Voici un protocole pour cultiver des cellules souches pluripotentes (CSP) et des cellules souches neurales (CSN) dans un système de culture cellulaire fermé qui permet une stérilité et une reproductibilité maximales, remplaçant l’enceinte de biosécurité et l’incubateur traditionnels. Cet équipement est conforme aux directives de bonnes pratiques de fabrication clinique (cGMP) et de bonnes pratiques de laboratoire clinique (cGLP).
Article de méthode
La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cet article décrit comment utiliser un système de culture cellulaire fermé fabriqué sur mesure et disponible dans le commerce pour la recherche fondamentale et préclinique. Les enceintes de biosécurité (BSC) et les incubateurs sont depuis longtemps la norme pour la culture et l’expansion des lignées cellulaires pour la recherche fondamentale et préclinique. Cependant, comme de nombreux laboratoires de cellules souches passent de la recherche fondamentale à l’application clinique, des exigences supplémentaires sont nécessaires pour le système de culture cellulaire. Tous les processus doivent être bien documentés et présenter des exigences exceptionnelles en matière de stérilité et de reproductibilité. Dans les incubateurs traditionnels, les concentrations de gaz et les températures fluctuent considérablement chaque fois que les cellules sont retirées pour l’alimentation, le passage ou d’autres manipulations. De telles interruptions contribuent à un environnement qui n’est pas la norme pour les directives cGMP et GLP. Ces interruptions doivent être minimisées, en particulier lorsque les cellules sont utilisées à des fins thérapeutiques. La motivation pour passer du système standard des BSC et des incubateurs à un système fermé est que ces interruptions peuvent être rendues négligeables. Les systèmes fermés offrent un espace de travail pour nourrir et manipuler les cultures cellulaires et les maintenir dans un environnement contrôlé où la température et les concentrations de gaz sont constantes. De cette façon, les cellules souches pluripotentes et multipotentes peuvent être maintenues en bonne santé depuis le moment de leur dérivation jusqu’à leur utilisation éventuelle en thérapie.
Introduction
Les techniques standard de culture de cellules souches souffrent de plusieurs contraintes environnementales qui exercent des contraintes excessives sur les cellules et les exposent à des risques inacceptables de contamination. Parmi les stress que les cellules peuvent supporter dans des conditions de culture cellulaire standard, on trouve des changements précipités dans les niveaux de concentrations de dioxyde de carbone et d’oxygène3,4. Cela se produit lorsque les cellules sont déplacées de l’incubateur à l’enceinte de biosécurité et/ou au microscope, ce qui peut ne pas être optimal pour les cellules. Des études antérieures ont confirmé les avantages de la culture de cellules souches pluripotentes et neurales dans des conditions hypoxiques4,11, et pour de meilleurs résultats, ces conditions doivent être continues. De plus, les risques de contamination cellulaire sont plus élevés car l’environnement et le personnel du laboratoire empiètent sur les cellules à presque chaque étape de leur culture et de leur manipulation. Les salles blanches traditionnelles constituent une méthode efficace pour réduire considérablement les risques de contamination, mais elles sont coûteuses, ont une empreinte importante et ne parviennent pas à résoudre les facteurs de stress liés aux concentrations de dioxyde de carbone et d’oxygène.
Une installation de production de cellules capable de gérer à la fois les risques de contamination et les concentrations de gaz et qui peut être qualifiée pour répondre aux critères cGMP9 fournit des cellules de haute qualité pour la recherche scientifique fondamentale ainsi que pour les applications cliniques1,6,7. Une telle installation de production cellulaire se compose, au minimum, des éléments suivants : une chambre de traitement, qui agit comme un espace de travail chauffé pour l’alimentation et la manipulation des cultures cellulaires ; une hotte à flux laminaire, pour la stérilisation initiale des réactifs, des tubes et des outils ; deux chambres de sas tampons entre la hotte et la chambre de traitement ; deux incubateurs de culture cellulaire accessibles depuis la chambre de traitement ; une chambre de microscope adjacente à la chambre de traitement ; et enfin, des logiciels informatiques pour définir et surveiller les conditions à l’intérieur de ces modules. À l’aide de cette infrastructure de base, une grande variété de tâches peuvent être effectuées, telles que l’alimentation et le passage standard de cellules souches pluripotentes et de cellules souches neurales multipotentes, ainsi que des méthodes plus spécialisées telles que la reprogrammation basée sur le virus Sendai, les études de migration in vitro et la différenciation des cellules souches neurales pour la caractérisation électrophysiologique.
Protocole
1. Configuration initiale
- Réglage de gaz et de température Concentrations
- En utilisant le logiciel, cliquez sur l'onglet "Invité" situé dans le coin supérieur gauche de l'interface graphique. Connectez-vous au système en utilisant un nom d'utilisateur et mot de passe désigné. Assurez-vous que chaque utilisateur a son propre nom d'utilisateur et mot de passe.
- Cliquez sur un module pour régler (Figure 1). Dans la nouvelle fenêtre affichant les paramètres actuels, cliquez sur l'O 2 valeur de consigne existant ci - dessous "Point de consigne" et entrez le O 2 niveau de concentration requis pour ce module. Entrez 5% O 2 si les cellules souches pluripotentes seront cultivées ou manipulés dans ce module, et 9% O 2 si les cellules souches neurales seront cultivées ou manipulés. Cliquez sur la coche verte pour confirmer le point de consigne.
