Isolement et analyse par cytométrie en flux des cellules immunitaires du cerveau ischémique souris

Résumé

L’inflammation joue un rôle central dans la pathogenèse de l’AVC ischémique. De plus en plus de preuves suggèrent qu’il agit comme une arme à double tranchant qui exacerbe les lésions cérébrales précoces, mais contribue également à la réparation ultérieure. Ce protocole décrit l’isolement des cellules immunitaires du cerveau ischémique et leur phénotypage ultérieur par cytométrie en flux.

Résumé

AVC ischémique déclenche une réponse inflammatoire robuste qui commence dans le compartiment intravasculaire et implique l'activation rapide des cellules du cerveau résidents. Un mécanisme clé de cette réponse inflammatoire est la migration des cellules immunitaires circulantes au cerveau ischémique facilitée par chimiokine libération et l'augmentation de l'adhérence endothéliale molécule expression. leucocytes Brain-invasion sont bien connus en contribuant à un stade précoce lésion ischémique secondaire, mais leur importance pour la fin de l'inflammation et plus tard la réparation du cerveau n'a été que récemment remarqué.

Ici, un protocole simple pour l'isolation efficace de cellules immunitaires dans le cerveau de souris ischémique est fourni. Après perfusion transcardial, hémisphères du cerveau sont disséqués et dissociées mécaniquement. digestion enzymatique avec Libérase est suivie d'un gradient de densité (tel que Percoll) centrifugation pour éliminer la myéline et les débris cellulaires. Un avantage majeur de ce protocole is la procédure à gradient de densité à une seule couche qui ne nécessite pas de préparation de temps et de gradients peut être effectuée de manière fiable. L'approche donne le nombre de cellules hautement reproductibles par hémisphère du cerveau et permet de mesurer plusieurs panneaux de cytométrie de flux dans une répétition biologique. La caractérisation phénotypique et la quantification des leucocytes au cerveau après un AVC envahir expérimentale peuvent contribuer à une meilleure compréhension de leurs rôles multiples dans les lésions ischémiques et de la réparation.

Introduction

attaque cérébrale déclenche une réponse inflammatoire prolongée qui commence rapidement après l'arrêt de la circulation sanguine locale et implique la quasi-totalité des parties du système immunitaire. Une des caractéristiques importantes de cette réponse inflammatoire est un afflux de cellules immunitaires chronométré dans le cerveau qui est entraînée par l'activation des cellules endothéliales cérébrales, la sécrétion de chimiokine importante et une augmentation de débit sympathique ^3.1. Infiltration de cellules inflammatoires était auparavant considérée comme nocive dans un accident ischémique cérébral, cependant, plusieurs essais thérapeutiques visant à bloquer indistinctement leucocytes sortie vers le cerveau n'a pas induit un bénéfice clinique mesurable ^4. Plus récemment, il est devenu évident que les cellules dérivées de monocytes initialement impliqués dans la progression des lésions ischémiques ⁵ pourraient également jouer un rôle crucial pour la résolution de l'inflammation et des tissus ultérieure réparation ^6.

Merci à l'identification des phénotypique et functihétérogénéité onal parmi les monocytes et les macrophages, les connaissances sur le rôle des phagocytes mononucléaires dans le développement et la résolution de l'inflammation a considérablement élargi. Chez la souris, des monocytes circulants peuvent être classés en au moins deux sous-ensembles fonctionnellement distincts en fonction de leur expression de l'antigène de surface de lymphocyte complexe 6 (Ly-6C) ^7. Alors que Ly-6C monocytes''inflammatory ^élevés ont été clairement présentés comme essentiels pour le contrôle des infections bactériennes ^8, leur rôle dans la blessure stérile est plus controversée. Dans accident vasculaire cérébral ischémique, ablation sélective de CCR2 + Ly-6C ^élevés monocytes entraîné infarctus hémorragique transformation ^6. Cependant, la même approche expérimentale améliorée invalidité aiguë après une hémorragie intracérébrale ^9. De même, les différents sous-ensembles de cellules T sont censés exercer soit les actions nuisibles ^{10 ou} de protection ¹¹ dans les lésions cérébrales ischémiques, cependant, les données sont controversial ^12,13 et garantit d'autres investigations. Compte tenu de cette complexité croissante, il devient clair que une connaissance plus approfondie sur le rôle des cellules immunitaires dans diverses lésions ischémiques et de la réparation est crucial pour traduire les résultats expérimentaux en thérapies ciblant l'inflammation post-AVC.

