L'isolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant

Résumé

Présenté ici est une méthode simple pour l'isolement et le flux analyse cytométrique de cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant qui donne des données quantitatives en fonction du temps sur le nombre et le statut activation des cellules immunitaires qui entrent dans le microenvironnement de tumeur cérébrale tôt.

Résumé

Notre laboratoire a démontré récemment que les cellules tueuses naturelles (NK) sont capables d'éradiquer GL26 de souris orthotopique implanté et rat CNS-1 gliomes malins peu de temps après la prise de greffe intracrânienne si les cellules cancéreuses sont rendues déficientes dans l'expression de la lectine galectine β-galactoside liaison -1 (gal-1). Des travaux plus récents montre maintenant que une population de GR-1 des cellules myéloïdes ⁺ / CD11b ⁺ est essentiel à cet effet. Pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels les NK et les cellules myéloïdes coopèrent pour conférer rejet de tumeur gal-1-deficient nous avons mis au point un protocole détaillé pour l'isolement et l'analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant (PBMC). La méthode est mise en évidence en comparant les PBMC ici infiltration dans le microenvironnement tumoral de Gal-1 exprimant GL26 gliomes avec ceux-gal rendu déficient par une shRNA-knockdown. Le protocole commence par une description de la façon dont la culture et de préparer GL26 CElls pour l'inoculation dans le cerveau de souris C57BL / 6J syngénique. On explique ensuite les étapes impliquées dans l'isolement et l'analyse par cytométrie flux de PBMC de gliome infiltrant du micro-environnement de la tumeur cérébrale précoce. Le procédé est adaptable à un certain nombre de modèles expérimentaux in vivo dans lequel des données temporelles sur infiltration immunitaire dans le cerveau est nécessaire. La méthode est sensible et hautement reproductibles, comme des PBMC de gliome infiltrant peuvent être isolées à partir de tumeurs intracrâniennes dès que la prise de greffe de post-tumeur 24 h avec le nombre de cellules observées similaires de points appariés de temps tout au long de tumeurs expériences indépendantes. Un seul expérimentateur peut réaliser le procédé à partir de cerveau de récolte de circuler analyse cytométrique des PBMC de gliome infiltrant dans environ 4-6 heures selon le nombre d'échantillons à analyser. Modèles de gliome alternatifs et / ou de détection des anticorps spécifiques de cellules peuvent également être utilisés à la discrétion des expérimentateurs pour évaluer l'infiltration de plusieurs autres immune types cellulaires d'intérêt sans la nécessité de modification de la procédure globale.

Introduction

Les gliomes sont une classe de cancers du cerveau résultant de la glie neuro-épithéliales transformées dans le système nerveux central (SNC). De tous les gliomes, Organisation mondiale de la Santé (OMS) de grade IV gliome, ou le glioblastome (GBM), est la plus fréquente et mortelle ^1. GBM est hautement réfractaire au traitement standard-de-courant qui se compose de résection de la tumeur dans la mesure du possible, plus suivie d'une radiothérapie chimiothérapie concomitante et adjuvante avec ² témozolomide. Ces cancers mortels portent un pronostic sombre de seulement 15-18 mois de survie à partir du moment du diagnostic initial avec seulemen....

Protocole

Note: S'il vous plaît examiner l'ensemble du protocole avant d'effectuer des expériences. Approbation de l'utilisation des animaux vertébrés du comité institutionnel approprié sur l'utilisation et le bien-être des animaux doit être obtenu avant de procéder.

1. Préparation des cellules tumorales pour intracrânienne prise de greffe

1. Travailler dans une enceinte de sécurité biologique de classe II, commencez par préparer GL26-Cit-NT / gal1i milieux de culture cellulaire en complétant une bouteille de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) de 500 ml avec du sérum fœtal bovin 10% filtration stérile inactivé par l....