Remarque: Deux modules ne sont pas réglables gaz: la hotte laminaire la chambre de microscope, et. Les concentrations de gaz dans la hotte à flux laminaire sont whil atmosphériquee ceux de la chambre de microscope sont passivement maintenues par les concentrations de gaz dans la chambre de traitement. - Répétez cette étape pour CO 2. Entrez un point de 5% de CO 2 fixé pour tous les modules , sauf pour les chambres tampons, qui ne sont réglables pour O 2.
- Surveiller les concentrations de gaz actuelles, qui sont étiquetés comme «valeurs de processus», pour faire en sorte qu'ils atteignent les nouveaux points de consigne.
- Ajustez les points de tous les modules de réglage de gaz sur les valeurs appropriées. Faites correspondre les CO 2 et O 2 niveaux de chambres qui seront exposés les uns aux autres. Par exemple, régler la chambre de traitement à 5% O 2 avant d' ouvrir un incubateur qui pousse les cellules à 5% O 2. Ajustez également à 5% O 2 toute la chambre de tampon qui est utilisé pour ajouter des éléments à la chambre de traitement pendant cette période.
- Régler la température de la chambre de traitement à 37 ° C en utilisant le même écran pour les réglages de gaz. Réglez également le processus chambre ftempérature loor à 37 ° C.
- Cliquez sur les rives du module d'incubation sous chaque incubateur. Réglez la température des banques à 37 ° C.
- Fonctionnement du tampon Chambers
- Rassemblez toutes les fournitures nécessaires à la tâche donnée (alimentation, le fractionnement, la coloration, etc.) dans le début afin d' éviter un retard dans le flux de travail. Généreusement pulvériser tous les matériaux avec 70% d'éthanol et laissez-les sécher dans la hotte laminaire. Ne pas pulvériser des flacons ou des plaques de cellules - essuyez-les délicatement avec une éponge de gaze stérile saturé avec 70% d'éthanol.
- Assurez-vous que les portes extérieures et intérieures de la chambre tampon sont bien fermés. Ouvrez ensuite la porte extérieure, et placer les objets à l'intérieur.
- Fermez la porte extérieure. Dans le logiciel, sélectionnez le module de mémoire tampon, et cliquez sur l'onglet facteur de dilution. Saisissez 1 dans la zone de facteur de journal. Cliquez sur Démarrer.
Note: Un «facteur de dilution" est défini comme signifiant que l'atmosphère de la mémoire tampon le module seraêtre évacué et remplacé 1 fois avec, gaz de filtre HEPA propre. - Une fois l'interface graphique a cessé de clignoter "facteur de dilution", ouvrir la porte intérieure de la mémoire tampon chambre et amener les matériaux à l'intérieur de la chambre de traitement.
Attention: Ne pas laisser les portes intérieures et extérieures à jamais être ouverts en même temps et ne pas ouvrir la porte intérieure si la chambre tampon n'a pas subi un facteur de dilution. - Pour supprimer des éléments de la chambre de traitement, assurez-vous d'abord que la chambre tampon a subi un facteur de dilution. Ensuite, ouvrez la porte intérieure, placer les articles à être enlevés à l'intérieur, et fermer la porte intérieure. Ensuite, ouvrez la porte extérieure et enlever les articles.
Note: Un facteur de dilution ne doit pas être exécuté avant d'ouvrir la porte extérieure.
2. Présentation et de l'alimentation des cellules
- Incubateur Setup
- Placez 3 boîtes de Petri dans la casserole d'eau à la base de chaque incubateur. Remplissez ces plats avec sterileau e. Ne pas remplir directement le bac à eau. Maintenir le niveau d'eau dans ces plats, car ils sont essentiels pour le maintien de l'humidité relative (HR) point de consigne dans les incubateurs.
- Dans l'interface graphique, cliquez sur l'incubateur. Cliquez sur la valeur existante de l'humidité relative (HR) au point de consigne et entrez 85%. Cliquez sur la coche verte pour accepter cette valeur.
- Préparation de la Cellule installation de production pour les cellules
- Si pas déjà fait, régler les chambres tampons, la chambre de traitement, et un incubateur pour les points de consigne de gaz requis pour le type de cellule qui est introduite.
- Nettoyer la surface de la chambre de traitement avec de la gaze stérile et un désinfectant non-inflammable. Ne pas utiliser un désinfectant à base d'acide peracétique, comme dans un système fermé les forts, les vapeurs persistantes sont toxiques pour les cellules de mammifères. Au lieu de cela, utiliser des produits à base de chlorure de benzalkonium.
- Continuer la désinfection. Nettoyer les gants et les surfaces qui sont commoeul touché, comme les poignées de porte. Utilisez le désinfectant à fond, mais avec parcimonie, comme l'excès de liquide dans la chambre de traitement contribuera à l'humidité, la condensation et la croissance microbienne possible.
- Nettoyer la surface de la hotte à flux laminaire et tampon chambre avec 70% d'éthanol, et laisser sécher. Placer le ballon ou d'une plaque de cellules (dans notre cas, PSCs ou NNC) dans le capot, et brièvement essuyez sa surface extérieure avec une éponge de gaze stérile saturé avec de l'éthanol.
- Mettez le flacon ou d'une plaque dans la chambre tampon, et exécuter un facteur de dilution (étape 1.2.3).
