Article de méthode

Flow-modèle Fabrication guidée de haute densité Barcode puces à anticorps

DOI :

10.3791/53644

⸱

6 janvier 2016

 , 
1Department of Chemistry, University at Albany, State University of New York, 2Multiplex Biotechnology Laboratory, Cancer Research Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la fabrication d'une grande échelle, deux dimensions ADN ou anticorps réseau multiplexé, avec des applications potentielles dans les études de signalisation cellulaire et la détection de biomarqueurs.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

microréseau d’anticorps, en tant que technologie bien développée, est actuellement concurrencé par quelques autres technologies à haut débit établies ou émergentes. Dans ce rapport, nous rénovons la technologie des microréseaux d’anticorps en utilisant une nouvelle approche de fabrication et en introduisant de nouvelles fonctionnalités. La fabrication de notre microréseau d’anticorps à haute densité est réalisée par un modèle d’écoulement orienté perpendiculairement d’ADN simple brin et une conversion ultérieure médiée par des conjugués ADN-anticorps. Ce protocole décrit les étapes critiques de la formation de l’ADN, de la production et de la purification des conjugués ADN-anticorps et de l’évaluation de la qualité de la puce fabriquée. L’uniformité et la sensibilité sont comparables à celles des puces à ADN conventionnelles, tandis que la fabrication de nos puces ne nécessite pas l’aide d’une imprimante à matrice et peut être réalisée dans la plupart des laboratoires de recherche. L’autre avantage majeur est que la taille de nos unités de micropuces est 10 fois plus petite que celle des puces imprimées, offrant la capacité unique d’analyser les protéines fonctionnelles de cellules uniques lors de l’interfaçage avec des conceptions de micropuces génériques. Cette technologie de code-barres peut être largement utilisée dans la détection de biomarqueurs, les études de signalisation cellulaire, l’ingénierie tissulaire et une variété d’applications cliniques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biopuces d'anticorps ont été largement utilisés dans les études protéomiques pour les décennies à examiner la présence de protéines ciblées, y compris des biomarqueurs protéiques 1-3. Bien que ce domaine est actuellement confronté à de grands défis d'autres technologies à haut débit telles que la spectrométrie de masse (MS), il ya encore beaucoup de place pour l'utilitaire de puces à anticorps, principalement parce que ces appareils offrent l'interprétation des données interface simple et facile avec les autres tests. Au cours des dernières années, l'intégration de puces dans des échafaudages de puces a fourni la puce anticorps une nouvelle opportunité de prospérer 4-7. Par exemple, la puce de code à barres intégré dans une puce à cellule unique a été utilisé dans des études de communication cellulaire 8,9. Cette technologie présente des avantages distinctifs par rapport aux autres technologies de microréseaux disponibles. Il dispose d'éléments de tableau à 10-100 um, beaucoup plus petit que le type 150 um taille utilisée dans elemen de biopuces classiquests. La construction d'éléments de réseau est obtenue en utilisant de plus petites approches systématiques structuration d'écoulement, ce qui donne lieu à des puces à ADN compacts capables de détecter des protéines à cellule unique sécrétées et des protéines intracellulaires. Un autre avantage est l'utilisation d'une configuration simple, sans instrument. Ceci est particulièrement important, car la plupart des laboratoires et les petites entreprises peuvent ne pas être en mesure d'accéder microarray installations de base. Un tel code barre, des puces à anticorps disposent améliorées dosage et le débit peuvent être utilisés pour effectuer des tests hautement multiplexés sur des cellules individuelles tout en obtenant une haute sensibilité et une spécificité comparable à celle de dosage immuno-enzymatique en sandwich classique (ELISA 8). Cette technologie a trouvé de nombreuses applications dans la détection de protéines à partir de glioblastome 11.9, les cellules T 12, et des cellules tumorales circulantes 13. Alternativement, les puces à ADN de code à barres seuls ont été utilisés dans le positionnement précis de neurones et les astrocytes pour Mimicknant l'assemblage in vivo des tissus du cerveau 14.