Résultats

La stratégie de déclenchement suivant est utilisé pour une expérience typique: FSC-A vs SSC-A → SSC-H vs SSC-W → FSC-H vs FSC-W → CD45 vs. comptage → Gr-1 contre CD11b → NK1.1 contre comptage. Gates a mis sur Gr-1 ⁺ / ⁺ CD11b cellules myéloïdes et les cellules NK NK1.1 ⁺ sont ensuite stratifié basé sur l'expression GZMB (figure 5A). Backgating ces cellules identifiées comme des cellules NK et NK1.1 ⁺ Gr-1 ⁺ / ⁺ CD11b cellules myéloïde.......

Discussion

Ce protocole décrit un procédé robuste et reproductible pour l'isolement et l'analyse cytométrique en flux de cellules PBMC qui ont infiltré le micro-environnement de la tumeur du cerveau de la souris au début. Des suspensions de cellules de gliome sont générées à une concentration spécifiée par l'expérimentateur qui sont greffées stéréotaxique dans le striatum du cerveau de la souris. Les souris sont ensuite euthanasiés à des points de temps prédéterminés spécifiés par le protocole expérimental et leurs cer.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco' s Modification de Eagles Medium	Gibco	12430-054	avec 4,5 g/L de D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES et rouge de phénol.
Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate  ;	Gibco	14190-144  ;	sans chlorure de calcium ni chlorure de magnésium
Sérum fœtal bovin	Omega Scientific Inc.	FB-11
Pénicilline Streptomycine  ;	Gibco	15140-122	10 000 U/ml Pénicilline ; 10 000 &mu ; g/ml Streptomycine  ;
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM
G418 sulfate  ;	Omega Scientific Inc.	GN-04
Dichlorhydrate de puromycine  ;   ;	Sigma-Aldrich	P8833	de Streptomyces alboniger
HyClone HyQTase non-mammifère trypsine alternative  ;	Thermo Scientific	SV30030.01	en DPBS avec EDTA  ;
Hémocytomètre à contraste de phase	Sigma-Aldrich	Z359629	0,1 mm de profondeur
Coloration au bleu trypan	Gibco	15250-061
Injection stérile de NaCl à 0,9 %, USP	Hospira	NDC : 0409-4888	Flacons de 10 ml
Microtubes coniques en polypropylènes de 0,6 ml	Genesee Scientific	22-272
Injection de chlorhydrate d’atipamézole	Orion Pharma	NDC : 52483-6298	Solution 5 mg/ml
Chlorhydrate de kétamine injectable	Fort Dodge	NDC : 0409-2051	Solution 100 mg/ml Chlorhydrate
dexmédétomidine injectable	Zoetis	NDC : 54771-2805	Solution 0,5 mg/ml Chlorhydrate
de xylazine injectable	Lloyd	NDC : 61311-481	Solution 100 mg/ml
Injection de carprofène	Pfizer	NDC : 61106-8501	Solution 50 mg/ml
Chlorhydrate de buprénorphine injectable	Reckitt Benckiser	NDC : 12496-0757	0,3 mg/ml ampoules
1 ml seringues de tuberculine  ;	Covidien	8881501400
26G x ½ ; aiguilles de seringue (0,45 mm x 13 mm)	BD	305111
Tondeuse chirurgicale	3M	9661
Solution de providone iodée	Aplicare	82-217	NDC : 52380-1905
Pommade ophtalmique à base de vaseline stérile  ;	Dechra	NDC : 17033-211
Tampons de préparation à l’alcool isopropylique à 70 %	Kendall	6818
Gaze stérile	Covidien	8044	non tissée, 4 » x 4 », 4 plis  ;
Microtubes coniques en polypropylène de 1,7 ml	Genesee Scientific	22-281
Cadre stéréotaxique de souris	Stoelting	51730
Lampe chirurgicale	Philips Burton	CS316W	Coolspot II Projecteur variable
Pince de dissection incurvée	Ted Pella Inc.	5431
Enrouleurs Colibri  ;	FST	17000-03
Perceuse électrique de précision sans fil	Dremel  ;	1100-01	Modèle de stylet ; 7,2 volts Lithium-Ion avec station d’accueil
