Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir d'embryons humains Cellules souches

Summary

Ici, nous décrivons une méthode pour la purification de cellules embryonnaires humaines différenciées souches qui se sont engagés envers l'endoderme définitif pour l'amélioration des applications en aval et d'autres différenciations.

Abstract

Les capacités de différenciation des cellules souches pluripotentes telles que des cellules souches embryonnaires (CSE) permettent une application thérapeutique potentielle pour les thérapies de remplacement cellulaire. Terminalement types de cellules différenciées peuvent être utilisés pour le traitement de diverses maladies dégénératives. In vitro la différenciation de ces cellules vers les tissus du poumon, du foie et du pancréas nécessite dans un premier temps la production de cellules endodermiques définitives. Cette étape est limitante pour une différenciation plus poussée vers des types de cellules matures en phase terminale comme les cellules bêta productrices d'insuline, les hépatocytes ou d'autres types de cellules endoderme dérivés. Les cellules qui se sont engagés envers la lignée endoderme expriment fortement une multitude de facteurs de transcription tels que FOXA2, Sox17, HNF1B, membres de la famille GATA, et le récepteur de surface CXCR4. Cependant, les protocoles de différenciation sont rarement efficaces à 100%. Ici, nous décrivons un procédé pour la purification d'une population de cellules CXCR4 + après différenciationdans le DE en utilisant des microbilles magnétiques. Cette purification élimine en outre des cellules de lignées indésirables. Le procédé de purification douce est rapide et fiable et peut être utilisé pour améliorer les applications en aval et différenciations.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes telles que des cellules souches embryonnaires (CSE) ont la capacité de se différencier en pratiquement tout type de corps humain de la cellule. Ainsi, les protocoles de différenciation in vitro peuvent être utilisés pour produire de nombreux types cellulaires adultes , tels que des cardiomyocytes ^{1, 2,} hépatocytes cellules bêta ^{3, 4} épithéliale pulmonaire ou des cellules neuronales ^5. Cela rend CES un outil précieux pour le traitement potentiel de diverses maladies dégénératives ^3.

La différenciation in vitro des CES vers....

Protocol

1. Différenciation des ESC humain vers le Endoderme Definitive

1. Cultiver des cellules souches embryonnaires humaines (CES) dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Enduire un nouveau 6 puits plaque de culture cellulaire avec 1 ml d'une matrice de membrane basale et incuber la culture-ware pendant au moins 30 min à température ambiante. Pour plus de détails s'il vous plaît tourner vers les instructions du fabricant respectif.
3. Vérifiez que les CES de l' homme de culture ont atteint 80% -90% de confluence sous le microscope à l' aide d' un faible grossissement (par exemple, 4X). Aspirer le milieu de....

Results

lors de la différenciation CES subissent des changements drastiques dans le gène et l' expression de la protéine. La figure 1 illustre les gènes marqueurs typiques qui peuvent être utilisés pour vérifier une différenciation endoderme réussie. Les principales cibles pour une analyse d'expression génique sont CGC, FOXA2 et Sox17. Dans une analyse relative expression du gène particulier FOXA2 et Sox17 sont augm.......

Discussion

protocoles de différenciation utilisés actuellement aboutissent rarement à 100% de cellules différenciées. Pour des raisons qui restent à aborder certaines cellules résistent au processus de différenciation. En fonction de l'efficacité du protocole de différenciation utilisé et la propension de l'ESC aligner un certain nombre de cellules pluripotentes résiduelles sont couramment observée même après différenciation dans l'endoderme définitif. Ces cellules résiduelles peuvent affecter différenciations en aval .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lignée de cellules souches embryonnaires humaines Hues8	Harvard Département de cellules souches et de biologie		Lignée cellulaire appropriée pour la génération d’endoderme
Lignée de cellules souches embryonnaires humaines Hes3	ES Cell International		Lignée cellulaire appropriée et robuste pour la génération d’endoderme
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	Milieu de culture ESC
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, humain	Miltenyi Biotec	130-098-357
Microbilles anti-APC	Miltenyi Biotec	130-090-855  ;
Séparateur OctoMACS	Miltenyi Biotec	130-042-109	champ magnétique
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	inhibiteur de ROCK
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activin A	Peprotech	120-14
réactif de dissociation cellulaire douce	Stemcell Technologies	7174	sans enzyme solution de passage, alternative : Trypsine/EDTA
Matrigel*	Corning	354277	matrice de membrane basale * résoudre et stocker dans des aliquotes à -80 ° ; C comme indiqué dans le manuel du fournisseur. Après utilisation, décongeler sur de la glace, diluer dans 25 ml de DMEM/F-12. Ajouter 1 ml dans chaque puits d’une plaque à 6 puits et incuber pendant 45 min à température ambiante. Retirer le matrigel et l’utiliser immédiatement.
MS Columns	Miltenyi Biotec	30-042-201
Séparateur MACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Human FOXA2 REV tcatgttgctcggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtgtgtt	Life Technologies
Humain GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 TaqMan essai	Applied Biosystems	Hs00751752_s1
Humain SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Humain SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Humain POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg	Life Technologies
Humain POU5F1 REV ctgcagtgtgtttcgggca	Life Technologies
Humain Nanog FW ccgagggcagacatcatcc	Life Technologies
Humain Nanog REV ccatccactgccacatcttct	Life Technologies
Humain TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies
Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnology	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R& D Systems	AF1924