Aujourd'hui, l'outil le plus puissant pour l'analyse des réponses immunitaires cellulaires est la cytométrie de flux polychrome. Elle permet l'identification et la quantification des différents sous-ensembles de cellules immunitaires sur le site de l'inflammation, sans avoir à solliciter le système de marquage in vivo ou ¹⁴ manipulation génétique. La coloration simultanée des marqueurs de surface cellulaire avec des anticorps contre des cytokines intracellulaires ou des ¹⁵ facteurs de transcription ¹⁶ fournit en outre des informations sur l'état fonctionnel des cellules individuelles, identifiées phénotypiquement. Comme un inconvénient majeur, des suspensions de cellules simples sont requis pour les analyses de cytométrie en flux et ainsi des informations sur loclisation des infiltrats cellulaires est perdu. Cependant, alors que l'histologie optimal pour obtenir de l'information spatiale, elle est limitée par le nombre d'anticorps qui peuvent être utilisés en une seule fois pour caractériser des sous-types de cellules immunitaires dans un tissu particulier. De nos jours, une combinaison de la présence et de l'absence de divers marqueurs de surface est nécessaire pour identifier sans ambiguïté rares sous-ensembles de cellules immunitaires, en particulier les populations cellulaires distinctes dérivées de monocytes pendant ¹⁷ l'inflammation.

Ici, nous décrivons un protocole efficace pour isoler un nombre élevé de leucocytes dans le cerveau de souris en utilisant un simple post-ischémique gradient de densité à une seule couche. Les suspensions cellulaires obtenues peuvent être analysées soit par écoulement multidimensionnel ou cytométrie en outre être enrichies par tri par cytométrie de flux ou une sélection immunomagnétique pour effectuer des analyses en aval hautement spécifiques. La méthode détails perfusion transcardial, suppression des hémisphères du cerveau, la dissociation du tissu cérébral dans susp cellule uniqueensions, la centrifugation en gradient de densité pour l'enlèvement de la myéline ainsi que la coloration des anticorps pour l'analyse par cytométrie en flux.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux doivent être conformes aux normes selon les soins des animaux (par exemple., Le Guide de soin et l'utilisation des animaux de laboratoire publiées par le US National Institutes of Health, NIH Publication No. 85-23, révisée en 1996) et doivent être approuvés par l'autorité d'état approprié.

1. Préparation des réactifs

1. Un tampon de digestion (1 ml par hémisphère): Dissoudre un mélange uniforme d'enzymes digestives purifiés, par exemple, Libérase avec une faible concentration en thermolysine (TL) à une concentration de 2U / ml dans du Hanks solution saline équilibrée (HBSS) contenant du calcium (Ca) et de magnésium (Mg)
2. Tampon de lavage à la DNAse: Dissoudre DNAse I à une concentration de 666U / ml dans du HBSS (Ca / Mg libre) contenant 10% de sérum de veau foetal (FCS)
3. Tampon de lavage sans DNAse: HBSS (Ca / Mg gratuit) contenant 10% de FCS
4. moyen gradient de densité (5 ml par hémisphère): préparer stocks isotonique gradient de densité0, moyenne (SIP; 100%) en mélangeant neuf parties du milieu de gradient de densité avec une partie 1,5 M de chlorure de sodium. Diluer SIP à la densité de 25% en ajoutant un volume approprié de HBSS (Ca / Mg gratuit) contenant 3% de FCS
5. La cytométrie en flux (FC) Tampon: Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 3% de FCS

2. transitoire cérébrale moyenne Artère Occlusion

NOTE: occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne (MCAO) par l'intermédiaire de la technique de suture intraluminale a été effectuée comme décrit précédemment dans ¹⁸ de 12 semaines mâles C57BL / 6.

1. En bref, anesthésier les souris avec 2,0% d'isoflurane dans 100% d'oxygène. Maintenir la température du corps à 36,5 ° C ± 0,5 ° C par un dispositif de chauffage asservi.
2. Après ligature de l'artère carotide commune et l'artère carotide externe, introduire un caoutchouc silicone monofilament normalisée revêtue dans l'artère carotide commune et l'avance à l'origine de la c milieuartère erebral.
3. Après 45 minutes retirer le filament pour permettre la reperfusion. Chez les animaux opérés de manière fictive, retirer immédiatement le filament après occlusion de l'artère cérébrale moyenne pour éviter une ischémie.