Ce protocole se concentre uniquement sur les étapes expérimentales et blocs accumulation de deux dimensions (2-D) code à barres anticorps microarray qui a des applications potentielles dans la détection de biomarqueurs dans des échantillons fluidiques et dans des cellules individuelles. La technologie est basée sur une adressable simple brin, à une dimension (1-D) puces à ADN construit en utilisant des oligonucleotides qui sont orthogonales à motifs dans l'espace sur des substrats de verre. Le modèle 1-D est formé lorsque les canaux d'écoulement parallèles sont utilisés dans l'étape de flux de motifs, et un tel motif apparaît comme bandes discrètes visuellement similaires à 1-D Universal Product Code (UPC) des codes à barres. La construction d'un 2-D (n x m) réseau d'anticorps - rappelle un 2-D Quick Response (QR) code matriciel - a besoin de stratégies de mise en forme plus complexes, mais permet l'immobilisation d'anticorps à une densité plus élevée de 8,15. La fabricationADN nécessite deux étapes de mise en forme, avec le premier motif perpendiculaires à la seconde. Les points d'intersection de ces deux modèles représentent les m éléments de la matrice n x. En sélectionnant stratégiquement les séquences d'ADN simple brin (ADNsb) utilisé dans l'écoulement de motifs, chaque élément dans un tableau donné se voit attribuer une adresse spécifique. Cette référence spatiale est nécessaire de distinguer entre les signaux de fluorescence sur la lame de microréseau. La matrice ADN à un brin est converti en une série d'anticorps par incorporation de conjugués d'ADN-anticorps complémentaires, formant une plate-forme appelée bibliothèque d'anticorps codé par l'ADN (DEAL 16).

Ce protocole vidéo décrit les étapes clés dans la création de tableaux nxm d'anticorps qui comprennent la préparation (PDMS) de moules de codes à barres, flux-structuration ADNsb dans deux orientations, préparation d'un anticorps-oligonucléotides conjugués DEAL, et en convertissant le tableau 3 x 3 d'ADN dans un 3x 3 anticorps tableau.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Attention: Plusieurs produits chimiques utilisés dans ce protocole sont irritants et sont dangereux en cas de contact avec la peau. Consultez les fiches de données de sécurité (FDS) et porter un équipement de protection individuelle approprié avant d'effectuer ce protocole. La solution de piranha utilisé dans l'étape (1.1.1) est très corrosif et doit être préparé en ajoutant du peroxyde lentement à l'acide avec agitation. Manipuler cette solution avec une extrême prudence dans une hotte. Utilisez des lunettes de protection et des gants résistant à l'acide. Trimethylchlorosilane (TMCS) est un produit chimique inflammable corrosif utilisé dans une étape facultative après (1.1.6). Manipuler ce produit chimique dans une hotte.

Remarque: Effectuez la fabrication barres de slide et procédures flux-patterning critiques dans une chambre propre pour minimiser la contamination par les matières particulaires. Les particules de poussière peuvent bloquer les ports et les microcanaux de moules PDMS et interférer avec le flux-structuration.

