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Différences entre les sexes dans la souris hippocampiques astrocytes après

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DOI :

10.3791/53695

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25 octobre 2016

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1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

Dans cet article

Résumé

Les astrocytes sont l'un des principaux acteurs les plus importants dans le système nerveux central (SNC). Ici, nous rapportons une méthode pratique de sexué hippocampique protocole de culture d'astrocytes afin d'étudier les mécanismes sous - jacents de la fonction des astrocytes dans les chiots mâles et femelles néonataux après une ischémie in vitro.

Résumé

Astrogliosis suivante hypoxie / ischémie (HI) lésion cérébrale la PI joue un rôle dans l'augmentation de la morbidité et de mortalité chez les nouveau-nés. Des études cliniques récentes indiquent que la gravité des blessures du cerveau semblent être le sexe à charge, et que les nouveau - nés de sexe masculin sont plus sensibles aux effets de la lésion cérébrale HI liée, ce qui entraîne des résultats neurologiques plus graves que chez les femmes ayant des lésions cérébrales comparables. Le développement de méthodes fiables pour isoler et maintenir les populations hautement enrichies de astrocytes hippocampique sexué est essentiel de comprendre la base cellulaire des différences entre les sexes dans les conséquences pathologiques de HI néonatale. Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour créer des cultures hippocampiques spécifiques du sexe astrocytes qui sont soumises à un modèle d'ischémie in vitro, la privation d'oxygène-glucose, suivie par une réoxygénation. astrogliosis réactif subséquent a été examiné par immunostaining pour la protéine gliale fibrillaire acide (GFAP) et S100B. Cette méthode fournit un outil utile pour étudier le rôle des hommes et des astrocytes hippocampiques femelles après néonatale HI, séparément.

Introduction

Les astrocytes sont l'un des principaux acteurs les plus importants dans le système nerveux central (SNC). nombre croissant de preuves indique que les rôles des astrocytes sont plus de fournir un soutien neuronal. En fait, le rôle des astrocytes dans des conditions physiologiques peuvent être très complexes, telles que le guidage de la migration des axones en développement 1, la régulation du système nerveux central flux sanguin 2, le maintien de l'homéostasie du pH du liquide interstitiel synaptique 3, et en participant à la barrière hémato - encéphalique 4 et 5 la transmission synaptique. Dans des conditions pathologiques, les astrocytes réagissent à des blessures avec un processus appelé astrogliosis réactif dans lequel la morphologie, le nombre, l' emplacement, la topographie (par rapport à la distance de l' insulte) et la fonction des astrocytes peuvent changer d'une manière hétérogène 6,7. Astrogliosis observée après néonatale encéphalopathie hypoxique ischémique peut-être contribuer à la morbidité et la mortalité des nouveau-nés 8.

Des études cliniques et expérimentales récentes montrent que la sévérité des lésions cérébrales semble être dépendant du sexe et que les nouveau-nés mâles sont plus sensibles aux effets de l'hypoxie / ischémie (HI), les lésions cérébrales concernant la PI, ce qui entraîne des résultats neurologiques les plus graves par rapport à les femmes ayant des lésions cérébrales comparables 9-11. Bien que la localisation de la blessure dépend de l'âge gestationnel et la durée et la gravité de l'insulte, l'hippocampe est l'une des régions les plus couramment effectuées dans le SNC après terme néonatale HI, et augmenté astrogliosis hippocampique a été confirmée par la régulation des la protéine fibrillaire gliale acide (GFAP) 3 jours après l'HI néonatale 7,10,12,13. Les différences de sexe en fonction des astrocytes ont été présentés dans les deux nouveau - nés et les rongeurs adultes après une ischémie cérébrale 14,15. En outre, la sensibilité astrocytaire mâle à une ischémie in vitro a été démontré par une augmentation de cell la mort par rapport à astrocytes corticales femmes dans la culture 16.

