utilisez une paire de ciseaux stériles pour faire une coupe verticale dans le centre de la zone abdominale en dessous de la cage thoracique à travers la peau.
    2. La rate se trouve dans le quadrant supérieur gauche abdominale. Utilisez une pince pour isoler la rate. Rouler la rate sur essuie-glaces de tâches délicates pour éliminer le tissu adipeux autour de l'organe. Recueillir approximativement 50 mg de tissu splénique et de les placer individuellement dans des tubes Eppendorf avec 500 ul d'ARN ou de stabiliser le tampon TRIzol pour empêcher la dégradation des acides nucléiques. Conserver les échantillons à -80 ° C congélateur jusqu'à utilisation.
    3. Pour la collecte du placenta, tirez doucement sur les cornes utérines du corps. Placez les cornes utérines dans une boîte de Pétri remplie de sérum physiologique phosphate autoclavée tamponnée (PBS) et laisser le plat sur la glace. Utilisez deux pinces pour déchirer la paroi utérine et d'exposer le sac amniotique.
      1. Soigneusement utiliser la pince pour ouvrir le sac amniotique sans endommager le placenta et le foetus. Séparer le placenta du fœtus et couper le cordon ombilical au plus près du placenta que possible. Éliminer les débris sac amniotique à partir du placenta. Placez le placenta individuellement dans des tubes Eppendorf avec 500 ul ARN stabilisent tampon ou TRIzol. Conserver l'échantillon à -80 ° C congélateur jusqu'à utilisation.
    4. Pour la collecte du cerveau du fœtus, stocker le fœtus dans l'ARN stabiliser le tampon de l'étape 9.2.2 jusqu'à la dissection. Démêler de la membrane piale du ventricule du cerveau à l'aide de pinces fines no 5 sous la loupe binoculaire. Retirez soigneusement toute la membrane du cerveau du fœtus. Placez le cerveau du fœtus individuellement dans des tubes Eppendorf avec 500 ul ARN stabilisent tampon ou TRIzol. Conserver l'échantillon à -80 ° C congélateur jusqu'à utilisation.
  3. Extraire l'ARN à partir du tissu et de convertir l'ARN en ADNc. Analyser l'expression du gène IL6 dans l'ADNc par real-time PCR.
  4. Extraire l'ARN à partir de tissus en suivant le protocole de fabrication de TRIzol. Si les tissus sont stockés dans un tampon de stabilisation de l'ARN. Décongeler l'échantillon et centrifuger le tampon. Transférer le tissu en pointe à un autre Eppendorf avec 500 ul TRIzol et poursuivre l'extraction de l'ARN.
  5. Utiliser un spectrophotomètre pour mesurer la concentration, 260/280 et 260/230 rapport de l'ARN. Vérifiez que les ratios sont supérieurs à 2,0.
  6. Éliminer la contamination de l'ADN par l'ARN traité à la DNase I. Mélanger 1 pg d'ARN, 1 ul de tampon 10X de réaction, 1 ul de DNase sans RNase, et de l'eau sans nuclease à un volume final de 10 ul. Incuber le mélange maître à 37 ° C pendant 30 min. Ajouter 1 pi de solution d'arrêt de la DNase pour terminer la réaction. Laisser incuber le mélange à 65 ° C pendant 10 min.
  7. Transcription inverse de l'ARN en ADNc. 20 ul en utilisant les réactions et jusqu'à 1 ug d'ARN total par réaction. Mélanger 4 pi 5x inverse tampon transcription (RT) de mélange de réaction, 1 pl reverse transcriptase 11 matrice d'ARN ul après le traitement par la DNase I et 4 ul sans nucléase H 2 O pour obtenir une solution finale de 20 ul. Programmer les conditions du cycleur thermique pour RT. Une condition générique comprend: Étape 1: 25 ° C pendant 5 min; Etape 2: 42 ° C pendant 30 min; Étape 3: 85 ° C pendant 5 min; Étape 4: maintenir à 4 ° C. Diluer l'ADNc 5 fois. Pour le stockage à court terme, stocker l'ADNc à 4 ° C. Pour le stockage à long terme, de geler l'ADNc à -20 ° C.
  8. Analyser l'expression du gène IL6 dans l'ADNc par PCR en temps réel et pour normaliser l'expression du gène IL6 à la ß-actine de l' expression génique.
    1. Faites un mélange maître pour IL6 et la détection de β-actine. Utilisez 25 réaction de pi, le mélange maître pour chaque gène comprend 12,5 pi SYBR Green Mix, 0,5 pi de 10 pM amorce avant, 0,5 pi de 10 pM amorce inverse et 6,5 pi sans nucléase H 2 O.
    2. Placer 5 pi d'ADNc dilué 5x unt le fond du puits de la plaque de réaction à 96 puits optiques. Pipette 20 pi de mélange maître à chaque puits pour faire un mixage final de 25 ul PCR. Triplicata chaque gène pour chaque échantillon. Sceller la plaque à l'aide d'un film adhésif optique. Isoler la plaque à 800 xg pendant 3 min à 4 ° C Utiliser le programme standard de PCR en temps réel: Etape 1: 50 ° C pendant 2 minutes; Etape 2: 95 ° C pendant 10 min; Étape 3: 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s et une température de 60 ° C pendant 1 min. Ajouter une étape supplémentaire pour la courbe de dissociation.

