Analyse quantitative de l'expression des protéines pour l'étude de Lineage Spécification dans Souris préimplantatoire d'embryons

Summary

Ce protocole présente un procédé pour effectuer, une seule cellule dans l'analyse quantitative in situ de l'expression des protéines à l'étude de la spécification lignée dans des embryons de pré-implantation de la souris. Les procédures nécessaires pour la collecte des blastocystes, entiers montage détection par immunofluorescence de protéines, l'imagerie d'échantillons sur un microscope confocal, et la segmentation nucléaire et l'analyse d'images sont décrites.

Abstract

Ce protocole présente un procédé pour effectuer quantitative, unicellulaire analyse in situ de l'expression de la protéine à l'étude de la spécification lignée dans les embryons préimplantatoires de souris. Les procédures nécessaires à la collecte des embryons, immunofluorescence, l'imagerie sur un microscope confocal, et la segmentation d'images et l'analyse sont décrits. Cette méthode permet la quantification de l'expression de marqueurs nucléaires multiples et le spatial (XYZ) les coordonnées de toutes les cellules de l'embryon. Il tire profit de MN, un outil logiciel de segmentation d'image spécifiquement développé pour l'analyse des images confocales d'embryons préimplantatoires et les cellules souches embryonnaires (ESC) colonies. MN effectue une segmentation nucléaire non supervisé pour les directions X, Y et Z dimensions, et produit des informations de position de cellule dans l'espace à trois dimensions, ainsi que les niveaux de fluorescence nucléaire pour tous les canaux d'entrée minimale de l'utilisateur. Bien que ce protocole a été optimisée pour l'analyse des imagesde pré-implantatoire des embryons de souris de stade, il peut facilement être adapté à l'analyse de tous les autres échantillons présentant un bon rapport signal sur bruit et où la densité nucléaire à haute constitue un obstacle à la segmentation d'images (par exemple., analyse de l'expression des cellules souches embryonnaires (ESC ) colonies, la différenciation des cellules en culture, les embryons d'autres espèces ou de stades, etc.).

Introduction

L'embryon préimplantatoire de souris est un modèle pour étudier l'émergence et le maintien de la pluripotence in vivo, ainsi que d'un modèle pour l'étude de la spécification du destin cellulaire et de novo épithélialisation chez les mammifères. Les étapes de pré-implantation du développement des mammifères sont dédiés à la mise en place des trois lignées cellulaires qui composent le blastocyste, à savoir l'épiblaste pluripotentes - qui donne lieu à la plupart des tissus somatiques et les cellules germinales - et deux lignées extra-embryonnaires, le trophectoderme (TE) et endoderme primitif (PRE) (figure 1A) ^1,2. Ce protocole décrit les procédures à (1) des embryons de souris récolte et fixer stade préimplantatoire, (2) effectuer immunofluorescence pour marquer des protéines d'intérêt, (3) d'effectuer l'ensemble du montage imagerie utilisant un microscope confocal avec des capacités et des z-sectionnement (4) effectuer la segmentation nucléaire d'images confocale et analyse d'image quantitative ultérieure. Ce pipeline permet til impartiales mesure des niveaux de protéines pour l'attribution des identités de cellules de caractériser les sous-populations de cellules in situ. Ce protocole peut être effectuée en moins de 3 à 4 jours pour un même portée (généralement jusqu'à 10 embryons de souris), de la collecte d'embryons à l'analyse de données (figure 1B). L'analyse simultanée de plusieurs portées augmenterait l'imagerie et l'analyse des données charge de temps, prolongeant ainsi la longueur totale du protocole.

L'embryon de souris au stade préimplantatoire est un système expérimental traitable qui, compte tenu de sa petite taille et la morphologie stéréotypée ^3, est bien adapté pour l'imagerie de toto de processus cellulaires avec une résolution seule cellule. Pour mener à bien un impartiale, l'analyse au niveau des systèmes d'un nombre statistiquement pertinent d'embryons, un système automatisé, d'un pipeline d'analyse quantitative est souhaitable. Cependant, en raison de la densité élevée nucléaire de la masse cellulaire interne (ICM) du blastocyste ( Figure 1A, 2D), les plates-formes de segmentation d'image conventionnels ne parviennent pas à fournir une précision suffisante pour établir un workflow automatisé ou semi-automatisé. D'autre part, la segmentation manuelle, bien que corrects, ne permet pas le traitement de grandes cohortes de cellules et d'embryons, ni approprié pour une détermination objective et reproductible des identités de cellules - ce qui est particulièrement important lorsque l'on étudie les stades de développement, où les modes de marqueur expression n'a pas entièrement résolue (par exemple, ne présentent pas une distribution binaire sur une population). Nous avons récemment développé et validé une méthode de segmentation d'image adaptée aux embryons au stade de pré-implantation de la souris et des cellules de souris embryonnaires souches (CES) qui atteint une grande précision, tout en exigeant utilisateur minimale entrée ^4-8.