3. Transcardial perfusion et dissection du cerveau

1. Préparer une pompe de perfusion péristaltique en plongeant une extrémité du tuyau dans HBSS glacé (Ca / Mg libre). Correction d'un 23 aiguille G émoussée à l'autre extrémité du tube de perfusion et activer la pompe pour remplir complètement le tube avec HBSS (Ca / Mg gratuit).
2. Profondément anesthésier la souris avec 4% d'isoflurane et euthanasier par _{inhalation de CO 2.}
3. Placez le dos de la souris sur une planche de dissection intégré dans un plateau en plastique. Propagation avant et pattes de derrière aussi large que possible et de les fixer sur le tableau de dissection avec 20 g d'aiguilles.
4. Prenez peau de l'abdomen avec une ligne droite 1 x 2 dents des pinces et des ciseaux à iris pointus pour faire une incision latérale à travers le tégument et la paroi abdominale et d'exposer lafoie.
5. Soulevez le sternum et inciser la membrane avec la lame émoussée de vives / IRIS contondants ciseaux. Continuer à réduire la cage thoracique latéral des deux côtés dans la direction caudocranial. Faites attention de ne pas blesser les poumons, le cœur et les artères thoraciques.
6. Soulevez le rabat de la peau avec une pince émoussée et l'épingler sur la carte de la dissection. Utilisez une pince émoussée de gamme et des ciseaux pour séparer soigneusement le cœur du tissu conjonctif.
7. Tenez coeur avec extrémités franches pince et insérez la pointe de l'aiguille 23 G émoussée avec le tube de perfusion jointe, dans la pointe du ventricule gauche. Note: Ne pas insérer l'aiguille trop loin dans le ventricule gauche pour éviter les blessures du septum interventriculaire. Si nécessaire, fixer la canule en place avec une pince vives droites.
8. Inciser l'oreillette droite avec des ciseaux pointus de l'iris et tournez immédiatement sur la pompe (débit: 8 - 10 ml / min).
9. Continuer perfusion jusqu'à ce que le foie montre une couleur café léger (environ 30 ml de HBSS). Tout au long dela perfusion, éviter soigneusement toute formation de bulles d'air dans le tube.
10. Décapiter la souris avec des ciseaux chirurgicaux droites juste derrière le crâne. Utilisez iris ciseaux pour faire une incision médiane du cuir chevelu pour exposer le crâne.
11. Placez une extrémité de l'iris paire de ciseaux pointus dans le foramen magnum et couper latéralement dans le crâne. Répétez l'opération pour l'autre côté.
12. Utilisez des ciseaux iris tranchant pour couper soigneusement de la même cavité jusqu'à la ligne médiane vers le nez. Essayez de garder la fin des ciseaux superficielles que possible pour éviter les blessures du cerveau.
13. Utilisez une pince fine à peler doucement les os du crâne de chaque hémisphère du cerveau. Remarque: tissu infarci peut adhérer aux méninges ou le crâne; Assurez-vous de ne pas perdre le tissu cérébral en raison de dissection imprudente
14. Soulevez le cerveau avec une spatule et utiliser des ciseaux pointus de l'iris de disséquer soigneusement fibres des nerfs crâniens qui le fixent au crâne. Placer le cerveau dans un tube de 15 ml remplie de 10 ml de HBSS (+ Ca / Mg) et le garder seu de temps sur la glace.

4. La dissociation du tissu cérébral en cellule unique suspensions

1. Retirez délicatement le tronc cérébral et le cervelet avec une lame de rasoir propre. Utilisez une lame de rasoir propre pour hemisect le cerveau et couper chaque hémisphère dans le plan coronal en trois morceaux de taille à peu près égale.
2. Mince tissu disséqué de chaque hémisphère à travers un tamis cellulaire de 100 um en utilisant l'extrémité du piston d'une seringue de 5 ml. rincer en permanence le filtre cellulaire avec glacée HBSS (+ Ca / Mg). Stocker échantillons homogénéisés sur de la glace.
3. Centrifuger à 286 xg et 4 ° C pendant 5 min, jeter soigneusement le surnageant. Reprendre le culot dans 1 ml de tampon de digestion et transférer la suspension dans un tube de 2 ml. Incuber la suspension prévue à rotation lente et continue à 37 ° C pendant 1 heure.
4. suspension cellulaire tamis à travers un tamis cellulaire de 70 um et rincer abondamment avec 3 ml de tampon de lavage contenant DNAse suivie par 15 ml de tampon de lavage DNase. Centrifuger à 286 xg et 18 ° C pendant 5 minutes et jeter le surnageant. Remarque: Remarque: L'utilisation de DNAse élimine le mucus à l'ADN causés par lyse cellulaire qui pourrait conduire à l'agrégation cellulaire compromettre la survie des cellules.