- À l'achèvement du facteur de dilution, de déplacer immédiatement la fiole ou de plaque dans l'incubateur approprié. Comme les incubateurs sont à l'arrière de la chambre de traitement, tirer une étagère dans la chambre de traitement pour le placement de la cellule. Évitez d'ouvrir les portes de l'incubateur inutilement ou pendant des périodes de temps prolongées, comme l'air de la chambre de processus est très sec par rapport à celle des incubateurs, et se traduira par une importantela perte d'humidité dans l'incubateur.
- Nourrir Cultures cellulaires
- Rassembler les composants du milieu, des pipettes sérologiques, une pipette électronique, de la gaze et de désinfectant. recueillir également un conteneur de déchets pour passé un milieu de culture cellulaire, mais ne pas remplir avec l'eau de Javel. Apportez les matériaux dans la chambre de traitement à travers une chambre tampon comme décrit dans la section 1.2. Préparer un milieu de culture cellulaire dans la chambre de traitement, comme décrit précédemment 9,10- (voir également le tableau Matériaux)
- Disposer les matériaux d'une manière telle à permettre à un espace de travail optimale. Évitez de placer des objets non utilisés dans le centre de la chambre de traitement.
- Prévoir le moyen d'équilibrer avec les CO 2 et O 2 niveaux présents dans le système en laissant le récipient médiatique légèrement non plafonné. Certains fabricants de taille de la CFP indiquent ne pas réchauffer les médias à 37 ºC; si tel est le cas, utiliser une chambre tampon pour équilibrer le milieu. Laissez le moidium à équilibrer pendant 20 min.
- Retirez l'ancien milieu de puits à l'aide d'une pipette stéréologique appropriée et une pipette électronique. Pour PSCs, supprimer tous, mais une petite quantité restante de l'ancien milieu, assez pour empêcher la dessiccation pendant le processus d'alimentation. Pour NSCs, retirer la moitié de l'ancien milieu. Pipet les déchets dans le conteneur de déchets.
- Placez la pipette utilisée de nouveau dans son emballage d'origine et le déplacer vers le côté de la chambre de traitement, ou dans une chambre de tampon désigné pour l'élimination des déchets. Avec une pipette sérologique stérile fraîche, ajouter du milieu frais à la cellule des plaques de culture et placer les plaques de nouveau dans leur incubateur désigné.
- A la fin de l'alimentation, vaporiser la gaze avec un désinfectant et nettoyer les planchers et les poignées de porte de la chambre de traitement en profondeur. Si plusieurs lignées de cellules cultivées dans le système, la stérilisation entre l'alimentation de chaque lignée cellulaire. Cela permet de minimiser le risque de contamination croisée.
- À la fin, éliminer les déchetsou d'autres éléments inutiles à travers l'une des chambres tampons.
3. Cultures Fractionnement cellulaires
- Enzymatic repiquage de PSCs ou NSCs
- Rassemblez tous les éléments nécessaires pour repiquage. Cela inclut les médias, une enzyme ou un tampon de dissociation cellulaire non enzymatique (celle-ci est pour NSCs seulement), DPBS, plaques ou flacons, matrice extracellulaire (ECM), tubes coniques, et pipettes sérologiques. Apportez-les dans le système en utilisant une chambre tampon.
- Manteau des plaques fraîches ou flacons avec ECM, tels que décrits précédemment 9,10. Certains ECM -comme celles dérivées de lignées cellulaires de sarcome de souris - ne sont liquides entre 4 et 15 ° C, afin d'utiliser un pack stérilisée de bloc ou de la glace de gel froid pour garder le froid de l'ECM tout en travaillant dans la chambre de traitement chauffée.
- Pipet hors du milieu usé de la culture et de la jeter dans le conteneur de déchets.
- Rincer la surface du puits ou un flacon en utilisant 1 ml de DPBS / puits et disposer de la DPBS.
- Ajouter 1 - 2ml d'enzyme chaude à chaque puits. Seules les cultures très denses ont besoin de 2 ml.
- Déplacer immédiatement la boîte de culture ou un flacon à la chambre de microscope, et observer la culture attentivement. Surveillez les signes de cellules individuelles commencent à desserrer hors du plat. Ne pas attendre jusqu'à ce que les cellules flottent en suspension avant de passer à l'étape suivante.
- Remettre les cellules à la chambre de traitement principale. À l'aide d'une pipette de 5 ml sérologique, ajouter 4 ml de DPBS pour chaque 1 ml d'une enzyme, puis pipeter avec force vers le haut et vers le bas pour déloger les cellules de la surface du puits. Si repiquage plusieurs puits dans une plaque multiplis, ajouter les DPBS à chaque puits avant délogeant les cellules des puits individuels.
- Transférer l'enzyme et du PBS suspension cellulaire à un tube conique de taille appropriée.
- Si une centrifugeuse ne sont pas disponibles dans l'installation de production de cellules, fermer hermétiquement le tube conique, le placer dans une chambre tampon et à sceller la porte fermée.
- Retirez le tube conique du bufchambre fer à partir du côté d'écoulement laminaire et à faire tourner les cellules à 100 xg pendant 5 min à température ambiante.
- Pulvériser le tube conique de 70% d'éthanol, et l'amener dans la chambre de traitement à l'aide d'une chambre tampon et un facteur de dilution.
- Pipet le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 ml de PSC ou moyenne NSC. Si PSCs repiquage, assurez - vous d'inclure un inhibiteur de ROCK dans le milieu à une concentration de 10 uM, comme décrit précédemment 9,10.
- Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre, et déterminer le nombre de puits ou des plaques requises. PSCs Plate à 5 x 10 4 - 1 x 10 5 cellules / cm 2. Divisez les NNC à un rapport 1: 2.
Remarque: NSCs agglutiner souvent et résister à un comptage précis dans un hémocytomètre. - Si la cryoconservation des cellules est nécessaire, suivre le protocole approprié 9,10, mais veiller à ce que toutes les fournitures et les médias de congélation sont préparés à l' avance et placés à l' intérieur de la chambre de traitement. DMSO est très toxique pour les cellules à 376; C, donc travailler très rapidement. Conserver le récipient de congélation isopropanol-chemisé à la température ambiante dans la hotte à flux laminaire. Une fois les flacons de cryoconservation sont remplis et scellés, retirer immédiatement les flacons de la chambre de traitement par passage dans une chambre tampon.
- Repiquage manuel de PSCs
- Assurez -vous que la culture doit être repiquées, comme décrit précédemment 8. Si oui, préparer des plaques ou flacons revêtus de la matrice extracellulaire frais. Ensuite, changer le milieu entièrement.
- Nettoyer la chambre de microscope avec de la gaze stérile humidifié avec une quantité d'épargne désinfectant non inflammable - trop se traduira par un excès buée dans la chambre. nettoyer Seuls les gants, la surface de plancher, et la scène. Apportez plusieurs embouts de pipettes emballés individuellement 200 pi ou 1000 pi dans la chambre.
- Apportez la plaque de PSCs dans la chambre de microscope, retirez le couvercle et placez-le face vers le bas sur le plancher fraîchement nettoyée. Laissant le couvercle en place expose la dir inférieureectement aux courants d'air, et de contamination potentielle.
- Déballer une pointe de pipette, et en utilisant le microscope pour visualiser la culture, chercher en dehors de colonies qui ont une bonne morphologie en utilisant la pointe de la pipette.
Remarque: La pointe de la pipette peut être attaché à une pipette si l'utilisateur individuel trouve cela plus confortable. - Remettre le couvercle sur la plaque, et déplacer la plaque arrière de la chambre de traitement.
- Pipet l'excès ECM à partir de la nouvelle plaque, et de transférer les médias de l'ancienne plaque (contenant les morceaux de colonies en suspension) à la nouvelle plaque. Si l'ancienne plaque contient encore des colonies qui ne sont pas prêts à être cueillis, le nourrir ainsi.
4. Techniques spécialisés Culture
- Sendai transduction des fibroblastes en PSCs
- Dans le centre de production de cellules, développez fibroblastes de peau humaine 1 dans les milieux de fibroblaste contenant DMEM / F12, 10% de FBS, et 20 ng / ml FGF2, à 5% O 2. Utilisez 6 puits culture dishes revêtu de gélatine à 0,1%.
- Préparer les cellules à transduction en les dissociant avec 1 ml de trypsine à 0,25% par puits. Inactiver la trypsine avec du milieu 1 ml de fibroblaste. Centrifuger à 200 x g, remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu fibroblaste et les compter en utilisant un hémocytomètre.
- Resuspendre 2.0 x 10 5 cellules dans 2 ml de milieu de fibroblaste, et ajouter la suspension de cellules à 1 puits d'une plaque de 6 puits revêtu de gélatine (2,1 x 10 4 cellules / cm 2). Mettez les cellules dans l'incubateur.
- Autoriser 24 h pour les cellules de se fixer au fond de la plaque.
- Placez milieu de fibroblaste frais à l'intérieur de la chambre de traitement (1 ml de milieu par puits de cellules à transduites), et le laisser se stabiliser aux gaz.
- Stériliser un bloc pré-refroidi à froid avec 70% d'éthanol et le placer dans une chambre tampon. Utilisez un sac de glace de gel avec des trous découpés dans si un bloc froid commercial ne sont pas disponibles.
Note: Il y a 3 - 4 Sendai séparéevirus (selon la version du kit de transduction), qui doit être décongelé rapidement, mais maintenu dans le bloc froid une fois décongelé. - Trempez la moitié inférieure des tubes dans un bain d'eau à 37 ° pendant 15 secondes (ne pas plonger les tubes), puis nettoyer immédiatement les extérieurs de tube avec 70% d'éthanol. Placer les tubes sur le bloc froid stérilisé dans la chambre tampon et exécuter un facteur de dilution.
- Travailler rapidement, ajouter le volume nécessaire de chaque virus Sendai de reprogrammation dans le milieu équilibré 2. Ce volume est déterminé par trois variables - le nombre de cellules, le titre de chaque virus et la multiplicité d'infection souhaitée pour chaque virus. Consultez le manuel du kit pour MOI recommandé. La formule est la suivante:
[(Nombre de cellules étant transfectées) (multiplicité d'infection) (1000)] / (titre viral) = obligatoire ul du virus - Retirer le surnageant du puits (s) de cellules à être reprogrammé. Pour chaque puits, ajouter 1 ml de medium contenant les virus. Agitez doucement la plaque, en faisant attention à ne pas renverser les médias, et de placer la plaque arrière dans le 5% O 2 incubateur.
- Après 2 h balancer doucement la plaque à nouveau et répéter après l'autre 2 heures.
- Après 24 heures (jour 1 post-transduction), alimenter le puits avec 1 ml de milieu de cellules souches pluripotentes. Répétez le jour 2, mais ne pas enlever moyen du puits.