1. Construction de l'Un-dimensionaL 'ADN Barcode diaporama

  1. Préparation du maître SU-8 pour les modèles de flux de code-barres
    Remarque: Les dessins pour les modèles d'écoulement perpendiculaires (figure 1A-B) sont créés en utilisant un (CAO) de conception assistée par ordinateur. Ces motifs sont rendus sur un masque photographique en chrome. Les zones transparentes du masque correspondent aux caractéristiques du maître SU-8.
    1. Nettoyer une tranche de silicium (diamètre 100 mm) à fond dans un mélange de 3 H 2 SO 4: 1 30% de H 2 O 2 (solution piranha) chauffée à 96 ° C. Laver la plaque avec de l'eau désionisée et d'alcool isopropylique, puis on sèche avec un pistolet de soufflage d'azote.
    2. Verser environ 4 ml de SU-8 2025 photorésist sur la plaquette. Utilisez une tournette programmable pour étaler uniformément la résine photosensible sur la plaquette pendant 10 secondes à 500 tours par minute, puis 30 secondes à 3000 tours par minute. Cela crée une couche de résine photosensible d'une épaisseur de 25 um ~. Permettent progressivement tourne à ralentir avant d'arrêter - ce qui est à Maintain un revêtement uniforme sur la surface de la plaquette.
    3. Cuire la plaquette revêtue sur une plaque chauffante pendant 1 min à 65 ° C, puis pendant 5 min à 95 ° C. Cette étape permet le revêtement se solidifier. Refroidir à température ambiante pendant 5 min.
    4. Placer le masque de chrome (figure 1C) sur la couche de résine photosensible. Exposer les caractéristiques de masque à la lumière proche UV (350-400 nm, énergie d'exposition 150-160 mJ / cm 2) pendant 20 secondes.
      Remarque: Le dessin sur le masque de chrome contient 20 chaînes, dont chacun est 20 m de large avec 50 um terrain. Les canaux sont sinueuses d'une extrémité du motif à l'extrémité opposée. Au total, les 20 canaux couvrent une zone rectangulaire d'une longueur de ~ 40 mm et une largeur de ~ 20 mm. Chaque canal est flanqué de deux éléments circulaires qui correspondent à une entrée et une sortie. Entrées et sorties sont interchangeables.
    5. Cuire au four de la tranche exposée sur une plaque chauffante pendant 5 min à 95 ° C. Refroidir à température ambiante progressivement.
    6. Plonger la plaquette dans SU-8 développeur avec agitationpendant 5 min. Laver la plaquette avec une petite portion des frais SU-8 développeur, suivi par l'alcool isopropylique. Séchez la plaquette en utilisant un pistolet à azote. Hard-cuire la galette sur une plaque de cuisson de 200 C ° pendant 30 min, et permettre à la plaquette de refroidir progressivement à la température ambiante.
      Remarque: Le développement peut être effectué pendant une durée plus longue si un film blanc est observé après lavage dans l'étape suivante.
      Facultatif: silaniser le maître SU-8 en l'exposant à Trimethylchlorosilane vapeur dans un boîte de Pétri fermée pendant 10 min.
  2. Préparation du code à barres moule PDMS
    1. Combiner 40,0 g silicone base élastomère avec 4,0 g agent de durcissement. On agite le mélange de prépolymère vigoureusement pendant 10 min. Degas pendant 20 min sous vide.
      Remarque: En règle générale, utiliser un 10: 1 (base: durcisseur) rapport de masse.
    2. Verser le prépolymère dans une boîte de Pétri contenant une plaquette de silicium avec le maître SU-8 du motif de code à barres. La hauteur du mélange PDMS devrait être d'environ 7,5 mm ou plus. Dégazer le mélange dans la Petri plat pour une seconde fois pour éliminer les bulles restantes, puis cuire le mélange pendant 1 heure à 75 ° C pour permettre PDMS pour guérir.
      Remarque: Il est important de maintenir suffisamment d'épaisseur de la dalle PDMS à ~ 7,5 mm ou au-dessus pour éviter d'ajouter trop de tension à la liaison PDMS-verre lors de l'insertion de broches / tube à travers des trous dans le moule PDMS dans l'étape (1.3.3.1)
    3. Avec un scalpel, couper soigneusement autour de la zone de la dalle PDMS qui contient les caractéristiques de moules de codes à barres et le zeste de la dalle de la plaquette.