5. gradient de densité centrifugation pour l'enlèvement de la myéline et les débris cellulaires

1. Resuspendre le culot cellulaire dans 5 ml de milieu de gradient de densité de 25% et la pipette la suspension dans un tube de 15 ml. Mélanger soigneusement par pipetage répété et doux en évitant la formation de bulles. Remarque: milieu de gradient de densité doit être utilisé à la température ambiante pour empêcher l'agglutination des cellules.
2. Centrifuger à 521 xg et 18 ° C pendant 20 min. Utiliser le plus bas profil d'accélération du rotor et le rotor permet d'arrêter sans frein. Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse sans agitation. aspirer soigneusement la couche de myéline et le surnageant tout en conservant le culot cellulaire au fond du tube. Remarque: Assurez-vous de retirer la couche de myéline entier comme les restants sera impair analyse par cytométrie en flux.
3. Reprendre le culot dans 10 ml de tampon de lavage DNAse libre et la pipette la suspension dans un nouveau tube de 15 ml. Remarque: Cette étape de lavage est cruciale car une élimination suffisante de milieu de gradient de densité contribue de manière significative à la quantité et la qualité de l'échantillon de cellules final.
4. Centrifuger à nouveau à 286 xg et 10 ° C pendant 5 minutes et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 100 pi de tampon de lavage à froid et de déterminer le nombre de cellules et la viabilité par exclusion au bleu trypan dans un hémocytomètre. Conserver les échantillons à 4 ° C et d'autres processus rapidement.

6. coloration des anticorps pour l'analyse par cytométrie en flux

1. Avant le marquage de l'anticorps, l'incubation de la suspension cellulaire à 4 ° C pendant 10 min avec CD16 anti-murin / CD32 récepteur Fc réactif de blocage (concentration finale de 2,5 ug / ml, le facteur de dilution 1: 200) pour empêcher une liaison non spécifique.
2. Ajouter anticorps primaires fluorophore conjugué à la uneppropriate concentration (comme indiqué dans le tableau 1) à la suspension de cellules et incuber à 4 ° C pendant 20 min dans l'obscurité. Note: Les échantillons de contrôle ne sont pas colorées avec des anticorps primaires, mais sinon traités de la même.
3. Laver les cellules avec 2 ml de tampon FC et centrifuger à 350 x g et à 10 ° C pendant 7 min.Carefully aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 200 pi de tampon FC. Conserver les échantillons temporairement à 4 ° C dans l'obscurité jusqu'à l'analyse par cytométrie en flux.

7. quantification absolue par des billes de comptage

1. Inversement pipette 40 ul de tampon FC et 10 pi de la suspension cellulaire dans un tube de comptage contenant un nombre connu de billes fluorescentes. Remarque: Veillez à ce que les pipettes sont calibrées pour offrir exactement 10 pi d'échantillon que le calcul ultérieur de nombre de leucocytes se réfère à ce volume.
2. Incuber la suspension de cellules avec un anticorps CD45 marqué au FITC (concentration finale5 ug / ml, le facteur de dilution 1: 100) à 4 ° C pendant 20 min dans l'obscurité.
3. Inversement remplir le tube de comptage avec 200 pi de tampon FC sans aucune étape de lavage et d'enregistrer directement les cellules CD45 + par cytométrie en flux.

8. Acquisition par cytométrie en flux

Remarque: Pour analyser le panel d'anticorps proposé, le cytomètre approprié doit être équipé d'un bleu (488 nm), rouge (635 nm) et le violet (405 nm) laser et les filtres pour FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7, APC-Cy7 et AmCyan.