Le pipeline d'analyse présentée ici tourne autour de l'outil de segmentation d'image basé sur MATLAB modulaire Interactive segmentation nucléaire (MIN) ^4. MN performs segmentation nucléaire sans surveillance sur des lots importants de Z-piles confocale après que l'utilisateur a établi un nombre minimal de propriétés de l'image, en utilisant une interface utilisateur graphique (GUI) (tableau 1) ^4. Ce pipeline est avéré efficace pour la génération de données à haut débit sur ​​l'expression des protéines et la localisation cellulaire à la fois de type sauvage, expérimentalement traitée et les embryons et les CES ^5-7 génétiquement modifié. Dans le présent protocole, nous décrivons l'application de minutes pour la segmentation d'images d'embryon préimplantatoire stade. Pour des exemples de performances mn à CES s'il vous plaît se référer ^{à 4,7.} L'étape automatisée de segmentation nucléaire permet de réduire considérablement la charge de temps du processus d'identification de cellule, alors que les mesures spatiales et intensité de fluorescence permettent une détermination objective des identités de cellules et la production de cartes en trois dimensions de domaines d'expression génique et la position des cellules dans l'embryon (figure 1C ). Par ailleurs, l'évolutivité de ce flux de travail, il est applicable à l'analyse des portées individuelles à travers de grandes cohortes d'embryons expérimentalement traitées, ou des embryons de différentes origines génétiques ^5,6. MN est disponible gratuitement au http://katlab-tools.org (le logiciel nécessite une licence MATLAB).

Aucune approche développée à ce jour permet la génération de ces données en profondeur sur l'expression des protéines et la localisation cellulaire dans des embryons de pré-implantation de la souris. Toutes les tentatives jusqu'à présent à quantifier ces types de données ont été limitées à la détermination manuelle et la quantification du nombre de cellules pour différentes populations dans l'embryon (soit entièrement manuellement, ou un logiciel assistée) ^9-19. Cette approche (intégrant le logiciel MN) a été adapté et testé sur les embryons et les CES préimplantatoires souris; néanmoins ses performances sur d'autres systèmes à forte densité nucléaire, mais encore non testé, devrait être équivalent.

Protocol

déclaration éthique: Tous les travaux des animaux, y compris l'élevage, l'élevage et le sacrifice a été approuvé par des institutionnels animal soin et l'utilisation Comité de Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC), protocole # 03-12-017.

1. Embryon Collection

Remarque: Tous les travaux de l'animal doit avoir été approuvé par les autorités institutionnelles et locales et conforme aux règles locales et institutionnelles.