    4. Couper les bords de la dalle pour atteindre la forme désirée du code à barres moule PDMS. Percez des trous 20 (diamètre de 1,0 mm) à travers le moule à l'aide d'un poinçon de biopsie avec piston. Faire en sorte que les trous soient alignés avec les fonctions circulaires du motif de code à barres. Ces trous servent les entrées et sorties.
  3. Un motif unidimensionnel de poly-L-lysine (PLL)
    1. Enlever la poussière sur la surface d'une lame de verre revêtue de poly-L-lysine en utilisant un pistolet à azote. Attach le moule PDMS à la lame de verre propre. Faire en sorte que les bords du moule et la coulisse sont alignées.
    2. Cuire au four pendant 1,5 heure à 75 ° C pour renforcer le lien entre le moule PDMS et la diapositive PLL-enduit. Pendant ce temps, préparer 20 des morceaux de tuyaux en polyéthylène souple (3 à 4 pouces morceaux, avec un diamètre intérieur de 0,5 mm et un diamètre extérieur de 1,5 mm).
      Remarque: Le nombre de morceaux de tube correspond au nombre d'entrées dans le code-barres moule PDMS. Le tube sert à coupler les canaux sur le code à barres moule PDMS à un réservoir d'azote gazeux équipé d'un régulateur de pression.
    3. À une extrémité de chaque morceau de tube, fixer une broche creuse en acier inoxydable (diamètre 1 mm). Aspirer stérilisée par filtration de poly-L-lysine solution à travers la broche, jusqu'à ce que au moins 1 cm du tube est rempli avec la solution.
      1. Fixer les broches (connectés à un tube rempli de solution) aux entrées du code à barres PDMS moule (figure 1E). Connectez l'autre extrémité des tubesun réservoir d'azote sous pression régulée set-up. Laisser la solution de circuler à travers le moule en utilisant une plage de pression de 0,5-1 psi pendant au moins 6 heures.
        Remarque: Reportez-vous à l'étape (1.3.3) pour toutes les procédures flux-structuration.
  4. Formation de motifs à une dimension de 14 ADNsb
    Remarque: La solution saline tamponnée au phosphate (PBS) utilisée dans les étapes suivantes est préparé à partir de 137 mM de NaCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, et 2 mM de KH 2 PO 4. Le pH du tampon est de 7,4.
    1. Préparer bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3) solution 2 mM dans PBS. Préparer 300 uM de solutions A, B, C et ADNsb (5'-amine modifié, de 80 nucleotides) dans du PBS ou de l'eau ultrapure.
      Remarque: Utilisez la solution de BS3 dans environ 30 min après la préparation, car l'ester hydroxysuccinimide N subit facilement hydrolyse.
    2. Moissonneuse 2,5 pi de 300 pM de A, B, C ou ADNsb avec 2,5 ul de 2 mM de bis (sulfosuccinimidyl) subérate dans du PBS pour chaque canal. A, B, C et l'ADN sont désignés à des canaux 1, 2, et 3, respectivement. Cette commande est également appliqué aux séries restantes de 3 canaux (figure 2A).
    3. Effectuez l'étape (1.3.3). Cette fois, aspirer les solutions BS3 / ADN 5 pi par des broches en acier inoxydable et dans le tuyau de polyéthylène, puis quelques moule PDMS à la source d'azote. Laisser la solution BS3 / ADN de circuler à travers le moule de codes à barres pendant environ 40 min ou jusqu'à ce que les canaux sont remplis.
    4. Arrêter l'écoulement une fois tous les canaux sont remplis, puis incuber la solution BS3 / ADN dans le code à barres à la température ambiante pendant 2 heures. Ne laissez pas la solution à sécher. Cuire le moule PDMS avec toboggan de codes à barres attachée pendant 1 heure à 75 ° C.
      Remarque: Pour faciliter le réglage dans des étapes ultérieures d'écoulement formation de motifs, les bords de la configuration de canal sur le coulisseau de code à barres peuvent être décrites. Ceci est fait en grattant soigneusement la surface de verre en utilisant un diamant Scribe pour générer des marqueurs d'alignement sur le bas de la lame de verre. Alignement dans les étapes ultérieures du protocole peut être vérifiée sous un microscope.
    5. Retirer le moule PDMS de la diapositive de codes à barres. Lavez doucement la lame avec 0,01% de SDS une fois et trois fois avec de l'eau ultra-pure.
      1. Séchez la diapositive de codes à barres en utilisant un fileur de lame de microscope. Stocker le coulisseau de codes à barres dans un tube à centrifuger de 50 ml propre pour une utilisation ultérieure.