1. Réglez l'avant (FSC) et latéral (SSC) de dispersion à l'aide de cellules non colorées d'un hémisphère ischémique. Discriminer doublets de cellules individuelles dans un complot point montrant la zone et la hauteur de FSC.
2. Afficher tous les cellules uniques dans des histogrammes à paramètre unique pour chaque canal de fluorescence utilisé et régler le tube photomultiplicateur (PMT) de telle sorte que les tensions des cellules individuelles sont affichés dans l'extrême gauche de l'histogramme.
3. Utilisez un CD45-FITC seuléchantillon coloré pour vérifier dispersion et PMT paramètres pour les cellules d'intérêt par backgating cellules immunitaires ^élevées CD45 dans chaque parcelle de l'histogramme et la dispersion. Remarque: Adapter tensions PMT de FITC sorte que CD45 négative, intermédiaire (int) et des cellules exprimant élevés peuvent être différenciés les uns des autres.
4. Utilisez anticorps capturé perles de compensation pour effectuer une compensation multi-couleur. Définir des grilles pour les microglies ^(int) CD45 et CD45 leucocytes ^(haute), puis définir des sous-populations de leucocytes en fonction de la stratégie de déclenchement apparaît sur ​​la figure 1.

Résultats

ischémie cérébrale a été lancé en 12 semaines vieux mâles C57BL / 6 souris via transitoire filament occlusion de l'artère cérébrale moyenne gauche (MCAO). Pour un fonctionnement imposture le filament a été inséré pour obstruer l'artère cérébrale moyenne gauche et retiré immédiatement pour permettre la reperfusion instantanée. Fait important, la neuro-inflammation cellulaire diffère sensiblement entre les modèles de course couramment appliqués ^19. Ceci doit être gardé à l'esprit en particulier lorsque l'on extrapole les résultats des études animales à la physiopathologie hétérogène d'accident vasculaire cérébral humain.

Les souris ont été sacrifiées 24 heures après MCAO d'analyser début invasion des cellules immunitaires dans le cerveau ischémique. Les comptages de cellules obtenues à partir de l'hémisphère ischémique (MCAO ipsi; 0,95 ± 0,25 x 10E6) après gradient de densité centrifugation étaient comparables à ceux de l'hémisphère controlatéral (MCAO contra; 1,09 ± 0,30 x 10E6) et le ipsilatéralhémisphère de souris opérés de manière fictive (simulacre ipsi; 1,12 ± 0,18 x 10E6, une ANOVA, p = 0,524). La viabilité des cellules isolées mesurées par exclusion du bleu trypan était élevé et ne différait pas significativement entre les groupes (faux 96,85 ± 0,60%, MCAO contre 97,12 ± 1,18%, MCAO IPSI 95,68 ± 2,04%, à sens unique ANOVA, p = 0,253 ).

La composition du cerveau infiltrer 24 heures après la MCAO a été déterminée par analyse par cytométrie en flux. La figure 1 illustre la stratégie de déclenchement de façon schématique (A) et dans une course animal représentatif (B). Leucocytes du cerveau infiltrant ont été définis comme cellules CD45 ^{élevées qui} peuvent être différenciés des CD45 ^int microglie. Dans le ^haut population CD45, les polynucléaires neutrophiles (PMN) ont été identifiés par l'expression Ly-6G, tandis que les lymphocytes T ont été délimitées comme CD45 ^haute CD3 + cellules. Les cellules restantes ont été ^élevés CD45 alors distinguered par CD19 (Les lymphocytes B) et d'expression CD11b. La fraction CD11b + a en outre été subcategorized en Ly-6C ^haute `monocytes` inflammatoire ^{et une faible} population Ly-6C qui englobe les monocytes, les cellules dendritiques (DC) et les macrophages.

Dans la phase aiguë de l'AVC, les cellules immunitaires myéloïdes dominent le cerveau infiltrer ^3,20. Neutrophiles pénètrent dans le cerveau rapidement après l'occlusion du vaisseau et de promouvoir l'extravasation des monocytes inflammatoires ^21. Figure 2A affiche le pourcentage d'augmentation de LY6-G + neutrophiles dans l'hémisphère ischémique 24 heures après MCAO par rapport à la chirurgie de l'hémisphère et imposture controlatéral. En revanche, la proportion de cellules T CD3 + dans l'hémisphère ischémique est (relativement) plus faible que dans le cerveau en bonne santé. Au sein de la population CD11b +, l'ischémie cérébrale pencher la balance vers une forte prépondérance de Ly-6C monocytes inflammatoires ^élevés (Figure2B).