Coupe-gravure	Dremel	105	1/32" ou 0,8 mm de diamètre
Seringue Microliter	Hamilton	75	Hamilton Seringues Microliter série 700 ; 5 &mu ; l volume
Microliter seringue	Hamilton	7762-06	33 G, petit moyeu RN NDL, 1,5 po, point style 3, 6/PK
Ethilon 3-0 noir monofilament nylon sutures  ;	Ethicon	1663
Barre d’agitation magnétique	VWR	74950-296	7,9 mm de diamètre x 50 mm de longueur (5/16 » de diamètre x 2 » de longueur)
1 L de bouteille de stockage en verre à bouchon à vis	Corning	1395	Type 1, verre borosilicaté de classe A
Héparine sodique  ;	Sagent	NDC : 25021-400	Solution 1 000 U/ml
Pompe péristaltique	Cole Parmer Instruments Group	77200-60	Master Flex Easy Load II Console Drive
carbogen compressé (95 % O2 / 5 % CO2)	disponible auprès du fournisseur local	N/A	Type A, grande bouteille  ;
20 g x 1 & frac12 ; " Aiguilles émoussées à moyeu en aluminium	Kendall	8881202363	0,9 mm x 38,1 mm
Seau à glace en polyuréthane	Fisherbrand	02-591-45	Capacité : 0,152 oz (4,5 L)
Collagénase (Type I-S)	Sigma Aldrich	C1639	de Clostridium histolyticum  ;
Désoxyribonucléase I	Worthington Biochemical Corp.	LS002007	>2 000 unités Kunitz par mg poids sec
Boîtes de pesée hexagonales en polystyrène antistatique	Ted Pella Inc.	20157-3	D.I. supérieur 115 mm, D.I. de la base 85 mm, volume de 203 ml  ;
Lames de rasoir à simple tranchant en acier inoxydable  ;	Garvey	40475
Rongeurs à os	FST	16001-15
Hemostat	FST	13014-14
Ciseaux de grande dissection	Ted Pella Inc.	1316
Ciseaux de dissection	FST	14094-11
Pince à bout émoussé	Ted Pella Inc.	13250
7 ml verre Broyeur de tissus Dounce	Kontes	KT885300-0007
Percoll Density Média de centrifugation  ;	GE Healthcare	GE17-0891-01
Pipettes sérologiques de 10 ml	Genesee Scientific	12-104	à usage unique ; stériles
70 &mu ; Filtres à cellules en nylon stérile M  ;	Fisherbrand	22363548
Alexa Fluor 700-conjugué anti-souris CD45 (clone : 30-F11)	Biolegend	103128
souris conjuguée APC anti-souris NK1.1 (clone : PK136)	eBiosciences  ;	17-5941-82
Anti-souris de rat conjugué PE Gr-1 (clone :RB6-8C5)	BD Pharmigen	553128
PerCP/Cy5.5-anti-souris CD11b (clone : M1/70)  ;	Biolegend	101228
Alexa Fluor 700-rat conjugué IgG2b, &kappa ; (clone : RTK4530) contrôle des isotypes  ;	Biolegend	400628
souris IgG2a conjuguée à l’APC, &kappa ; (clone : eBM2a) contrôle des isotypes  ;	eBioscience	17-4724
IgG2b de rat conjugué au PE, &kappa ; (clone : eB149/10H5) contrôle des isotypes  ;	eBioscience	12-4031-82
IgG2b de rat conjugué PerCP/Cy5.5, &kappa ; (clone : RTK4530) contrôle d’isotype	Biolegend	400632
souris conjuguée au bleu du Pacifique anti-granzyme B de souris (clone : GB11)  ;	Biolegend	515403
souris conjuguée au bleu du Pacifique IgG1, &kappa ; (Clone : MOPC-21) contrôle des isotypes  ;	Biolegend	400151
Cytofix/Cytoperm	BD	554714
tubes à centrifuger en polypropylène de 15 ml	Genesee Scientific	21-103	à fond conique.
Tubes à centrifuger en polypropylène de 50 ml	Genesee Scientific	21-108	à fond conique
12 mm x 75 mm tubes FACS en polypropylène à fond rond.	Fisherbrand	14-956-1B
FACSAria Special Order Research Produit cytomètre/trieur de cellules en flux	BD  ;
Armoire de sécurité biologique de classe II	The Baker Company	SG603	modèle : SterilGARD III Advance