Modélisation chimiothérapie leucémie résistant<em&gt; In Vitro</em

Résumé

Le présent rapport résume un protocole qui peut être utilisé pour modéliser l’influence de la niche du microenvironnement de la moelle osseuse sur les cellules leucémiques en mettant l’accent sur l’enrichissement de la sous-population la plus chimiorésistante.

Résumé

Il est bien établi que le microenvironnement de la moelle osseuse fournit un site unique de sanctuaire pour les maladies hématopoïétiques qui initient et progressent dans ce site. Le modèle présenté dans le présent rapport utilise les cellules stromales primaires de la moelle osseuse humaine et les ostéoblastes comme deux types de cellules représentatives de la niche de la moelle osseuse qui influencent le phénotype des cellules tumorales. Les conditions de co-culture in vitro décrites pour les cellules leucémiques humaines avec ces composants de niche primaires soutiennent la génération d’une sous-population chimiorésistante de cellules tumorales qui peuvent être efficacement récupérées à partir de la culture pour être analysées par diverses techniques. Un programme d’alimentation strict pour prévenir les flux de nutriments, suivi de particules de dextran réticulé (G10) de type gel, la récupération de la population de cellules tumorales qui ont migré sous les cellules stromales adhérentes de la moelle osseuse (BMSC) ou les ostéoblastes (OB), générant une population de cellules tumorales « dim de phase » (), fournit une source constante de cellules leucémiques résistantes au traitement purifié. Cette population de cellules tumorales cliniquement pertinente peut être évaluée par des méthodes standard pour étudier les voies de régulation apoptotiques, métaboliques et du cycle cellulaire, ainsi que pour fournir une cible plus rigoureuse dans laquelle tester de nouvelles stratégies thérapeutiques avant les investigations précliniques ciblant la maladie résiduelle minimale.

Introduction

L’objectif global de la méthode décrite est de fournir une approche in vitro efficace et rentable qui soutient l’étude des mécanismes qui sous-tendent la survie des cellules leucémiques soutenue par la moelle osseuse pendant l’exposition à la chimiothérapie. Il est bien documenté que les cellules tumorales résiduelles survivantes qui persistent après le traitement contribuent à la rechute d’une maladie souvent plus agressive que celle au moment du diagnostic et qui est souvent traitée moins efficacement^1-8. Les modèles qui incluent des cellules leucémiques isolées, tels que ceux limités à la culture de cellules dans des milieux uniquement, pour tes....

Protocole

1. Préparation avancée

1. Préparation de particules G10 dextran.
   1. Préparer G10 suspension en ajoutant 50 ml de PBS 1x à 10 g de particules G10. Mélanger par inversion et permet G10 se déposer de tampon phosphate salin (PBS) à 4 ° CO / N.
   2. Le jour du G10 colonne de séparation, aspirer PBS à partir de particules G10 installés et ajouter 50 ml PBS frais. Mélanger par inversion. Répéter deux fois, en ajoutant 50 ml PBS frais à particules G10 sédentaires et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de servir.
2. Cultivant BMSC et OB.
   1. Maintenir à la fois BMSC ou OB à 37 ° C dans 6% de CO ₂ et 10 cm cultivées sur des....

Résultats

Installation réussie et la culture de ce modèle de co-culture se traduira par la création de 3 sous-populations de cellules leucémiques par rapport à la BMSC ou OB monocouche adhérente. La figure 1 montre comment toutes cellules ensemencées dans une monocouche BMSC apparaissent d'abord comme une seule population de suspension les cellules leucémiques. Au cours des 4 jours cellules leucémiques interagissent avec le BMSC pour former 3 sous-populations de cellules leucé.......

Discussion

maladie résiduelle minimale (MRD), qui contribue à la rechute de la maladie continue à être un défi clinique majeure dans le traitement de réfractaires agressive ALL, ainsi que, une foule d'autres hémopathies malignes. Le microenvironnement de la moelle osseuse est le site le plus fréquent de rechute chez ALL ^3,8. En tant que tel, les modèles qui modélisent le microenvironnement de la moelle osseuse sont des outils indispensables pour tester des hypothèses relatives à la survie des cellules tumorales leuc.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Perles de sephadex G10	Sigma	G10120	Désigné dans le manuscrit comme gel type 10 particules de dextran réticulées
Seringue stérile 10 ml BD		309604
Laine de verre	Pyrex	3950
robinets d’arrêt à 1 voie	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
Tubes à centrifuger coniques de 50 ml	World Wide Medical Products	41021039	Utilisés comme tubes de prélèvement
Tubes à centrifuger coniques de 15 ml	World Wide Medical Products	41021037	Utilisés pour la collecte de cellules
Sérum de veau fœtal	Sigma	F6178
0,05 % Trypsine  ;	Mediatech, Inc.	25-053-CI
Plats de culture cellulaire 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	664160
forts
Milieux de culture ostéoblastiques  ;	PromoCell	C-27001	Pour les milieux ostéoblastiques humains  ;
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	Pour la préparation des milieux tumoraux
Lignées cellulaires
Cellules adhérentes :Ostéoblastes humains
Ostéoblastes humains	PromoCell	C-12720	été cultivés selon le fournisseur' recommandations.
		stromales	primaires anonymisées de leucémie humaine et des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) ont été fournies par le Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core et la banque de tissus du département de pathologie de l’Université de Virginie-Occidentale. Les cultures BMSC ont été établies comme décrit précédemment (*)
leucémiques fortes :
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	cellules REH ont été cultivées selon le fournisseur' et les médias recommandés.
Les SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 ont été cultivés selon les et les médias recommandés.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Perturbation de la fonction des cellules stromales de la moelle osseuse par l’étoposide. Greffe de moelle sanguine Biol J Am Soc Greffe de moelle sanguine. 1997 août ; 3(3) :122&ndash ;32.

ont Des cellules Les