En plus de la répartition relative des tubes de comptage ont été utilisés pour déterminer le nombre absolu de sous-ensembles de cellules immunitaires dans des échantillons sur la base d'événements positifs CD45 (figure 3). tubes de comptage contiennent une pastille lyophilisée qui libère un nombre connu de billes fluorescentes. Le nombre absolu de cellules positives dans l'échantillon peut être déterminée en mettant en relation des événements cellulaires à perler événements. Pour calculer le nombre de CD45 ^élevés leucocytes par hémisphère l'équation suivante a été utilisée: cellules CD45 ^{élevés par} hémisphère = (CD45 ^{événements de haut} x totale comptage perles / événements échantillon de perles) de x (volume total de la suspension (100 pi) / volume de l'échantillon (10 pi )). 24 heures après la MCAO, le nombre total de leucocytes dans l'hémisphère de l'infarctus ont été significativement augmentés par rapport à l'hémisphère et imposture chirurgie controlatéral (Figure 3D, une analyse de la variance, p = 0,0004). Comtes de la di sous-ensembles de cellules immunitaires Stinct (PMN, les cellules T, les cellules B, Ly-6C ^{élevé et} Ly-6C ^faibles monocytes) peuvent être facilement calculées en multipliant la fréquence relative avec le CD45 nombre ^élevé de leucocytes de l'échantillon respectif.

Figure 1. Stratégie Gating pour cytométrie en flux. (A) illustration schématique de la stratégie de déclenchement. (B) montre l'analyse par cytométrie en flux des leucocytes isolés à partir d'un représentant de cerveau de souris 24 heures après l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne. FSC diffusion vers l'avant, PMN polynucléaires neutrophiles, les cellules dendritiques classiques CDC. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. La différenciation des immunitaires sous-ensembles de cellules. De distribution relative de Ly-6G + -neutrophils (A), les cellules T CD3 + (A) et des sous-ensembles de monocytes identifiés par l'expression différentielle de Ly-6C (B) dans le ipsilatéral (IPSI) et controlatéral ( contra) hémisphère 24 heures après l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO) ou une intervention chirurgicale fictive respective. Pourcentage de chaque population est indiqué dans la porte. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. La quantification des leucocytes cerveau en comptant Perles. (A) montre la porte de perles hautement double positive. Au sein de la population de cellules uniques (B) CD45 ^int microglie peut être différenciée de CD45 leucocytes ^élevés (C). Pour la quantification, le nombre d'événements ^élevés CD45 gated a été normalisée aux événements de perles comptés. Notez que leucocytes totaux ^(haute CD45) chefs d'accusation sont significativement augmentés dans le ipsilatéral (IPSI) hémisphère par rapport à l'controlatéral (contre) la chirurgie de l'hémisphère et sham 24 h après l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO). ** P <0,01, *** p <0,001 par ANOVA à sens unique et essai Tukey`s post hoc de comparaisons multiples. n = 4-6 par groupe. FSC de diffusion vers l'avant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

fluorochrome	FITC	PE	PerCP	PC7		V500
			(Cy5.5)
Antigène	CD45.2	CD3	Ly-6G	CD19	Ly-6C	CD11b
La concentration finale [pg / ml]	5	1	0,2	0,2	1	1
Facteur de dilution	1100	1/200	1/1000	1/1000	1/200	1/200
Cloner	104	145-2C11	1A8	6D5	AL-21	M1 / 70

Tableau 1. Basic cocktail d'anticorps pour les cellules immunitaires d'identification dans le cerveau ischémique.

Discussion

Ici, nous décrivons une méthode simple et efficace pour l'isolement des leucocytes à partir du cerveau de souris après un AVC expérimental. L'approche donne de façon fiable le nombre de cellules hautement reproductibles par hémisphère du cerveau permettant de mesurer différents panneaux d'écoulement dans une répétition biologique.

Apparemment, une élimination incomplète des cellules immunitaires, y compris de sang se traduira par une vision déformée de la quantité réelle de cellules inflammatoires qui sont entrés dans le cerveau ischémique. Ainsi, lors de l'utilisation de ce protocole une attention particulière aux approfondie transcardial perfusion pour éviter la contamination des cellules immunitaires infiltrées avec leucocytes circulants non-inflammatoires. Par expérience, l'utilisation d'aiguilles émoussées pour ventricule gauche crevaison réduit le risque de blessure du septum interventriculaire qui contournerait perfusion de la circulation systémique. Émergence de liquide de perfusion par les narines est un signe que la perfusion pressureis trop élevé, donc undébits vides> 10 ml / min. Pale à la couleur blanche du tissu cérébral indique une bonne perfusion tout en couleur rosée est un signe de mauvaise perfusion.

