Modélisation chimiothérapie leucémie résistant In Vitro

Résumé

Le présent rapport résume un protocole qui peut être utilisé pour modéliser l’influence de la niche du microenvironnement de la moelle osseuse sur les cellules leucémiques en mettant l’accent sur l’enrichissement de la sous-population la plus chimiorésistante.

Résumé

Il est bien établi que le microenvironnement de la moelle osseuse fournit un site unique de sanctuaire pour les maladies hématopoïétiques qui initient et progressent dans ce site. Le modèle présenté dans le présent rapport utilise les cellules stromales primaires de la moelle osseuse humaine et les ostéoblastes comme deux types de cellules représentatives de la niche de la moelle osseuse qui influencent le phénotype des cellules tumorales. Les conditions de co-culture in vitro décrites pour les cellules leucémiques humaines avec ces composants de niche primaires soutiennent la génération d’une sous-population chimiorésistante de cellules tumorales qui peuvent être efficacement récupérées à partir de la culture pour être analysées par diverses techniques. Un programme d’alimentation strict pour prévenir les flux de nutriments, suivi de particules de dextran réticulé (G10) de type gel, la récupération de la population de cellules tumorales qui ont migré sous les cellules stromales adhérentes de la moelle osseuse (BMSC) ou les ostéoblastes (OB), générant une population de cellules tumorales « dim de phase » (), fournit une source constante de cellules leucémiques résistantes au traitement purifié. Cette population de cellules tumorales cliniquement pertinente peut être évaluée par des méthodes standard pour étudier les voies de régulation apoptotiques, métaboliques et du cycle cellulaire, ainsi que pour fournir une cible plus rigoureuse dans laquelle tester de nouvelles stratégies thérapeutiques avant les investigations précliniques ciblant la maladie résiduelle minimale.

Introduction

L’objectif global de la méthode décrite est de fournir une approche in vitro efficace et rentable qui soutient l’étude des mécanismes qui sous-tendent la survie des cellules leucémiques soutenue par la moelle osseuse pendant l’exposition à la chimiothérapie. Il est bien documenté que les cellules tumorales résiduelles survivantes qui persistent après le traitement contribuent à la rechute d’une maladie souvent plus agressive que celle au moment du diagnostic et qui est souvent traitée moins efficacement^1-8. Les modèles qui incluent des cellules leucémiques isolées, tels que ceux limités à la culture de cellules dans des milieux uniquement, pour tester des approches thérapeutiques, ne tiennent pas compte de ces signaux critiques, ni de l’hétérogénéité de la maladie qui se produit en réponse à la disponibilité d’indices dérivés de niche dans lesquels les sous-populations de cellules tumorales ayant des interactions très spécifiques avec des cellules de niche tirent une protection accrue. Les modèles standard de co-culture 2D qui co-cultivent des cellules stromales dérivées de la moelle osseuse et des cellules leucémiques ont quelque peu abordé la contribution de la niche de la moelle osseuse et ont montré que l’interaction avec les cellules du microenvironnement de la moelle osseuse augmente leur résistance à la chimiothérapie et modifie leurs caractéristiques de croissance^9-14. Cependant, ces modèles ne parviennent souvent pas à récapituler la survie à long terme des cellules tumorales et n’informent pas avec précision les résultats associés aux populations de cellules leucémiques les plus résistantes qui contribuent à la MRM. Les modèles in vivo restent essentiels et définissent la « référence » pour l’investigation de thérapies innovantes avant les essais cliniques, mais ils sont souvent mis à l’épreuve par le temps et le coût nécessaires pour tester des hypothèses liées aux tumeurs résistantes et à la rechute de la maladie. En tant que tel, le développement de modèles 2D plus informatifs serait bénéfique pour les études pilotes afin de mieux éclairer la conception préclinique ultérieure basée sur des murins.