2. Validation du modèle unidimensionnel sur la diapositive Barcode

Remarque: Ce protocole de validation peut également être adapté pour une utilisation dans l'évaluation de la qualité des étapes ultérieures de mise en forme de flux.

  1. Le blocage de la coulisse
    1. Préparer une% de sérum albumine bovine (BSA) dans du PBS. Filtrer cette solution à travers un filtre à seringue de 0,45 um avant utilisation. En utilisant une pointe de chargement de gel, appliquer 50 pl de solution de BSA à 1% à un bord de la lame de code à barres.
    2. Incuber la BSA solut 1%Ion pour 1 heure à température ambiante.
  2. L'incubation avec Cyanine 3 (Cy3) conjugué à de l'ADN complémentaire
    1. Préparer un cocktail de A ', B', C et les oligonucleotides «conjugué à Cy3 à une extrémité. Les séquences de A ', B' et C 'sont complémentaires de celles de A, B, et C, respectivement. La concentration de travail de l'ADN-Cy3 est de 0,05 uM à 0,1% de BSA.
    2. Retirer la solution de BSA à partir de la diapositive par pipetage, puis appliquer 30 ul de la solution d'ADN cocktail sur le même bord de la glissière. Incuber le cocktail Cy3-ADN sur la diapositive à température ambiante pendant 1 heure. Effectuez cette étape d'incubation dans l'obscurité pour protéger le groupement Cy3 de photoblanchiment.
  3. L'analyse de l'intensité de fluorescence
    1. Introduire à la pipette sur le cocktail Cy3-ADN et laver la lame dans 1% de BSA, PBS, et enfin dans PBS diluée (1 part PBS avec 50 parties d'eau ultra-pure). Séchez la diapositive à l'aide d'une centrifugeuse.
    2. Observer la fluorescence (figure 2B) en utilisant un microscope à fluorescence ou un scanner de microréseau. Lors de l'utilisation d'un scanner de puces à ADN, régler la longueur d'onde d'émission du laser à 532 nm, la taille du pixel à 5 ​​microns, tube photomultiplicateur (PMT) Gain à 450 et de puissance à 15%.

3. fabrication du réseau à 2 dimensions (3x3) de l'ADN 14

  1. Préparation du code à barres moule PDMS
    1. Exécuter la procédure (1,1) pour construire un autre maître SU-8, mais cette fois l'utilisation d'un masque de chrome avec une configuration d'écoulement perpendiculaire à celui de la première conception. Exécutez la procédure (1.2) pour construire un nouveau moule PDMS avec le motif perpendiculaire.
  2. Un motif d'écoulement à deux dimensions de l'ADNsb
    1. Pour un tableau 3 x 3, préparer 150 um solutions de stockage de A'-i, ii, B'-C'-iii, iv A'-, B'-V, C'-vi, A'-VII, B'ADN -VIII et C'-IX dans 3% de BSA / PBS. Ces oligonucléotides servent de "séquences de transition" (figure 2A). On combine les solutions d'oligonucléotides (solutions 1 à 3) de sorte que la concentration de travail est de 50 uM de chaque oligonucleotide. Utilisez le guide fourni dans le tableau 1.
    2. Débit 3% de BSA / solution de blocage PBS dans les 20 canaux pendant 1 h à 0,5-1 psi.
    3. Solutions de débit 1, 2, 3 et dans les canaux 1, 2 et 3, respectivement. Suivez cet ordre pour les séries subséquentes de 3 canaux. Le débit est généralement complété dans environ 40 min. Incuber les solutions d'ADN à température ambiante pendant 2 heures pour permettre à l'ADN hybride.
    4. Débit 3% de BSA / solution de blocage PBS dans les 20 canaux pendant 1 h à 0,5-1 psi pour éliminer l'ADN non hybridée. Décollez la dalle PDMS, et laver la lame de puces à ADN résultant en plongeant la lame de verre dans 3% de BSA / PBS une fois et deux fois par PBS, suivi par PBS dilué (1 partie PBS et 50 parties d'eau ultra-pure). réry la diapositive en utilisant un fileur de lame de microscope.
    5. Effectuer une deuxième étape de validation (figure 2C) similaire à celle de la section 2. Utilisez oligonucléotides i 'à IX »qui sont conjugué à Cy3. Stocker la matrice 3 x 3 diapositive dans un tube à centrifuger de 50 ml pour une utilisation ultérieure.
      Remarque: La puce à ADN peut être conservé à température ambiante dans un dessiccateur pendant des mois.