- Aux jours 3 et 4, changer la moitié du milieu.
- Le jour 5 et au-delà, changer l'ensemble du milieu.
- Lorsque les colonies apparaissent, tacher la culture en utilisant des anticorps stériles pour confirmer que les colonies sont en effet pluripotentes, comme décrit précédemment 2. Comme dans le cas des cellules d'alimentation, en sorte que les médias PSC contenant les anticorps a été équilibrée aux gaz dans l'installation de production de cellules.
Remarque: Dans une reprogrammation réussie, les colonies iPSC devraient être présents environ deux semaines après la transduction 1. - Lorsque les colonies se sont développées à grandeassez, utiliser le microscope pour marquer et passage mécaniquement les sur une plaque d'ECM revêtu, comme décrit dans la section 3.2.
- Développez les colonies manuellement ou par voie enzymatique, comme décrit précédemment 9,10.
5. Nettoyage après usage quotidien
- Placer tous les déchets, y compris le ballon de déchets liquides, dans une chambre de tampon stérile. Essuyez la surface de la chambre de traitement et toutes les zones qui ont été en contact par des fournitures avec de la gaze stérile et désinfectant non-inflammable.
- Retirer tous les déchets solides de la chambre tampon et jeter dans le conteneur de déchets.
- Jeter les déchets liquides dans un récipient de récupération approprié, ou tout simplement mélanger avec l'eau de Javel et versez dans le drain. Nettoyez le bac à déchets avec du savon et une brosse. Stériliser le récipient avec 70% d'éthanol et le ramener dans la chambre de traitement par l'intermédiaire d'une chambre tampon.
Remarque: Il est recommandé de ne pas utiliser l'eau de Javel dansle conteneur de déchets pendant qu'il est à l'intérieur du système, comme les fumées de blanchiment peuvent recirculer et nuire à des cultures de cellules. - Pour des raisons d'hygiène, essuyer la surface en plastique avant de la chambre de traitement du système avec 70% d'éthanol. Cela aide à nettoyer les huiles de sueur et de la peau du front de l'utilisateur.
- Si la condensation a construit à l'intérieur de la chambre de traitement, exécutez un facteur de dilution pour effacer la condensation. Attendre au moins 1 heure pour que cela complète.
6. Tâches courantes non quotidiens
- Reconstituer les plats d'eau dans les incubateurs de culture cellulaire avec de l'eau distillée stérile, au besoin. Terminez les plats au moins une fois par semaine. Cependant, le taux d'évaporation fluctue en fonction de la fréquence des portes de l'incubateur sont ouvertes, le volume de liquide dans les cultures, et les réglages de l'incubateur.
- Une fois par mois, recalibrer les O 2 et CO 2 paramètres dans toutes les chambres. Cela nécessite l'utilisation de SPAN (calibration) du gaz, qui contains connues concentrations niveaux de O 2 et CO 2 en tant que norme de référence. Assurez-vous que l'offre de gaz SPAN adéquat avant de commencer le calibrage. Le système utilise des capteurs de gaz spécifiques, situés dans chaque module pour détecter les concentrations de gaz; ainsi, l'utilisation de gaz SPAN de haute qualité assure que les capteurs produisent de manière fiable les concentrations de gaz précises.
- Remplacer les gants dans la chambre de traitement et la chambre de microscope sur une base régulière. Remplacer les gants tous les 2 mois, indépendamment de la fréquence du système est utilisé. Avant l'installation, stériliser les nouveaux gants avec un désinfectant. Exécuter un facteur de dilution sur la chambre de traitement après que les gants ont été remplacés.
Remarque: Lorsque tendue sur les poignets du système, des gants en nitrile ont tendance à développer des trous dans les zones exposées à un stress physique et de la chaleur. Ceci est normal et l'usure inévitable et à la déchirure. - Changez les filtres de seringues dans toutes les chambres tous les 6 mois.
- Remplacez ou nettoyez-til préfiltre sur la hotte à flux laminaire dès qu'il commence à apparaître sale.
- Reportez-vous aux documents du fabricant régulièrement des informations sur le remplacement des pièces principales.
7. Le nettoyage du système
- Dans le cas d'une contamination importante affectant la plupart des cultures de cellules, de déplacer toutes les cultures de cellules survivant du système, ou (si possible) dans un incubateur non affecté.
- Eteignez le contrôle du gaz pour toutes les chambres, sauf que des incubateurs ne sont pas touchés.
- Retirez le panneau avant souple de l'appareil, et retirer les étagères en acier inoxydable de l'incubateur de culture cellulaire affectée. Retirez également le bac à eau.
- Autoclave les tablettes de l'incubateur et le bac à eau, et de les remettre dans l'incubateur. Essuyer les surfaces intérieures de l'incubateur avec 70% d'éthanol. Permettre à l'éthanol pour évaporer, et fermer la porte de l'incubateur.
- Essuyez les surfaces de la chambre de traitement et d'un microscope à 70% etHanol. Replacez le panneau avant de l'appareil.
- Essuyer les surfaces intérieures de l'appareil, y compris celui de l'incubateur affecté, avec un désinfectant ininflammable. Laissez la porte de l'incubateur ouvert concerné, et exécuter un facteur de dilution sur la chambre de traitement. Assurez-vous que les portes de la chambre de microscope sont également ouverts.