Une autre étape cruciale de ce protocole est la dissociation efficace du tissu cérébral qui comprend la fragmentation mécanique ainsi que la digestion enzymatique. Hacher le tissu à travers le tamis de la cellule est essentielle pour assurer une meilleure efficacité de protéases. Toutefois, lorsque l'homogénéisation du tissu, d'éviter une pression excessive comme les phagocytes mononucléaires sont très sensibles à l'autolyse ^22. Pour la digestion enzymatique Libérase TL est recommandé qui est un mélange de collagénase hautement purifiée I et II, qui contient de faibles concentrations de la protease thermolysine neutre. La comparaison directe avec les protocoles d'isolement décrites précédemment ^14,22,23 révélées récupération significativement plus élevé de cellules viables par traitement Libérase TL (KM données non publiées). Par rapport à la collagénase qui est utilisent fréquemmentd pour l'isolement des cellules immunitaires du cerveau, Libérase TL contient des niveaux négligeables de l'endotoxine. Cela revêt une importance particulière si les cellules sont triés pour l'analyse en aval en raison des niveaux élevés d'endotoxines peuvent changer l'état d'activation des cellules immunitaires ²⁴ et gravement nuire à la culture cellulaire résultats ^25. Un autre inconvénient de la collagénase traditionnelle est différences lot-à-lot significatives dans les activités enzymatiques qui compromet la reproductibilité des résultats et exige de la détermination de la concentration de travail pour chaque ^{lot 26.}

Dans le cerveau adulte, le retrait de la myéline par centrifugation à gradient de densité est une étape indispensable pour des applications en aval telles que la cytométrie en flux ou d'autres études sur les gènes ou l'expression de la protéine. Un avantage majeur de ce protocole est la procédure de densité à couche unique qui ne nécessite pas de préparation fastidieuse des gradients. Par ailleurs, le protocole de séparation produit des résultats fiabless, même lorsqu'elle est effectuée par les expérimentateurs plutôt inexpérimentés. Elle est dépourvue de gradients couches ayant des densités proches les uns des autres qui sont difficiles à pipette sans perturber l'interface entre les deux.

Sur la base de l'expression du marqueur CD45 de surface, le protocole donne trois grandes catégories de cellules dans le cerveau ischémique. La grande majorité des cellules appartenant à une population négative CD45 qui est composé de cellules neuronales, les astrocytes, des cellules endothéliales et épendymaire. Leur présence abondante est attribué au gradient de densité à couche unique qui vise essentiellement à myéline efficace et l'enlèvement des débris. En outre, une population CD45 ^int représentant résident microglies ²⁷ peut être différenciée d'une ^grande population CD45 qui contient principalement leucocytes infiltrants hématogènes. Toutefois, il convient de noter que les microglies activées peut adopter le phénotype et la fonction des cellules myéloïdes sanguines-né. Ainsi, sophistiqué que l'applicationtechniques de d tels que parabiose ^28, la moelle osseuse chimères ²⁹ ou l'analyse de la cartographie sort ³⁰ permettre une distinction claire entre ces deux populations au cours de l'inflammation.

L'analyse des données de cytométrie en flux est souvent limitée à la répartition en pourcentage des populations de cellules spécifiques. Cependant, lorsque l'on compare l'infarctus hémisphère aux tissus du cerveau non-infarctus cette information peut être trompeur car il ne considère pas la numération totale cerveau de leucocytes qui sont changés par une lésion ischémique. Ainsi, de dresser un tableau complet sur l'ampleur et le phénotype des infiltrats inflammatoires après un AVC répartition relative des sous-ensembles de cellules immunitaires devrait être complété par le nombre de cellules absolues. Lors de l'utilisation des microbilles comme décrit dans ce protocole, le pipetage d'un volume d'échantillon précis est absolument obligatoire pour obtenir des résultats fiables. En outre, pipetage inverse est fortement recommandé d'éviter la formation de mousse dans le tube de comptage. Découlant des bulles d'airpermettra de réduire le volume prévu de microbilles et donc conduire à une surestimation des absolus CD45 ^{nombre élevé} de leucocytes dans l'échantillon.