Le modèle 2D in vitro présenté dans ce rapport n’a pas la complexité du véritable microenvironnement in vivo, mais fournit un moyen rentable et reproductible d’interroger les interactions tumorales avec le microenvironnement qui se prête spécifiquement à l’enrichissement de la sous-population chimiorésistante de cellules tumorales. Cette distinction est précieuse car l’évaluation de l’ensemble de la population de cellules tumorales peut masquer le phénotype d’un groupe mineur de cellules tumorales résistantes au traitement qui constituent la cible la plus importante. Un avantage supplémentaire est l’évolutivité du modèle pour s’adapter à l’analyse d’intérêt. Des cultures en vrac peuvent être établies pour les analyses nécessitant une récupération significative des cellules tumorales, tandis que des co-cultures à petite échelle dans des plaques multipuits peuvent être utilisées pour des analyses basées sur la PCR ou des évaluations basées sur la microscopie.

Sur la base de ce besoin, nous avons développé un modèle in vitro pour tenir compte de l’hétérogénéité de la maladie caractéristique de la leucémie lymphoblastique aiguë (LAL) de lignée B. Nous démontrons que les cellules LAL, qui partagent de nombreuses caractéristiques en commun avec leurs homologues sains, se localisent dans des compartiments distincts de BMSC ou de co-culture OB. Trois populations de cellules tumorales sont générées qui ont des phénotypes distincts qui sont précieux pour l’étude de la réponse thérapeutique. Plus précisément, nous démontrons que les cellules (LAL) récupérées de la population de co-culture sont systématiquement réfractaires au traitement avec une survie qui se rapproche des cellules tumorales qui n’ont pas été exposées à des agents cytotoxiques. Ces cellules LAL, qu’elles proviennent de lignées cellulaires établies ou d’échantillons primaires de patients, migrent sous les cellules stromales adhérentes ou les couches d’ostéoblastes, mais peuvent être capturées après trypsinisation des cultures et séparation des types cellulaires par l’utilisation de colonnes de particules de dextran réticulé (G10) de type gel¹⁰.

Ici, nous présentons une configuration de co-culture 2D qui peut être utilisée pour modéliser les interactions entre les cellules stromales du microenvironnement de la moelle osseuse (BMSC/OB) et les cellules leucémiques. L’observation selon laquelle les cellules leucémiques forment trois sous-populations spatiales par rapport à la monocouche de cellules stromales et que la population de la MP représente une population tumorale résistante à la chimiothérapie en raison de son interaction avec le BMSC ou l’OB est particulièrement importante. De plus, nous montrons comment isoler efficacement les populations de cellules leucémiques par des colonnes G10. Il convient de noter que nous avons constaté que l’isolement de ces sous-populations permet une analyse en aval de la population de MP la plus résistante afin de déterminer les modes potentiels de résistance conférés à ces cellules en raison de leur interaction avec les cellules stromales ou les ostéoblastes du microenvironnement de la moelle osseuse. Les techniques que nous avons utilisées en aval de ce modèle de co-culture et d’isolement comprennent l’évaluation par cytométrie en flux, l’analyse protéomique et l’évaluation ciblée de l’expression des protéines, ainsi que l’ablation laser, l’ionisation par électronébulisation (LAESI) et l’analyse Seahorse pour évaluer les profils métaboliques. En utilisant ce modèle en combinaison avec les techniques ci-dessus, nous avons constaté que la population de cellules leucémiques de la MP a un phénotype résistant à la chimiothérapie qui est unique par rapport aux cellules leucémiques cultivées dans des milieux seuls ou à celles récupérées dans les autres sous-populations de la même co-culture. En tant que tel, ce modèle se prête à une évaluation plus rigoureuse pour tester des stratégies ciblant les cellules leucémiques les plus résistantes à la chimiothérapie qui tirent leur phénotype résistant de l’interaction avec le microenvironnement de la moelle osseuse.