- Pour le nettoyage de routine des incubateurs de culture cellulaire, veiller à ce que l'incubateur et la chambre de traitement sont les mêmes paramètres atmosphériques. Ouvrez la porte de l'incubateur, et placer tous les plats de culture de cellules sur la surface de la chambre de traitement.
- Essuyez les tablettes de l'incubateur et les surfaces intérieures avec un désinfectant non-inflammable. Laisser le désinfectant à évaporer, et déplacer les cultures de cellules de retour à l'incubateur. Travailler aussi rapidement que possible pour éviter la dessiccation des cultures de cellules.
Résultats
Ce manuscrit décrit en détail une installation de production de cellules, et les aspects uniques de la culture de cellules dans un système fermé. La majeure partie de l'installation de production de cellules comprend un, appareil de culture de cellules ci-joint sur mesure qui a un faible encombrement et peut être facilement logé dans un 6 x 7,5 m 2 pièces (Figure 2). A aucun moment, les cellules au sein de l'appareil est exposé à du personnel de laboratoire ou de l'environnement. L'appareil est constitué de plusieurs modules: une chambre de traitement, une hotte à flux laminaire, 2 chambres tampon de sas entre le capot et la chambre de traitement, deux incubateurs de culture de cellules et une chambre de microscope adjacent à la chambre de traitement (figure 3). Le système est commandé par un logiciel permettant à des variables environnementales à être contrôlés et surveillés (figure 1). L'ordinateur exécutant ce logiciel est sur une alimentation de secours. Les gaz sont introduits dans eSystème de courrier par un ensemble de collecteurs pour l' oxygène, l' azote et le dioxyde de carbone (figure 4). Les gaz de l'appareil sont fournis par des systèmes multiples qui ont deux ensembles de réservoirs chacun - un ensemble actif et un ensemble de réserve. Lorsque l'ensemble actif est tiré vers le bas, le collecteur commute automatiquement sur les réservoirs afin de remplacement de réserve fixé et le personnel. La puissance est un système de générateur de secours.
Pluripotentes et les cellules souches neurales peuvent être cultivées dans des conditions hypoxiques dans cette installation en utilisant les protocoles précédemment développés 9, avec des complications supplémentaires inhérentes à l'équipement selon l'invention. Les cellules souches pluripotentes peuvent être obtenus en utilisant le virus Sendai, en utilisant des anticorps spécifiques de pluripotence pour identifier les colonies entièrement transfectées, qui sont ensuite isolés et élargis. (Figure 5A et B), A partir de ces CSPi, les cellules et les neurones souches neurales peuvent être obtenus en utilisant SMAD double inhibition, et leur phénotype vérifié usi anticorps NSC-spécifiques ng (Figure 5C et D).
Figure 1. Interface graphique pour l'installation de production de cellules. (A) La représentation graphique de la CPF est l'écran par défaut et correspond au dessin CAO montre la figure 3. Un clic de la souris sur le module tampon 1 (2F sur la figure 1) ouvre son écran de contrôle (B) où O 2 valeurs sont définies pour correspondre à la chambre de traitement (3 à la figure 3). De même, en cliquant sur le processus de chambre ou Incubateur 1 apporte leurs écrans de contrôle respectifs (C et D, respectivement), où les valeurs peuvent être modifiés ou contrôlés selon le cas. rget = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Le mécanisme de production de cellules. (A) Le système tel que vu à partir d' une vue de face à droite. Notez les connexions électriques et de gaz dans le plafond et le panier avec les accessoires de microscope et l'ordinateur à droite. (B) La hotte à flux laminaire avec les portes d'accès aux modules tampons vus à droite. (C) La chambre de traitement avec les deux incubateurs (portes noires) vu à l'arrière. (D) Une vue à travers le côté droit du système montrant le microscope et surveiller les portes des chambres tampons vus dans la distance. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Un dessin CAO de l'installation de production de cellules. Tous les éléments entrant dans le dispositif sont d' abord essuyé avec de l' alcool et séché dans la hotte à flux laminaire air (1). Les articles sont ensuite passés à l'atmosphère appropriée dans le module frontal de la mémoire tampon (2F) avant d' être passé dans le module UCPC ou d'un processus de chambre (3). Les cellules sont cultivées dans les deux incubateurs (4, 5). Coloration de cellules vivantes, colonie cueillette, l' évaluation de la morphologie cellulaire générale et une analyse de la migration a lieu dans le module UPC ou Microscope Chambre (6). Enfin, les déchets quitte le système par le biais du module tampon arrière (2R). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. < / P>
Figure 4. Sources de gaz et d' énergie. (A) Le CO 2 collecteur est une configuration 4 x 4 car il fournit tous les incubateurs du laboratoire. (B) Le 2 O collecteur est une installation et des produits que l'installation de production de cellules 2 x 2. Azote pour le système est généré dans un évaporateur (C, juste en dessous du signal de sortie) fixé à une tubulure d'azote liquide (vers la droite) qui remplit automatiquement cryofreezers ( en bas à gauche). Le collecteur est une configuration 2 x 2 étant alimenté par deux paires de 160 L réservoirs d'azote liquide. CO 2, O 2 et N 2 sont alimentés à partir du plafond à travers robinets d' arrêt (D). vide House est également fourni à cet endroit. Vu juste derrière les shutoffs de gaz d'alimentation sont une paire de câbles d'alimentation qui alimentent le système.