En résumé, ce protocole offre une approche facile et fiable pour isoler les cellules immunitaires du cerveau. Il peut servir comme un outil précieux pour disséquer la complexité de la réponse inflammatoire à un AVC ischémique. Les applications futures comprennent des études sur le rôle en fonction du temps de sous-ensembles de monocytes dans la propagation et la résolution de l'inflammation cérébrale ischémique. De même, le rôle du système immunitaire adaptatif après un AVC est mal comprise. Cytométrie en flux de sous-populations de cellules T identifiés par l'expression de facteurs ou de cytokines transcription spécifique de sous-ensembles in situ pourrait aider à clarifier leur impact sur ​​la reprise à long terme après un AVC et avenues prometteuses ainsi ouvertes pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pompe péristaltique Peri-Star Pro,	instruments de précision World	PERIPRO-4LS
Incubateur CO2 Heracell 240i  ;	Thermo Scientific
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmbH
Heraeus Multifuge 3SR+	Thermo Scientific
FACS Canto II	Becton Dickinson
Isoflurane	Abbott	4831850
Hank’s solution saline tamponnée (HBSS)	Gibco/Life Technologies GmbH	14175-129
HBSS avec calcium/magnésium	Gibco/Life Technologies GmbH	24020-091
Liberase TL	Roche Diagnostics GmbH	5401020001
Percoll Plus	GE Healthcare Europe GmbH	17-5445-01
Sérum fœtal bovin  ;	PAN Biotech	3302-P101003
Trypan blue	Gibco/Life Technologies GmbH	15250-061
Trucount	BD Biosciences	340334
Saline tamponnée au phosphate	Biochrom AG	L 182-10
DNAse I	Roche Diagnostics GmbH	11284932001
CD11b Horizon V500	BD Biosciences	562128
CD16/CD32	eBioscience	14-0161
CD45.2 FITC	eBioscience	11-0454
CD3 PE	Biolegend	100307
CD19 PE-Cy7	Biolegend	115519
Ly6C APC-Cy7	BD Biosciences	560596
Ly6G PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	560602
Tube en silicone, 1 m	Instruments de précision mondiaux	503022
Ciseaux à iris fins tranchants	Outils de science fine	14094-11
Ciseaux chirurgicaux	Outils de science fine	14130-17
Ciseaux à iris fins tranchants/émoussés	Outils de science fine	14028-10
Pince droite 1 x 2 dents	Outils de science fine	11021-14
Pince à embout émoussé	Fine Science Tools	11008-13
Piston de seringue 5ml	Carl Roth GmbH (Braun)	EP96.1
Passoire à cellules, 100 & micro ; m	Dr. I. Schubert, BD	2360-00
Omnican Seringue à dosage fin 1 ml	Braun	TBD
Passoire cellulaire, 70 & micro ; m	Greiner Bio-One GmbH	542 070
FACS Tubes	BD Bioscience GmbH	352052
pipettes sérologiques, 10 ml	Greiner Bio-One GmbH	607180
pipettes sérologiques, 10 ml	Sarstedt AG& Co	861 254 025
pipettes sérologiques, 25 ml	Greiner Bio-One GmbH	760180
, 5 ml	Greiner Bio-One GmbH	606180
, 25 ml	Sarstedt AG& Co	861,685,020
pipettes sérologiques,5 ml	Sarstedt AG& Co	861 253 025
Pointes, 0,1 - 10 & micro ; l	Corning B.V.Life Sciences	4840
Pointes, 100 - 1 000 & micro ; l	Greiner Bio-One GmbH	740290
Pointes, 10 - 200 & micro ; l	Greiner Bio-One GmbH	739296
Tubes à réaction 1,5 ml	Greiner Bio-One GmbH	616201
Tubes à réaction 2 ml	Greiner Bio-One GmbH	623201
Boîte de Pétri bactériologique, 94 x 16 mm	Greiner Bio-One GmbH	633180
Falcon 15 ml	Greiner Bio-One GmbH	188271
Falcon 50 ml	VWR International GmbH (BD)	734-0448
Neubauer hémocytomètre	Biochrom AG	PDHC-N01
lame de rasoir	Carl Roth GmbH	CK07.1