10. Examiner les anomalies comportementales chez Offspring MIA Adulte (Facultatif):

  1. Effectuer les tests de comportement à l'âge de 8-12 semaines. Changer la litière de la cage au moins 3 jours avant le test. Acclimate les souris à la salle de tests de comportement au moins 30 minutes avant le test.
  2. Pour l'inhibition pré-impulsion (PPI), retiennent les souris dans un cylindre en Plexiglas avec un capteur piézo-électrique au-dessous de lui. Acclimate les souris à l'IPPla chambre pendant 5 min. Exposer les souris avec 6 essais de 120 dB de bruit blanc (startle).
  3. Ensuite, exposer la souris avec des mélanges aléatoires de 14 essais de bruit de fond, 14 essais de saisissement, 14 essais de prepulse 5 dB (5 dB plus élevé que le bruit de fond) + Startle (PPI5), et 14 essais de pré-pulse 15 dB (15 dB plus élevé que le bruit de fond + Startle (PPI15).
  4. Moyenne, la réponse de sursaut pour les 6 premiers essais de 120 essais dB. Moyenne, la réponse de sursaut pour les autres stimulations individuelles. Covert la valeur à l'inhibition par pré-impulsion (Sursaut - PPI5 ou PPI15) / Startle.
  5. Pour l' essai en plein champ, placez la souris dans le coin d'une arène carrée ouverte (50 x 50 x 50 cm 3). Enregistrer la trajectoire de la souris pendant 10 min à travers une caméra montée au plafond. Définir le centre de l'arène que la zone centrale (17 x 17 cm2). Quantifier la distance parcourue, les entrées de la zone centrale, et le temps passé dans la zone centrale manuellement ou par un logiciel d'analyse automatique basée sur l'image.
  6. Pour le test d'enfouissement de marbre, acclimater la souris dans une cage de test avec 5cm comprimé profond, propre, Aspen literie de pin pendant 10 min. Retour de la souris à son homecage. Placez délicatement 20 bleu marine 1,5 cm billes de verre de diamètre dans le mode de 4 x 5 arrangement. Placez la souris vers la cage de test avec des billes pendant 10 min. Compter les billes qui ont été enterrés dans la durée d'essai de 10 minutes.

11. Examiner la cérébelleuse neuropathologie dans Offspring MIA Adulte (facultatif):

  1. Euthanasier la solution saline et MIA descendants adultes par anesthésie. Perfuser la souris avec 50 ml de PBS, puis 50 ml de paraformaldehyde à 4% dans le système cardio-vasculaire.
  2. Retirez le cerveau soigneusement et postfix le cerveau paraformaldéhyde 4% pendant une nuit à 4 ° C. Rincer le cerveau avec du PBS trois fois et stocker le cerveau dans du PBS avec de l'azoture de sodium à 0,02% dans un réfrigérateur à 4 ° C jusqu'à utilisation.
    NOTE: Le cerveau postfixé peut être stocké dans du PBS avec 0,02% du gazonazoture ium dans le réfrigérateur pendant jusqu'à un mois.
  3. Section du cerveau en 50 um tranches minces sagittale utilisant vibratome. Ramassez les sections du cerveau à l'aide d'un pinceau doux. Mettre fin à l'activité de peroxydase endogène par incubation des sections de 0,6% de peroxyde d'hydrogène pendant 30 minutes à la température ambiante.
  4. Incuber les sections dans l'anticorps anti-calbindin dilué dans le tampon de blocage (sérum de chèvre à 10% avec 0,1% de Triton X-100 et 0,02% d'azoture de sodium dans du PBS) pendant une nuit à température ambiante. Puis incuber les sections dans l'anticorps secondaire biotinylé dilué dans du tampon de blocage pendant 2 heures à la température ambiante correspondante.
  5. Incuber les sections dans avidine DH - Tampon biotinylé complexe H peroxydase pour détecter la biotine pendant 1 h à température ambiante. Développer les sections en utilisant le substrat de la peroxydase pour visualiser l'antigène. Laver les coupes avec du PBS trois fois entre les étapes. Monter les sections sur des lames de microscope. Image sections sous le microscope.