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Cellules souches pluripotentes dérivées en hypoxie avec le virus Sendai. (A) SC187-SF4-2I0-E3 CSPi CSPi (nomenclature trouvée dans Stover et al. 9), le contraste de phase 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 CSPi live-tachée de Tra-1-60 AF-594 marqué, dilution 1: 100 dans les médias. Tous les iPSCs ont été transduites dans l'installation de production de cellules dans 5% de O 2 avec le virus Sendai. (C) en contraste de phase de NNC SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC dérivées, augmenté à 5% O 2 dans les diapositives de chambre. Les cellules ont ensuite été fixées dans du paraformaldéhyde 4% et colorées avec un anticorps primaire anti-nestine humaine et un anticorps secondaire Alex-488. Toutes les barres d'échelle sont à 1001;. M S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Les cellules cultivées dans les CPF voient aucune modification des concentrations d'oxygène ou de dioxyde de carbone qui se déplacent d'incubateur pour chambre de traitement au microscope la chambre et le dos. Il est essentiel que les conditions dans chacune des chambres sont adaptées à l'incubateur particulier dans lequel les cellules sont maintenues avant que les cellules sont retirées de l'incubateur. L'atmosphère à l'intérieur de l'appareil est continuellement filtré HEPA et peut être adaptée en ce qui concerne les concentrations d'oxygène et de dioxyde de carbone. Les cellules peuvent être cultivées à des concentrations standard pour PSCs ou NNC, 5% et 9%, respectivement; ou des concentrations différentes peuvent être choisies pour différents types de cellules ou pour des expériences spécifiques. Ainsi, l'appareil est alimenté par des sources constantes d'oxygène de qualité médicale, le dioxyde de carbone et de l' azote (figure 4). Tous les trois de ces gaz sont alimentés par des systèmes multiples spécifiques à gaz qui assurent un approvisionnement constant. L'appareil est également alimenté par un mélange de gaz d'étalonnage constitué par10% (± 0,01%), du dioxyde de carbone en oxygène. Les systèmes multiples sont logés à l'extérieur du centre de production de cellules et les gaz sont acheminés dans l'installation à travers le plafond. Le gaz d'étalonnage est logé dans l'établissement. L'appareil est en outre fourni avec un vide, aussi à travers le plafond. L'utilisation d'un système de surveillance électronique et sans fil unités d'envoi, les pressions de sortie de tous les collecteurs sont constamment surveillés. Dans le cas où aucune pression tombe hors de portée, les exploitants d'installations de production de cellules sont automatiquement téléphonaient et notifiées telles que des mesures appropriées peuvent être prises.
Les exigences de puissance de l'appareil sont remplies par six dédiés 120 V circuits descendant du plafond et connectés aux générateurs de secours de l'hôpital pour assurer un approvisionnement constant. Le fonctionnement du dispositif est contrôlé par le logiciel sur un ordinateur basé sur PC alimenté par une alimentation de secours. Ces arrangements d'alimentation électrique et de l'informatiqueveiller à ce que le système fonctionne en continu même en cas de défaillance du système d'alimentation public. Le logiciel de commande de l'appareil dispose d' une interface graphique conviviale (figure 1) qui permet le contrôle des concentrations en oxygène et en dioxyde de carbone, ainsi que les pressions de température, d' humidité et de la chambre. Les valeurs de tous ces paramètres sont enregistrés en continu pour fournir un enregistrement en cours d'exécution de tous les paramètres de l'appareil. Ces données sont sauvegardées sur un serveur distant chaque nuit pour protéger leur intégrité. L'ordinateur et le logiciel sont accessibles à distance par les utilisateurs administratifs pour évaluer et / ou modifier tout paramètre. En outre, l'ordinateur et le logiciel sont accessibles à distance, ce qui permet une évaluation interactive des paramètres de l'appareil et le dépannage des utilisateurs locaux. Une alarme unité d'envoi supplémentaire est connecté à l'appareil de telle sorte que les exploitants d'installations de production de cellules sont informés de toute condition hors de portée de l'appareil. L'accès à distance capacités permettent de vous connecter et évaluation des spécificités de la condition hors de portée.
L'appareil est réalisé sous la forme d'un système modulaire, aussi bien dans une macro et micro-sens. Les modules de culture de cellules individuelles, telles que des incubateurs et des chambres de traitement, peuvent être adaptés en ce qui concerne leurs dimensions et des exigences, ainsi que dans leur disposition par rapport à l'autre. En outre, la plupart des fonctions de contrôle des modules individuels sont eux-mêmes modulaires tels que les différents contrôleurs de gaz atmosphériques, par exemple, peuvent être facilement remplacés sans interruption importante du système.
des chambres de traitement spécialisées, comme une pour la visualisation et la manipulation des cultures de cellules microscopiques, sont facilement adaptés au système. Deux contraste de phase et un microscope de fluorescence sont à l' intérieur du système (figure 6) de sorte que les cellules peuvent être colorées en direct, et les colonies peuvent être disséqués dans les mêmes conditions atmosphériques à l' intérieur de til incubateurs. Acheminement des câbles à travers des oeillets scellés dans les parois latérales de la chambre de traitement permet des équipements tels que des alimentations et des ordinateurs pour être gardés à l' extérieur de l'appareil, le plus souvent sur un chariot (figure 6).