1. Accoupler une souris femelle vierge avec un mâle de goujon fertile des génotypes souhaités.
   Remarque: Si la mise en place des accouplements naturels, la sélection des femelles dans la phase oestrus du cycle Estral augmente les chances de la copulation sur la date souhaitée. Si induire une superovulation, s'il vous plaît se référer aux protocoles décrits dans les ^20.
2. Vérifier la présence d'un bouchon vaginal le matin à l'aide d'une sonde mousse. Idéalement, le faire avant midi (12h00), des bouchons de copulation sont perdus pendant la journée. Considérez noon de détection du bouchon vaginal jour embryonnaire (E) 0,5.
3. Le jour et l'heure du développement embryonnaire désiré, réchauffer M2 ou le rinçage support de retenue (FHM) à la température ambiante ou, de préférence, 37 ºC. Remarque: Soit M2 ou FHM peuvent être utilisés pour le rinçage et d'embryons de manutention. Lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation, stocker ces médias à 4 ºC. Estimer l'utilisation de ~ 2 ml de milieu pour chaque utérus.
4. Décongeler paraformaldéhyde 4% (PFA) dans un tampon phosphate salin (PBS) ou de préparer une solution fraîche. Estimer 500 pi de solution à 4% PFA par puits d'une plaque 4 puits. Fixer une portée sur chaque puits d'une plaque 4 puits. Remarque: Alternativement, une plaque de 96 puits peut être utilisé pour fixer et la conservation des embryons. Si vous utilisez une plaque de 96 puits, utiliser 100 pi de solution PFA par puits.
5. Tirez une pipette Pasteur en verre à l'aide d'une flamme nue pour dessiner un fin capillaire à la pointe.
6. Sacrifier femme par dislocation cervicale ou _{inhalation de CO 2,} ou tel que requis par les réglementations locales et institutionnelles. Il est souvent desirable pour confirmer l'euthanasie de l'animal par dislocation cervicale.
7. Pulvériser le ventre de l'animal avec 70% d'éthanol afin de minimiser la perte de cheveux et d'effectuer une incision abdominale, d'abord à travers la peau, puis à travers la paroi du corps (péritoine) pour exposer les viscères.
   Remarque: Les étapes suivantes décrivent la procédure pour recueillir des blastocystes de l'utérus d'une souris femelle enceinte à tout moment entre E3.25 et E4.5 (figure 1A). Pour les protocoles sur la collecte d'embryons préimplantatoires plus tôt que E3.25, reportez-vous ^{à 20.}
8. Localiser l'utérus et de retirer de l'animal. En tenant l'extrémité du col de l'utérus avec une paire de pinces, couper à travers le col de l'utérus et tirez doucement pour étirer les deux cornes utérines.
9. Enlevez le gras de l'utérus, en prenant soin de ne pas percer la paroi utérine. Ceci peut être réalisé facilement au moment de la dépose, tout en restant fixée sur le corps de l'animal, comme l'utérus peut être étendu. Alternativement, ilpeut être fait plus tard, sous un microscope de dissection, en RT PBS. Pour un protocole plus détaillé sur la dissection de l'utérus, voir Protocoles 5 & 8 ²⁰
10. Coupez-dessus des trompes, les ovaires ci-dessous, pour libérer tout l'utérus, les placer sur une boîte de Pétri et couvrir avec du PBS.
    Remarque: Cette étape permet également le lavage de l'excès de sang ou d'autres débris de l'utérus, ce qui facilite blastocyste ultérieure récolte.
11. cornes utérines séparées en coupant à la fois à travers l'extrémité proximale, des deux côtés du col de l'utérus et du col jeter. Séparer chaque oviducte de l'utérus en coupant au-dessous de l'isthme entre elles (figure 1A) se connecte. Transférer les deux cornes d'une goutte de milieu de manipulation (soit M2 ou FHM) pour la collecte et la manipulation des embryons.
12. Sous un microscope de dissection, rincer blastocystes sur l'utérus et dans le milieu en forçant 0,5 - 1 ml de M2 ​​ou FHM dans chaque corne utérine de l'ouverture du col utérin. Utilisez un 1ml seringue avec une aiguille hypodermique. Remarque: L'aiguille peut être émoussée en utilisant une pierre de dépôt pour éviter de déchirer l'utérus, bien que cela ne soit pas critique. Un schéma détaillé de l'utérus rinçage peut être trouvée dans ^21.
13. Utilisation du microscope de dissection, localiser les blastocystes, qui seront dispersés dans la goutte de milieu. Prévoyez un maximum de 1 à 2 min de blastocystes à couler au fond de la boîte après le rinçage. Utilisation de la bouche-contrôlée, Pasteur en verre pipette avec une extrémité capillaire, de collecter toutes les blastocystes et les transférer à une nouvelle baisse des médias.
14. Rincer blastocystes en les déplaçant à travers 2 - 3 gouttes de M2 ​​frais ou FHM. Déplacez embryons en groupes de 5 - 10 blastocystes à la fois.
    Remarque: Déplacement les grands groupes à un moment permettra d'accélérer le processus, mais il permettra également d'augmenter les chances de perdre accidentellement de nombreux embryons. Si non formés à l'utilisation de pipettes de bouche-contrôlée, pratiquer la manipulation d'embryons et le transfert devrait être considéré avant beginning l'expérience.
15. Retirer la zone pellucide (ZP) à partir de blastocystes non éclos (généralement
16. Prenez soin lors de la manipulation des blastocystes dénudées, car ils adhèrent très facilement aux surfaces de verre et de plastique. moyen de manipulation contient 4 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA) pour empêcher la fixation, mais l'acide Tyrode ou PBS ne sont pas, par conséquent, de réduire le risque de dommage ou de perte des embryons ne ramassent pas plus de 2 - 5 blastocystes dénudées à un moment où les manipuler dans PBS BSA-libre ou sans sérum ou de l'acide Tyrode.
    Remarque: Vous pouvez également recouvrir la pipette en verre avec 1% de BSA avant utilisation pour réduire l'adhérence des embryons à la surface du verre.