Protocole

1. Préparation avancée

1. Préparation de particules G10 dextran.
   1. Préparer G10 suspension en ajoutant 50 ml de PBS 1x à 10 g de particules G10. Mélanger par inversion et permet G10 se déposer de tampon phosphate salin (PBS) à 4 ° CO / N.
   2. Le jour du G10 colonne de séparation, aspirer PBS à partir de particules G10 installés et ajouter 50 ml PBS frais. Mélanger par inversion. Répéter deux fois, en ajoutant 50 ml PBS frais à particules G10 sédentaires et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de servir.
2. Cultivant BMSC et OB.
   1. Maintenir à la fois BMSC ou OB à 37 ° C dans 6% de CO ₂ et 10 cm cultivées sur des plaques de culture tissulaire jusqu'à 90% de confluence est atteinte.
   2. Trypsiniser BMSC ou cellules OB et divisés 1: 2 sur de nouvelles plaques cm 10. Les cellules sont cultivées à ces normes jusqu'à son utilisation pour la co-culture leucémique.

2. Établir et maintenir des Co-culture

1. Ajouter 5-20 x 10 ⁶ cellules leucémiques in 10 ml de milieu de culture spécifique de la tumeur sur un 80% -90% de confluence BMSC ou plaque d'OB.
   NOTE: Notre laboratoire maintient co-cultures à 37 ° C dans 5% de O ₂ pour mieux récapituler le microenvironnement de la moelle osseuse qui a été montré à la gamme de 1% à 7% ^{de 16 à 18.} Toutefois, le maintien des co-cultures à cette tension d'oxygène est pas critique pour la mise en place des trois sous-populations leucémiques et est à la discrétion du laboratoire.
2. Chaque 4 ^{e jour} supprimer tout sauf 1 ml de médias (y compris les cellules leucémiques en suspension) et le remplacer par 9 ml frais milieux de culture leucémique. Lors du retrait de 9 ml de milieu de la plaque, veiller à ne pas perturber la couche adhérente BMSC ou OB.
   1. Retirez le support en inclinant la plaque sur le support latéral et aspirer dans le coin de la plaque. En outre, lors de l'ajout du milieu frais, veillez à ajouter goutte à goutte dans le coin de la plaque contre la paroi latérale pour assurer une perturbation minimale de la couche adhérente BMSC ou OB.
3. Après le 12 ^{e jour de} co-culture, rincer les cellules leucémiques de BMSC ou couche de OB par pipetage des milieux de culture de plat et doucement sur ​​le plat d'environ 5 à 10 fois, puis recueillir dans 15 ml tube conique. Réensemencer sur un nouveau 80% -90% de confluence BMSC ou plaque OB comme décrit dans l'étape 2.1.
   NOTE: Le rinçage doux de la co-culture tel que décrit dans l'étape 2.3 va éliminer les cellules leucémiques S et PB sans perturber la monocouche BMSC ou OB. Ceci permet que des cellules tumorales devant être transférées à la plaque de co-culture suivante. Ce cycle de 12 jours peut être répétée autant de fois que nécessaire en fonction des besoins des utilisateurs.

3. Préparer les colonnes perles G10

NOTE: Si l'analyse ou la culture aval stérile est nécessaire après la séparation de la colonne G10 les étapes suivantes doivent être effectuées en utilisant une technique stérile et colonnes du G10 devraient être mis en place dans une hotte biologique stérile.