Les chambres de traitement dans l'installation de production de cellules ont un modèle de flux d'air différent de GCS classiques. Dans les GCS classiques, le flux d'air circule vers le bas à partir d'un évent d'échappement central et se divise en deux courants séparés qui sont ensuite repris par deux orifices d'entrée différents dans la partie avant et arrière du plancher de l'armoire. En revanche, le PCF a un seul évent dans la partie avant du plafond. L'air circule vers le bas et vers l'arrière de la chambre, où il est ensuite tiré vers le haut dans un conduit d'admission. Bien que le PCF est intrinsèquement très propre, ce modèle de flux d'air unique signifie que les techniciens doivent ajuster légèrement leur technique afin de réduire le risque de contamination. Comme avec un BSC classique, un laboratoire travailleur should éviter de placer leurs mains ouvertes en amont des plaques de culture cellulaire et des bouteilles de médias. Cependant, la direction qui est en amont a été modifié dans le CPF
Le laboratoire de l'installation de production de cellule elle-même est assez standard et est équipé d'un -20 ° C congélateur, -80 ° C congélateur, un réfrigérateur C 4 °, une centrifugeuse et un bain d'eau. Le laboratoire dispose également d'un évier avec des commandes de pied pour une utilisation mains-libres pratique. Pour ce laboratoire pour devenir une installation clinique fonctionnelle de production de cellules, cependant, plusieurs modifications supplémentaires doivent encore être apportées. Tout d'abord, l'appareil lui-même doit être mis à niveau pour avoir la capacité de surveiller les composés organiques volatils, les particules et les concentrations de dioxyde de chlore qui est utilisé pour la décontamination. D'autre part, une chambre de traitement contenant une machine FACS peut être logé et connecté au reste de l'appareil par l'intermédiaire d'un module de mémoire tampon. Cela permettra de triage des cellules et la purification de trpopulations de cellules ansplantable dans les conditions environnementales appropriées. Enfin, l'ensemble de l'appareil doit être installé dans un mur souple chambre propre. Ceci fournit une Organisation internationale de normalisation (ISO) classe 8 environnement pour l'appareil 5.
La stérilité élevée et la nature contrôlé par ordinateur du PCF en fait un système idéal pour les applications futures avec la thérapie et de bons procédés de fabrication à base de cellules. Le risque de contamination est considérablement atténué, mais plus important encore, les conditions de l'expansion des cellules sont automatiquement enregistrées et archivées par le système informatique. Déviations des concentrations de gaz, la température, l'humidité et tous les événements d'accès dans le système sont rigoureusement documentés. Cela peut grandement aider lors d'enquêtes sur des problèmes de qualité du produit. Cependant, il y a encore des limites. L'utilisation de tout et de tous les réactifs et les fournitures (par exemple, les composants de médias, pipettes, plaques) doit être documenté séparément. Ajouteritionally, il existe une multitude de problèmes potentiels (y compris de nombreuses formes de l'erreur humaine) qui peuvent survenir, qui sont sans aucun rapport avec les variables documentées par le système de surveillance de la CPF. Ainsi, la nécessité d'un personnel hautement qualifié et la documentation manuelle détaillée des tâches reste en place.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le personnel de Biospherix pour leur aide à apprendre à utiliser le système de culture cellulaire XVIVO clos, en particulier Matt Freeman; le personnel de Miles & Kelley Construction Company, Inc. pour leur travail dans la mise en place de l'infrastructure de laboratoire, en particulier Russ Hughes; le personnel de l'Hôpital pour enfants du département Orange County des installations et des services de soutien pour leur travail dans la coordination de la rénovation de laboratoire, en particulier Adam Lukhard et Devin Hugie; le personnel de l'Hôpital pour enfants du département Orange County des systèmes d'information pour leur aide dans la mise en place de l'infrastructure de gestion des données et l'accès à distance, en particulier Viet Tran; Hôpital du comté d'Orange équipe de direction de l'enfance pour leur soutien de longue date du projet, en particulier le Dr Maria Minon et Brent Dethlefs. Ce travail a été financé par l'Hôpital pour enfants du comté d'Orange et du California Institute for Regenerative Medicine par subvention TR3-05476 à PHS. Tous les auteurs ont contribué également à ce travail.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | sur | |
| Xvivo Logiciel | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Collecteur | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 Collecteur | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscope avec caméra DP21 et fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| forts | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| Supplément StemPro hESC | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Hyclone de sodium tamponné au phosphate | 9236 | ||
| Facteur de croissance des fibroblastes 2 | R& D Systems | AFL233 | |
| Dimethyl sulfoxyde | Protide | PP1130 | |
| Dissociation cellulaire à base de Hank’s Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Facteur de croissance épidermique | R& D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Anticorps | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 | Anticorps Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 Anticorps | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Supplément sérique | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Nom | Numéro de catalogue | Comments | |
| >Supplies Consommables | |||
| 2 ml Pipette sérologique | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml Pipette sérologique | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 ml Pipette sérologique | Olympus Plastics | 12-104 | |
| Pipette sérologique 25 ml | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50 ml Pipette sérologique | Olympus Plastics | 12-107 | |
| Plaque 6 puits | Corning | 353046 | |
| Plaque 12 puits | Corning | 353043 | |
| Flacon T25 | TPP | 90026 | |
| Flacon T-75 | TPP | 90076 | |
| 20 µ l pointes de pipette | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µ ; l pointes de pipette | Eppendorf | 22491148 | |
| 1 000 pointes de pipette | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70 % éthanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
Références
- Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
Réimpressions et autorisations