Napper le fond de chaque puitsd'un 4-même boîte de culture de tissu d'une fine couche de 1% d'agar, 0,9% de NaCl pour empêcher embryons d'adhérer à la matière plastique. En variante, ajouter 4 mg / ml de BSA à la PBS (PBS-BSA).

Remplir un puits de la 4-même boîte de culture tissulaire revêtues avec 500 pl de PBS RT (ou PBS-BSA) et un autre puits avec 500 pl de 4% de PFA dans du PBS.

Rincer blastocystes en RT PBS et fixer dans 4% PFA dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. Transfert à PBS (ou PBS-BSA) après fixation.

Si les embryons ne vont pas être traitées immédiatement, couvrir la PBS contenant les embryons avec une couche d'huile minérale pour éviter l'évaporation (conduisant à la dessiccation de l'échantillon) et stocker la plaque à 4 ° C.
Remarque: Les méthodes et les temps de fixation différentes peuvent être utilisées en fonction de l'expérience, les epitopes d'intérêt et les anticorps à utiliser. Quelle que soit la méthode de choix, être cohérent tout au long des expériences équivalentes pour faciliter la comparaison ultérieure des résultats de la coloration.
Note: Pausepoint: Les embryons peuvent être conservés à 4 ° C dans du PBS pendant plusieurs semaines avant de procéder à l'étape suivante. Assurez-PBS est stérile et / ou ajouter 100 U / ml de pénicilline + 100 pg / ml de streptomycine (Pen-Strep) pour prévenir la contamination bactérienne (en particulier lors de l'utilisation du PBS-BSA) en prévision d'un stockage prolongé.

2. immunofluorescence

1. Effectuer immunofluorescence en utilisant un protocole qui a déjà été testées et éprouvées pour être robuste pour toute monture immunofluorescence. Note: Nous vous recommandons ceux décrits dans ^{22 et 11.} Dans le présent article, l'ancien sera décrite. Quelle que soit la méthode de choix, être cohérent tout au long des expériences équivalentes pour faciliter la comparaison des résultats de la coloration.
2. Utilisez un flexible, vinyle, U-plaque de fond clair, 96 puits pour effectuer les étapes successives du protocole d'immunofluorescence. Remplir chaque puits avec 50 - 100 pi de solution et déplacer les embryons d'une solutionà l'autre en utilisant une pipette bouche en forme de L. Remarque Cette approche réduit l'utilisation de réactifs et facilite les mesures de suivi ainsi que la coloration en parallèle de plusieurs groupes expérimentaux.
   1. Facultatif: Enduire le fond des puits d'une fine couche de 1% d'agar, 0,9% de NaCl pour empêcher l'adhérence des embryons à la matière plastique. Ne pas ajouter de BSA aux solutions d'immunofluorescence.
3. Préparer PBX (0,1% de Triton X-100 dans du PBS). Si anticiper la performance de plusieurs expériences d'immunofluorescence, préparer 50 ml de PBX et conserver à 4 ° C entre les expériences.
4. Préparer une solution de perméabilisation (0,5% de Triton X-100, 100 mM de glycine dans du PBS). Faire 1 ml (ou selon le montant nécessaire) de la solution de perméabilisation frais pour chaque expérience.
5. Préparer une solution de blocage (sérum de 2% de cheval (HS) ou 20% de sérum bovin fœtal (FBS) à Pen-Strep dans du PBS). Préparer 10 ml et conserver à 4 ° C entre les expériences.
   1. Aucune différence n'a été observée entre soitType de sérum, cependant, être cohérent dans le choix de la solution de blocage utilisée pour des expériences équivalentes.
6. Rincer embryons fixes pendant 5 min à température ambiante dans PBX (~ 100 ul).
7. Perméabiliser les embryons pendant 5 min à température ambiante dans une solution de perméabilisation (~ 100 ul).
8. Rincer les embryons pendant 5 min à température ambiante dans PBX (~ 100 ul).
9. embryons de bloc pendant 30 minutes à 1 heure à température ambiante à environ 100 ul de solution de blocage. Couvrir la solution avec une couche d'huile minérale pour éviter l'évaporation ou de garder dans une chambre humidifiée.
   Remarque: Les embryons peuvent être bloquées jusqu'à O / N périodes à 4 ºC, sans amélioration notable ou au détriment par rapport à 30 min étapes de blocage.
10. Incuber les embryons O / N à 4 ° C dans l'anticorps primaire / anticorps dilué dans une solution de blocage (~ 100 pi). Couvrir la solution avec une couche d'huile minérale pour éviter l'évaporation ou de garder dans une chambre humidifiée.
    1. Déterminer la dilution optimale pour chaque anticorps primaire à l'avance. La grainesection iscussion et matériaux pour dilutions testées d'un certain nombre d'anticorps.
11. Après O / N incubation, rincer embryons 3x pendant 5 minutes chacun à la température ambiante dans PBX (~ 100 pi).
12. embryons de bloc pendant 30 minutes à 1 heure à température ambiante à environ 100 ul de solution de blocage. Couvrir la solution avec une couche d'huile minérale pour éviter l'évaporation ou de garder dans une chambre humidifiée.
13. Incuber embryons pendant 1 à 2 heures à 4 ° C en anticorps secondaire / anticorps diluée à 4 pg / ml dans environ 100 ul de solution de blocage. Couvrir la solution avec une couche d'huile minérale pour éviter l'évaporation ou de garder dans une chambre humidifiée.
14. Rincer embryons 2x pendant 5 minutes chacun à RT dans PBX.
15. Déplacez embryons à tache d'ADN préférée. Si l'on utilise Hoechst 33342, dilué à 5 pg / ml dans du PBS. Couvrir la solution avec une couche d'huile minérale pour éviter l'évaporation ou de garder dans une chambre humidifiée.
    Remarque: Pause Point: Si les embryons ne sont pas visualisés immédiatement, ils peuvent être conservés pendant up à plusieurs semaines dans une solution de coloration nucléaire. Dans ce cas, assurez-PBS est stérile et / ou ajouter Pen-Strep ou azoture de sodium pour empêcher la croissance bactérienne et la contamination.