1. Pré-warm milieux de culture de cellules à 37 ° C dans un bain d'eau (~ 30 ml par colonne). En utilisant une seringue de 10 ml à usage unique, enlever et jeter plongeur. Ajouter la laine de verre de la seringue.
2. En utilisant une pince à épiler, séparer la laine de verre en fines mèches en vrac. Ajouter plusieurs couches de laine de verre légèrement tassée à la seringue jusqu'à 2/3 de la seringue est rempli de laine de verre.
   NOTE: La laine de verre est crucial pour empêcher les particules G10 lâches de contaminer la collecte de cellules leucémiques. Assurez-vous que la laine de verre est emballé assez pour soutenir les particules G10, mais pas trop dense pour bloquer l'écoulement de médias à travers la colonne.
3. Fixez 1 voie robinet à la pointe de la seringue dans la position fermée.
4. colonne de seringue de serrage à bague reposer suffisamment élevée pour un tube conique de 50 ml (tube de collecte) peut être placé sous le robinet. Placez le tube de collecte dans la colonne de la seringue.
5. En utilisant une pipette de 10 ml ajouter, goutte à goutte, des particules G10 remises en suspension dans PBS à la colonne au-dessus dela laine de verre. Continuez à ajouter des particules G10 jusqu'à ce qu'un ml culot ~ 2 (tel que mesuré par des graduations sur la seringue) du G10 particules formes au-dessus de la laine de verre.
6. Équilibrer la colonne G10 avec les médias préchauffées.
   1. Ajouter 2 ml de milieu préchauffée à la colonne. robinet d'arrêt ouvert lentement, de sorte que le support sort de la colonne, goutte à goutte.
   2. Répétez l'étape 3.6.1 jusqu'à un total de 10 ml de milieu préchauffé ont été couru à travers la colonne.
      NOTE: Si des particules du G10 sont vus dans l'écoulement à travers dans le tube de collecte, soit 1) ajouter plus de particules du G10 à maintenir ~ 2 ml culot faire en sorte qu'aucune particule G10 supplémentaires échapper à la colonne ou 2) remplacer la colonne avec un un utilisé et répétez étapes 3.4-3.6.1.
   3. Après les drains des médias préchauffées de la colonne, fermer le robinet d'arrêt et jeter le tube collecteur d'écoulement à travers. Ajouter un nouveau tube de prélèvement dans la colonne. La colonne est prêt à être chargé avec un mélange de médias + cellulaire.
      NOTE: Les Colonnesdoit être utilisé immédiatement et ne laisse sécher.

4. Séparation des 3 sous-populations au sein de co-culture

1. Collection sous-population de la suspension (S) de la tumeur.
   1. Aspirer le milieu de la plaque de co-culture avec la pipette et doucement appliquer de nouveau les mêmes médias pour rincer la plaque et de recueillir les médias contenant des cellules leucémiques dans un tube de 15 ml conique. Les cellules leucémiques recueillies sont la sous-population S.
2. Collection de la phase Bright (PB) sous-population de la tumeur.
   1. Ajouter 10 ml du milieu frais de retour sur la plaque de co-culture. Rincer vigoureusement par pipetage médias ajoutée de haut en bas environ 5 fois pour éliminer les cellules leucémiques adhérentes, mais pas assez fort pour déloger adhérente BMSC / OB composant.
   2. Aspirer à la pipette et recueillir les médias dans un tube conique de 15 ml. Les cellules recueillies sont la sous-population PB.
3. Collection de la phase Dim (PD) sous-population de la tumeur.
   1. plaque rinçage avec 1 ml de PBS à remmédias restants ove. Trypsiniser plaque co-culture avec 3 ml de trypsine et le lieu dans 37 ° C incubateur pendant 5 min.
   2. Retirer la plaque de l'incubateur et tapotez doucement côtés de la plaque pour déloger adhérente BMSC / OB.
   3. Ajouter 1 ml de sérum de veau fœtal (FBS) et la pipette de haut en bas 3-5 fois pour briser les grands agrégats de cellules.
   4. Collecter des supports avec les cellules dans un tube conique de 15 ml. Ces cellules sont la sous-population de PD non purifié avec BMSC / OB ainsi.
4. sous-populations centrifugeuse 3 isolé à 400 g pendant 7 min. Aspirer et éliminer le surnageant puis remettre en suspension individuellement pastilles dans 1 ml de médias préchauffées. Les cellules sont prêtes à être chargées sur une colonne G10.

5. Chargement de co-culture des cellules sur la colonne G10

NOTE: Assurez-vous que le robinet est complètement fermé avant d'ajouter les cellules des milieux contenant la colonne G10. En outre, chaque sous-population doit être exécuté sur une colonne G10 séparée afin de ne pas Introduce toute polarisation entre les populations dans l'analyse en aval.

1. En utilisant une pipette de 1000 pi, ajouter 1 ml de chaque sous-population de cellules dans des milieux préchauffées à une colonne séparée G10 goutte à goutte. Assurez-vous que le support contenant les cellules reste au-dessus ou au sein du G10 culot. Laisser les cellules incuber le G10 culot pendant 20 min à température ambiante.
   NOTE: Robinet reste fermé pendant la durée de l'incubation.