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Résultats

L' injection de 20 mg / kg de poly (I: C) à E12.5 pourrait provoquer une réponse inflammatoire aiguë dans l'axe de la mère-placentaire fœtal et précipiter un effet chronique au développement du cerveau et de phénotypes comportementaux 12,13. Des niveaux élevés d'une cytokine pro-inflammatoire, l'interleukine (IL) -6, est un indicateur fiable de la réponse inflammatoire aiguë après MIA. Le temps de pointe pour l' expression du gène IL6 dans le...

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Discussion

MIA induction à différentes fenêtres de temps perturbe différents événements de développement du cerveau chez les rongeurs, et conduit par conséquent à différentes anomalies comportementales et neuropathologies chez la progéniture. Ici, nous avons décrit un protocole pour induire MIA chez la souris avec le poly (I: C) injection à E12.5. Cette méthode de MIA conduit à l' induction de comportement, neurologiques, immunologiques et des anomalies gastro - intestinaux associés à l' autisme et la schizophrénie chez la...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à rendre hommage à feu le Dr Paul H. Patterson pour sa contribution à l'avancement du modèle MIA, l'autisme et la recherche sur la schizophrénie. Nous reconnaissons Sarkis K. Mazmanian pour son grand soutien sur ce protocole; Ruben M. Bayon, Yvette Garcia-Flores, Karen C. Lencioni et Leslie A. Neumann d'assistance administrative; Ali Khoshnan et Jan C. Ko pour l'assistance sur le tournage; Elaine Y. Hsiao et Natalia Malkova pour leurs conseils sur MIA induction; Jeffrey S. Cochrane, Joaquin Gutierrez, Kwan F. Lee, Jaime Rodriguez, Lorena C. Sandoval, et Natalie A. Verduzco pour leur élevage expert. Ce travail a été soutenu par le Conte Centre Award NIH (NIH 5P50MH086383-04, Paul H. Patterson); Autism Speaks (# 7670, à Paul H. Patterson); Fondation Simons (# 322839, à Sarkis K. Mazmanian); Subvention de formation NIH (NIH / NRSA T32GM07616 K.-HC); Caltech Summer Undergraduate Research Fellowship (SURF) (à ZY); Amgen Scholars Program à Caltech (à ZY); et postdoctorale from National Science Council, Taiwan (NSC 101-2917-I-564-039, à W.-LW).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Polyinosinique&ndash ; sel de potassium d’acide polycytidyliqueSIGMAP9582
0,9 % chlorure de sodium INJ. USPHOSPIRANDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2"COVIDIEN8881600145
50 ml tubes coniques à visUSA SCIENTIFIC1500-1211
Spectrophotomètre Nanodrop 1000THERMO SCIENTIFIC1000Stéréomicroscope en option
Wild HeerbruggM5A
Pince Dumont #5 en option Taille de la pointe .10 x .06 mmRobozRS-5045en option
Réactif de stabilisation de l’ARN ARNlateren option Qiagen76104
Réactif TRIzolen option Life Technologies15596-026  ;optionnel
DNase sans RNASE RQ1PromegaM610A
Kit de synthèse d’ADNc iScriptBio-Rad170-8891
FastStart universal SYBR green master mix en option avec ROX  ;Roche4913922001en option
PCR en temps réelABI7300Introduction en option
: Il6 forwardLife TechnologiesTAGTCCTTCCTACCCCAATTTCCEntrée en option
: Il6 ReverseLife TechnologiesTTGGTCCTTAGCCACTCCTTCAmorce en option
: bêta-actine forwardLife TechnologiesAGAGGGAAATCGTGCGTGACEn option
Amorce : bêta-actine ReverseLife TechnologiesCAATAGTGATGACCTGGCCGT
Plaque de réaction optique à 96 puits MicroAmpTechnologies4306737
Optionl MicroAmp film adhésif optique  ;Life Technologies4311971Optionl
EthoVisionNoldusEthoVisionOptionl
Appareil SR-LAB (PPI)San Diego Instruments  ;SR-LABOptionl
MarbresPENN-PLAXPierres précieuses bleues marbresOptionl
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Life Technologies21600-069Optionl
ParaformaldéhydeMACRON2621-59Optionl
VibratomeLeicaVT1000 SOptionl
Azoture de sodiumSigmaS2002Optionl
Triton x-100SigmaX100Optionl
Solution de peroxyde d’hydrogèneSigma18312Optionl
Sérum de chèvreVector LaboratoriesS-1000Optionl
Rabbit anti-calbindineanticorps Abcamab11426Optionl
Chèvre biotinlysée anti-lapin IgGantibodyVector LaboratoriesBA-1000Option
VECTASTAIN ABC KitVector LaboratoriesPK-4000Option
en option en option Life

Références

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