3. imagerie confocale

Remarque: Les configurations de microscope confocal individuels auront besoin les paramètres d'acquisition spécifiques à régler pour le système et les logiciels en place. Toutefois, la section suivante fournit un ensemble de règles générales à suivre qui devrait être applicable à toute installation donnée.

1. En utilisant une pipette bouche bien, faire microgouttes de PBS ou de solution de colorant nucléaire sur la surface de verre d'un plat à fond de verre de 35 mm et couvrir avec de l'huile minérale. Comme alternative, utiliser une lamelle régulier avec séparateurs en silicone pour éviter d'endommager les embryons et couvrir avec une lame de microscope en verre. Note: Lorsque vous utilisez une lamelle régulière, les embryons ne peuvent être ensuite repositionnés ou récupérés pour le génotypage, par conséquent, nous recommandons fortement l'utilisation d'un fond en verrevaisselle.
2. La place des embryons dans les microgouttes et organiser de manière cohérente, de préférence avec l'axe ICM-cavité parallèle à la surface du verre. Mettre en place plat sur le porte-microscope. Remarque: Les images obtenues à balayage laser confocal souffrent de microscopes une perte d'intensité de fluorescence de l'axe Z associé. Par conséquent, la cohérence dans l'arrangement est important pour comparer les intensités entre les régions équivalentes sur différents embryons.
3. Définissez les paramètres de référence utilisant des embryons de type sauvage qui n'a pas fait l'objet de toute sorte de traitement qui peut modifier l'expression des gènes.
   1. Acquérir des images en utilisant un objectif à fort grossissement (c.-à-40X ou ultérieure) afin d'obtenir des données qui faciliteront segmentation précise en utilisant l'outil MINUTES ^4.
      Remarque: L'utilisation du zoom numérique sur un objectif 20X ne donnera pas des images de résolution adéquate pour la segmentation en utilisant MIN. Il faut également noter la distance de travail (WD) de l'objectif, comme il se doitsuffisante pour permettre l'acquisition d'un Z-pile qui traversent tout le blastocyste, donc une longue WD (~ 130 à 150 um) objectif est habituellement nécessaire. Les images montrées sur les Figures 2 - 4 ont été acquises à l'aide d'une huile 1,30 objectif à immersion 40X / NA avec une distance de travail de 210 um.
   2. Utiliser la sortie bas du laser qui fournit un rapport fort rapport signal-bruit sans blanchiment des fluorophores.
   3. Régler le gain et l'offset pour obtenir la plage dynamique plus large sans surexposer l'échantillon. Exposer les images pour couvrir la majeure partie de, ou couvrent l'ensemble, gris plage d'échelle facilitera la détection de petites différences d'intensité entre les images.
   4. Utilisez un petit (1 pm) Z-étape, depuis la résolution de l'axe Z est essentiel pour la segmentation précise avec MIN.
      Remarque: dimensions XY n'affectent le processus de segmentation nucléaire, que la taille du fichier d'image. En général, 512 x 512 pixels est une résolution XY suffisante pour des images de qualité publication sans compromichanter espace disque.
   5. Étape critique: Gardez imagerie paramètres cohérents dans et entre les séances d'imagerie de la même expérience de manière à être en mesure de comparer des échantillons.
4. Imagerie lots d'embryons:
   1. groupes d'image cohérente (litières, expériences) en une seule session chaque fois que possible.
   2. Gardez paramètres cohérents dans et entre les séances d'imagerie pour les répétitions de la même expérience.
   3. embryons de l'image à travers (axe Z ensemble) pour capturer chaque cellule.
      Remarque: Si vous le souhaitez, embryon génotypage peut être fait après l'imagerie comme décrit dans ^23. La nécessité d'une PCR nichée doit être déterminée empiriquement et dépend du locus à analyser et les amorces utilisées.
5. Assurez-vous d'être en mesure de correspondre à des embryons à des images de manière rétrospective.