4. Conversion de l'ADN matrice 3 x 3 dans un tableau Anticorps

  1. Préparation d'anticorps-oligonucléotides (DEAL) conjugués
    1. Préparer des solutions de 200 mM de succinate de 4-formylbenzoate-(S-4FB) et 40 mM de succinimidyl-6-hydrazinonicotinamide (HYNIC-S) anhydre dans du N, N-diméthylformamide (DMF).
    2. Préparer jusqu'à 7 solutions séparées d'anticorps de capture (1 mg / ml) dans du PBS.
      Remarque: Si les solutions d'anticorps contiennent de l'azoture de sodium actions bactériostatique, réaliser un échange de tampon avec PBS en utilisant rotation dessalage columns avec 7 kDa de poids moléculaire de coupure (MWCO).
    3. Préparer des solutions séparées de 400 uM de i ', II', III ', IV', V ', VI', et VII 'ADN. Attribuez à chaque anticorps de capture d'une séquence d'oligonucléotide. Combinez 40 pl de l'ADN de 400 uM avec 12,25 pi de DMF dans des microtubes et centrifuger pour bien mélanger.
      1. Pour chaque solution ADN / DMF, ajouter 2,3 pi de 200 mM S-4FB dans le DMF. Pour chaque 100 ug d'anticorps de capture, ajouter 2,25 ul de 40 mM de S-HYNIC dans du DMF.
    4. Incuber les solutions / S-HYNIC et l'ADN / S-4FB anticorps pendant 4 heures à la température ambiante.
    5. En vue de la réaction de couplage anticorps-ADN, préparer de nouvelles colonnes de dessalage de spin (un pour chaque solution d'ADN et l'autre pour chaque anticorps) en les lavant avec du tampon citrate à pH 6.
    6. Après 4 heures d'incubation, effectuer l'échange de tampon pour chaque anticorps / S-HYNIC et la solution ADN / S-4FB. Combinez le S-4FB conjugué i ', II', III ', IV', V ', VI', et VII 'oligonucleotides avec des conjugués anticorps-S-HYNIC. Incuber les mélanges pendant 2 heures à température ambiante.
    7. Incuber la réaction O / N à 4 ° C.
  2. Purification de l'anticorps-oligonucléotides (DEAL) conjugués
    Remarque: Pour purifier les conjugués anticorps-oligonucléotide, effectuez chromatographie liquide rapide de protéines (FPLC) sur un système FPLC équipé en standard d'une colonne Superose 6 10/300 GL.
    1. Régler la longueur d'onde du détecteur UV du système FPLC à 280 nm. Utilisation isocratique débit de PBS (pH 7,4) à 0,3 ml / min pour séparer les conjugués d'anticorps à partir de l'oligonucléotide-ADN-S 4FB excès.
    2. Réunir les fractions contenant le conjugué et concentrer les fractions à un volume de 150 pi en utilisant des filtres de spin avec un 10 kDa MWCO.
  3. Un motif bidimensionnel d'anticorps
    1. Préparer un autre moule PDMS avec microchambres ou US micro-puitsING procédés de fabrication à l'étape (1.2). Le moule PDMS peut contenir microlitre aux puits nanolitre pour immunoessais.
      Remarque: Pour la détection de biomarqueurs dans des échantillons fluidiques générale, un moule PDMS avec plusieurs puits est accouplé avec la glissière de tableau. Les caractéristiques du moule PDMS dépendent du système à l'étude. Par exemple, la détection de protéines à partir d'expériences de cellules individuelles peut être effectué avec un moule PDMS contenant microchambres avec des volumes de 0,15 nl.
    2. (Facultatif) Soumettre le moule PDMS au plasma de nettoyage (18 W) pendant 1,5 minutes pour rendre sa surface hydrophile à motifs. Avant le nettoyage au plasma, utiliser du ruban adhésif pour bloquer toutes les autres surfaces qui seront directement lié à la matrice coulissant 3 x 3.
      Remarque: L'étape (4.3.2) est facultatif, mais est généralement réalisée lorsque le moule PDMS est destiné à être utilisé dans des expériences de cellules uniques.
    3. Accoupler le moule PDMS avec le tableau coulissant 3 x 3, puis bloquer la lame avec 1% de BSA dans PBS. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Meanwhile, préparer un cocktail (200 volume final pi) de conjugués anticorps-oligonucléotide. La concentration de travail de chaque conjugué est de 10 ug / ml dans du BSA à 1% / PBS.
    4. Ajouter le cocktail anticorps-oligonucléotide, puis incuber pendant 1 heure à 37 ° C pour permettre le fragment oligonucléotidique des conjugués d'hybrider avec des points spécifiques sur les matrices 3 x 3, convertissant ainsi la puce à ADN à une puce à anticorps.
    5. Répétez l'étape (3.2.4) pour nettoyer et sécher la diapositive. La sensibilité la plus élevée peut être obtenue si le tableau d'anticorps est utilisé immédiatement. L'entreposage prolongé peut entraîner une perte de la sensibilité.
  4. Détection de protéines
    1. Reconstituer protéines recombinantes ou préparer un échantillon de cellules filtré.