6. Recueillir les cellules leucémiques du G10 Colonne

1. Ajouter 1-3 ml de milieu préchauffé à chaque colonne G10. Ouvrir robinet d'arrêt et de permettre aux médias de sortir lentement la colonne goutte à goutte.
   NOTE: Il est essentiel de maintenir un débit lent de la colonne ou le culot G10 contenant BMSC / OB peut laver de la colonne et de contaminer les cellules leucémiques isolées.
2. Continuer à ajouter des médias préchauffées par petits incréments (1-2 ml) à la colonne de G10 jusqu'à un total de 15 à 20 ml a traversé la colonne et a été recueilli. Fermer le robinet vatube de collecte LVE et le bouchon.
   NOTE: Si un culot G10 de particules est observée à la base du tube de collecte, retirez délicatement les médias du tube laissant culot de particules G10 intact et le transfert dans un nouveau tube.
3. Centrifugeuse recueilli médias à 400 g pendant 7 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans un tampon approprié pour application en aval.
4. Les cellules sont maintenant une population pure de cellules leucémiques libres de BMSC ou contamination OB et sont prêtes à être appliquées à des applications en aval, à la discrétion de l'utilisateur.
   NOTE: la viabilité cellulaire leucémique devrait rester inchangée lors du passage des cellules à travers des colonnes du G10.

Résultats

Installation réussie et la culture de ce modèle de co-culture se traduira par la création de 3 sous-populations de cellules leucémiques par rapport à la BMSC ou OB monocouche adhérente. La figure 1 montre comment toutes cellules ensemencées dans une monocouche BMSC apparaissent d'abord comme une seule population de suspension les cellules leucémiques. Au cours des 4 jours cellules leucémiques interagissent avec le BMSC pour former 3 sous-populations de cellules leucémiqu...

Discussion

maladie résiduelle minimale (MRD), qui contribue à la rechute de la maladie continue à être un défi clinique majeure dans le traitement de réfractaires agressive ALL, ainsi que, une foule d'autres hémopathies malignes. Le microenvironnement de la moelle osseuse est le site le plus fréquent de rechute chez ALL ^3,8. En tant que tel, les modèles qui modélisent le microenvironnement de la moelle osseuse sont des outils indispensables pour tester des hypothèses relatives à la survie des cellules tumorales leuc...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Perles de sephadex G10	Sigma	G10120	Désigné dans le manuscrit comme gel type 10 particules de dextran réticulées
Seringue stérile 10 ml BD		309604
Laine de verre	Pyrex	3950
robinets d’arrêt à 1 voie	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
Tubes à centrifuger coniques de 50 ml	World Wide Medical Products	41021039	Utilisés comme tubes de prélèvement
Tubes à centrifuger coniques de 15 ml	World Wide Medical Products	41021037	Utilisés pour la collecte de cellules
Sérum de veau fœtal	Sigma	F6178
0,05 % Trypsine  ;	Mediatech, Inc.	25-053-CI
Plats de culture cellulaire 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	664160
forts
Milieux de culture ostéoblastiques  ;	PromoCell	C-27001	Pour les milieux ostéoblastiques humains  ;
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	Pour la préparation des milieux tumoraux
Lignées cellulaires
Cellules adhérentes :Ostéoblastes humains
Ostéoblastes humains	PromoCell	C-12720	été cultivés selon le fournisseur' recommandations.
		stromales	primaires anonymisées de leucémie humaine et des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) ont été fournies par le Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core et la banque de tissus du département de pathologie de l’Université de Virginie-Occidentale. Les cultures BMSC ont été établies comme décrit précédemment (*)
leucémiques fortes :
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	cellules REH ont été cultivées selon le fournisseur' et les médias recommandés.
Les SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 ont été cultivés selon les et les médias recommandés.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Perturbation de la fonction des cellules stromales de la moelle osseuse par l’étoposide. Greffe de moelle sanguine Biol J Am Soc Greffe de moelle sanguine. 1997 août ; 3(3) :122&ndash ;32.