4. Analyse d'image et des données de pré-traitement

1. Télécharger et installer MINUTES ^{4 à partir de} http: // katlab-tools.org (licence MATLAB nécessaire).
2. Effectuer la segmentation d'images:
   1. Suivez l'interface utilisateur graphique (GUI) de minutes pour charger une image confocale ou empiler partir du disque dur, de détecter les noyaux et segmenter l'image. Charger l'ensemble Z-pile de données brutes générées par le microscope (.lsm, .lif, .oif, etc.). Voir le tableau 2 pour plus de détails sur chaque étape et les instructions figurant sur ​​http://katlab-tools.org ^{et 4.} Une fois terminé, voir le résultat de chaque étape en cliquant sur le bouton correspondant "Affichage". Une étiquette jaune au-dessus du bouton indique l'opération en cours, une étiquette verte indique opération achevée.
      Remarque: MN actuellement ne supporte pas les fichiers .czi, .tiff séquences ou des fichiers multi-positions - chaque Z-pile doit être un fichier indépendant.
   2. Après segmentation satisfaisante, sauver le pipeline créé de sorte qu'il peut être utilisé directement pour d'autres embryons ou portées.
3. Batch-Mode segmentation:
   Remarque: Sifichiers NGLE peuvent être segmentés individuellement. Toutefois, étant donné que les embryons dans une litière ou de l'expérience sont généralement de stade comparable, MN peut appliquer le pipeline de segmentation créé pour une seule image à un groupe d'entre eux sans supervision.
   1. Dans le menu Batch-Mode Run, cliquez sur "Ajouter des fichiers" et de charger tous les fichiers à traiter à la fois. Remarque: Les fichiers provenant de différentes sources peuvent être ajoutés à la file d'attente de segmentation.
   2. Cliquez sur «Démarrer en mode batch Run 'et laisser le temps pour le logiciel pour traiter les fichiers. Remarque: La sortie de la segmentation sera enregistré dans le même répertoire que les fichiers d'origine où ils sont situés.
4. évaluation de la segmentation et de correction manuelle
   Remarque: MINS segments des images avec une précision très élevée (> 85%), cependant, la qualité de la coloration et de l'imagerie, ainsi que le stade de l'embryon, peuvent affecter les performances MIN. En général, plus la densité nucléaire au sein de l'embryon, les erreurs de segmentation plus susceptibles prendra place (figures 2D, 3). Ainsi, la précision de la segmentation doit être évaluée pour chaque échantillon et une correction manuelle si nécessaire. Deux types d'erreurs se produisent généralement: sur-segmentation et la sous-segmentation.
   1. Résoudre sur-segmentation:
      1. Identifier les faux positifs - vésicules apoptotiques (figure 3A a, b, d, astérisques) ou d'autres éléments qui ne sont pas noyaux intacts, mais qui peuvent avoir été identifié comme tel par MIN.
         Remarque: En général, ces faux positifs ont une taille inférieure à celle de véritables noyaux et peuvent, dans la plupart des cas, être facilement identifiés et classés sur la feuille de calcul. Toutefois, l'examen visuel est fortement recommandé, comme souvent noyaux peuvent être que partiellement segmentés, résultant en une, mais le volume segmenté valide plus petit (figure 3A b, tête de flèche).
      2. Supprimer les enregistrements correspondants pour faux positifs du fichier * statistics.csv. * Préserver les statistiques originales.csv pour référence future et modifier seulement une copie de celui-ci.
      3. Si un noyau a été trop segmenté et présenté comme 2 ou plusieurs noyaux (figure 3A c, flèche et pointes de flèches), soit fusionner les enregistrements en faisant la moyenne de leur niveau d'intensité ou, si semblables, garder l'un des enregistrements pour cette cellule et jeter le le repos.
   2. Résoudre les sous-segmentation:
      1. Identifier les événements où MIN n'a pas réussi à détecter la frontière entre deux ou plusieurs noyaux, et par conséquent leur segmentation en un seul noyau (figure 3A D, la flèche et 3B). Remarque: Cela pose un problème pour un nombre de cellules précises, mais plus important encore, pour quantifier les niveaux de protéines, comme les niveaux mesurés seront la moyenne des cellules qui ont été à tort fusionné, et qui peuvent appartenir à différentes lignées.
      2. Identifier les événements où MIN n'a pas réussi à détecter un noyau complètement.
      3. Dans ces cas (4.4.2.1 et 4.4.2.2), mesurer les niveaux de gris moyens fou chaque canal dans la cellule (s) sous ou non-segmenté en utilisant un outil alternatif, tels que ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), et remplacer la enregistrement erroné avec les niveaux corrects. Préserver le fichier * statistics.csv original pour référence future et modifier uniquement une copie de celui-ci. Pour ce faire en utilisant ImageJ, procédez comme suit:
         1. Ouvrez la pile multi-canal correspondant sur ImageJ et importer le fichier overlaid.tiff * correspondant généré par MN comme une pile virtuelle ( "Fichier"> "Importer"> 'TIFF de pile virtuelle ...).
         2. Trouvez une section médiane du noyau sous- ou non segmenté.