    2. Compagnon de la puce avec une puce conçue sur mesure, et de bloquer la surface avec 3% de BSA dans PBS pendant 1 h. Ensuite, retirer la solution BSA, et appliquer des échantillons et incuber pendant 2 heures.
    3. Laver les échantillons en utilisant 3% de BSA dans PBS à trois reprises, uneD puis ajouter anticorps de détection à une concentration fournies par la fiche produit. Incuber pendant 2 heures.
    4. Laver les anticorps de détection par 3% de BSA dans PBS à trois reprises, puis ajoutez Cyanine 5 (Cy5) -streptavidin à 1 pg / ml, suivie d'une incubation pendant 1 h.
    5. Répétez l'étape (3.2.4) pour nettoyer et sécher la lame pour la numérisation.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les dessins des moules PDMS (figure 1A-1B) ont été établis à l'aide d'un logiciel de CAO (AutoCAD). Deux conceptions montrées canaux longs pour motif d'écoulement, une horizontale et une verticale. Les parties gauche et droite de chaque modèle sont symétriques; l'un d'eux pourrait être entrées ou sorties. Chacun des 20 canaux est sinueuse d'un bout tout le chemin à l'autre extrémité. Chaque dessin est imprimé sur un photomasque de chrome (figure 1C). Le ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conception de modèle de Flow est la première étape critique dans la fabrication de la puce 2-D. Pour générer deux motifs d'ADN qui se chevauchent sur ​​un substrat en verre, les caractéristiques de canal de la première conception doivent être perpendiculaires à celles de la seconde (figure 1A-B). Les dessins considèrent également les applications en aval de la puce. Dans le cas de l'analyse d'une seule cellule, la puce à ADN est utilisée pour détecter des protéines provenant de cell...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrent à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier le fonds de démarrage de SUNY Albany et l’accès aux installations du Centre de recherche sur le cancer de l’Université d’Albany.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sylgard 184 base en élastomère de siliconeDow Corning3097366-1004
Sylgard 184 agent de durcissement en élastomère de siliconeDow Corning3097358-1004
SU-8 2025 photoresistMicroChemY111069
Plaquettes de silicium  ;University Wafers452
Lames de verre revêtues de poly-L-lysineThermo ScientificC40-5257-M20
OligonucléotidesIntegrated DNA Technologies*Commandé sur mesure auprès d’Integrated DNA Technologies, voir Tableau 2.
Solution mère d’adhésif poly-L-lysine NewcomerSupply1339
Bis (sulfosuccinimidyl) subérate  ; (BS3)Thermo Scientific21585
1x Saline tamponnée au phosphate, pH 7,4Qualité Biologique114-058-101
Ä ; kta Explorer 100 Système de chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC)GE (Amersham Pharmacia)  ;18-1112-41
Superose 6 10/300 GL colonneGE Healthcare Life Sciences17-5172-01
Capture des anticorpsdivers*sélection des anticorps dépend de l’application
Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic)SolulinkS-1002
Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB)SolulinkS-1004
N,N-diméthylformamideSigma-Aldrich227056
Acide citrique anhydreAcros42356
Hydroxyde de sodiumFisher ScientificS318
Amicon Ultra filtre de spin 10 kDa MWCOEMD MilliporeUFC201024
Revêtement de centrifugationLaurell TechnologiesWS-650-MZ
Poinçon de biopsie avec piston (1,0 mm de diamètre)Ted Pella, Inc.15110-10
Scribe diamant (Style 60)SPI fournit6004
TriméthylchlorosilaneSigma Aldrich92361
La

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
  2. Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
  3. Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
  4. Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
  5. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
  6. Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
  7. Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
  8. Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
  9. Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
  10. Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
  11. Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
  13. Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499(2014).
  14. Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
  15. Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
  16. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
  17. Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
  18. Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Flow PatterningAntibody MicroarrayDNA Antibody ConjugatesPDMS Mold FabricationSingle Cell AnalysisSU 8 MasterPerpendicular Flow PatternMicroarray ValidationBiomarker DetectionCell Signaling Studies

Articles connexes