         3. Utilisation de l'outil de sélection à main levée esquisser le périmètre du noyau sous- ou non segmenté sur la chaîne ADN tache.
         4. Appuyez Crl + M (Cmd + M sur un Macintosh) ou allez dans le menu Analyser et sélectionnez «mesure». Cette action va enregistrer la valeur de gris moyenne pour la zone délimitée et l'afficher sur une nouvelle fenêtre. Allez sur "Analyser">9; Set mesures ... »et assurez-vous 'valeur moyenne grise» est sélectionné. Sélectionner d'autres paramètres à mesurer.
         5. En utilisant la même zone délimitée dans l'étape 4.4.2.3.3, répéter la mesure pour chacun des canaux de fluorescence d'intérêt. Les résultats seront ajoutés à la précédente sur la fenêtre de résultats de mesures.
         6. Utilisez les mesures obtenues pour remplacer les enregistrements erronés dans le fichier * statistics.csv. Si le noyau n'a pas été segmenté, insérer une nouvelle ligne, de lui attribuer un nouveau numéro de cellulaire et introduire les valeurs obtenues dans ImageJ dans la colonne correspondante pour chaque canal. Cette cellule aura pas coordonnées spatiales (et les valeurs de Z X, Y). Si le noyau avait été undersegmented, dupliquer sa rangée, attribuer différents identifiants cellulaires à chaque nouvelle cellule et d'introduire les valeurs obtenues dans ImageJ dans la colonne correspondante. Dans ce cas, les deux cellules se partageront coordonnées spatiales.
            Remarque: Si la distribution spatiale doit être analysé, nous recommand excluant les coordonnées XYZ de ces cellules, comme ils se chevauchent. A cet effet, lors de la création de nouveaux records, céder identifiants cellulaires à ceux qui sont faciles à distinguer de ceux d'origine (pour les numéros exemple, non entier).
   3. Note cellules en division. Remarque: MN détecte mitotique ainsi que les noyaux en interphase, mais ne peut pas les distinguer.
      1. Si noyaux mitotiques doivent être considérés séparément dans l'analyse, marquer manuellement ceux-ci et ajouter ces informations dans le fichier de données. Pour enregistrer les cellules en mitose, ajouter une nouvelle variable (colonne) dans le fichier de données de statistics.csv * et affecter des valeurs différentes pour mitotique et interphase noyaux.
5. Les données de pré-traitement.
   Note: Une fois que les feuilles de calcul ont été corrigées pour les sur- et sous-segmentation ils sont prêts à être analysés. Le processus d'analyse et de présentation de données dépendent de l'expérience spécifique. Cependant, voici quelques transformations générales de donnéesnous recommandons d'effectuer avant l'analyse:
   1. Transformer les valeurs d'intensité de fluorescence dans leur logarithme ou racine carrée de réduire la dispersion des données. Cela permet également la visualisation, que les données brutes ont tendance à se concentrer à proximité des axes de la parcelle (voir la figure 4B, C).
   2. Corriger l'atténuation de Z-associé de la fluorescence:
      Remarque: L'intensité de fluorescence à balayage laser d'images de microscopie confocale diminue le plus profond sur l'axe Z se trouve une tranche (figure 4E, F).
      1. Si l'un des épitopes détectés dans les échantillons est un marqueur nucléaire ménage omniprésente et homogène exprimé, normaliser les intensités de fluorescence des autres épitopes en divisant leurs valeurs dans chaque cellule par la valeur correspondante du marqueur de ménage.
      2. En l'absence d'un tel repère de référence, compenser la perte de fluorescence de la façon suivante Z-associé:
         1. Tracer les valeurs de chaque marqueur (Yaxe du graphique) sur la position Z (axe X du graphique) pour visualiser la diminution de l'intensité sur Z - parcelle ensemble les valeurs de tout contrôle, les embryons de type sauvage (figure 4F).
         2. Ajuster un modèle linéaire (courbe de régression) à l'intrigue obtenu à l'étape précédente (valeurs d'intensité sur Z) pour chaque marqueur (figure 4F).
         3. Corriger toutes les valeurs pour chaque marqueur en utilisant la formule suivante:
            log (valeur d'origine) + Z * pente du modèle (figure 4D, G).
            Remarque: Les étapes spécifiques pour effectuer cette correction dépend du logiciel d'analyse utilisée (R, MATLAB, etc.). Si vous utilisez R, exécutez la formule suivante pour ajuster un modèle linéaire pour les données:
            > Lm (log (canal) ~ Z, data = dataframe)
            où, le canal est le canal de fluorescence à corriger, Z est la coordonnée Z et dataframe est le tableau contenant toutes les valeurs de l'embryon souhaité (s) (l '* statistics.csv fichier généré par MN ou une modification de celui-ci).
            Remarque: La sortie de la formule ci-dessus a le format suivant:
            (Intercept) Z
            4,76373 -0,01947
            où, la valeur Z est la pente de la droite de régression pour ce jeu de données, dont la valeur absolue doit être utilisé pour modifier la valeur d'origine avec la formule donnée dans 4.5.2.2.3 (voir Figure 4G pour un exemple).

Results

Pour faciliter l'interprétation des données et de la présentation, il faut prendre soin de ne pas endommager les embryons lors de la collecte et de la manipulation, de sorte que toutes les cellules et leur position relative peuvent être analysés Figure 2A -. D montre des exemples de blastocystes intacts à différents stades avec une cavité élargie. En cas de dommage, des précautions supplémentaires doivent être prises lors de l'analyse et l'interprétation des résultats. <...

Discussion

Le présent protocole décrit une méthode pour effectuer une analyse quantitative de l'ensemble de montage immunofluorescence sur préimplantatoire des embryons de souris de la scène. Un protocole robuste d'immunofluorescence ²² est suivie par haute résolution, l'ensemble du montage imagerie confocale et par la segmentation d'images en utilisant un morceau sur mesure de logiciels ^4. Alors que le choix du protocole d'immunofluorescence est pas critique, on retrouve celle présentée i...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Embryo collection
Sonde émoussée pour le contrôle des bouchons	Roboz	RS-9580
Pince	Roboz	RS-4978
Ciseaux chirurgicaux	Roboz	RS-5910
Pipettes Pasteur en verre	Fisher	13-678-20C
Tube d’aspirateur pré-assemblé & embout buccal	Sigma	A5177
Tube en caoutchouc plus long	Fisher	14-178-2AA  ;   ;   ;
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
Acide Solution de Tyrode	Millipore	MR-004-D
Pénicilline/Streptomycine	Gibco	15140
Albumine sérique bovine  ;	Sigma	A9647
Plaques 4 puits	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300  ;   ;   ;
Immunofluorescence
Plaques à fond en U à 96 puits	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycine	Sigma	G7403
Sérum de cheval	Sigma	H0146
Anticorps primaires			Concentration
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R& D	AF1700	1:100
GATA4	Santa Cruz	sc-9053	1:100, 10 min fixation
GATA4	Santa Cruz	sc-1237	1:100, fixation O/N
SOX17	R& D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100, 10 min à fixation O/N
DAB2	BD	BD-610464	1:200
Anticorps secondaires	Life Technologies	Divers	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
Imaging
Antennes paraboliques à fond en verre de 35 mm	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
Ordinateur exécutant le système d’exploitation		n/a	Vérifier la configuration minimale requise chez http://katlab-tools.org et dans Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (logiciel)	Mathworks	n/a
MINS (logiciel)	Gratuit	n/a	http://katlab-tools.org