Les différences sexuelles commencent in utero et se poursuivent jusqu'à la mort 17. Au cours de la dernière décennie, l'importance d'inclure les sexes dans des conditions expérimentales en culture cellulaire et in vivo des études ont été l'accent de l'Institut de médecine et de NIH à rechercher des connaissances fondamentales dans les différences entre les sexes observées dans des conditions physiologiques et pathologiques 17,18 . Développement de méthodes fiables pour isoler et maintenir les populations de astrocytes hippocampique sexué est essentiel de comprendre la base cellulaire des différences entre les sexes dans les conséquences pathologiques de HI néonatale. La présente étude a été conçue pour fournir les techniques pour préparer enrichies cultures de souris nouveau-nés astrocytes hippocampique par sexe afin d'évaluer le rôle des astrocytes GFAP-immunoréactives suivants Oxygen / Glucose Privation (OGD) et réoxygénation (REOX), induisantHI dans le milieu de culture cellulaire. Cette technique peut être utilisée pour tester toute hypothèse concernant les astrocytes hippocampiques chez les mâles et les femelles néonataux dans des conditions normoxiques et ischémiques.

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Protocole

NOTE: Cette étude a été réalisée conformément à la recommandation du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Institut national de la santé. Le protocole de l'animal a été approuvé par l'Université du Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care et utilisation Comité. Astrocyte primaire protocole de culture qui est présenté ici est adopté des protocoles présentés par Zhang Y 19 et al. Et Cengiz P 20 et al. , Avec quelques modifications.

1. hippocampique Dissection et Astrocyte Culture

  1. Préparer tous les réactifs et matériaux nécessaires, y compris des ciseaux chirurgicaux, pinces fines lisses, une pince à bout plat, serviettes en papier, sac de déchets, 70% d'éthanol et 2 plats de dissection (3,5 cm de diamètre) sur la glace rempli de 2 solution saline équilibrée de Hank mL (HBSS) chaque . Assurez-vous de l'équipement chirurgical sont stériles (autoclave) avant la procédure et utiliser tous les autres matériaux (Astrocyte placage moyen: sérum DMEM + 5% de cheval +1% de pénicilline-streptomycine, du sérum de cheval, HBSS, 0,25% de trypsine, des lamelles de verre, des boîtes de Pétri, tubes 15/50 ml, flacons T25, etc.) comme pré-stérile.
  2. Tenir délicatement et pulvériser la tête et du cou du chiot de souris avec 70% d' éthanol et décapitent en utilisant des ciseaux tranchants stériles [Figure 1 (1)].
  3. Effectuer une incision médiane d'arrière en avant le crâne avec de petits ciseaux le long du cuir chevelu pour exposer le cerveau [Figure 1 (2-3)].
  4. Couper le crâne soigneusement à partir du cou au nez avec de petits ciseaux. Ensuite, couper le crâne antérieur aux bulbes olfactifs et inférieur au cervelet pour déconnecter le crâne de la base du crâne.
  5. Faire une petite incision à la base du crâne et couper le long de la ligne médiane. Utilisez des pinces stériles à pointe plate pour décoller le crâne. Retirer le tronc cérébral à l'aide d'une pince courbe. Retirer le cerveau du crâne et la placer dans le premier plat de dissection [Figure 1 (4-9)] 21.
  6. En utilisant une pince courbe, retournez le cerveau de telle sorte que la surface ventrale du cerveau est orientée vers le haut, puis séparer les deux hémisphères avec une lame chirurgicale stérile forte [Figure 1 (10,11)]
  7. Peler les hémisphères cérébraux et retirez soigneusement le tissu mésencéphale et thalamique renflement avec stériles forceps courbes plates pour révéler l'hippocampe, une petite structure en forme d' hippocampe dans le lobe temporal médian [Figure 1 (12-14)].
  8. Retirer les deux lobes hippocampiques [Figure 1 (15,16)] et de disséquer soigneusement les méninges des lobes en tirant avec les pince fine. Cette étape évite la contamination de la culture d'astrocytes finale par les cellules et les fibroblastes méningées.
  9. Transférer les lobes hippocampiques préparés dans le deuxième plat rempli de HBSS et le retourner sur de la glace [Figure 1 (17,18)]. Piscine à la fois hippocampiques lobes d'une seule souris (P0 - P2) pour la préparation des hippopotamescultures campal astrocytes. Cela donne à l'astrocyte bonne densité. Émincer lobes hippocampiques en utilisant une lame chirurgicale stérile forte (environ 4 fois).
  10. Aspirer HBSS de plat en utilisant une pointe stérile attachée à une pipette mL 1 et ajouter 3 ml de trypsine à 0,25%, mélanger, transférer dans un tube conique stérile de 15 ml et incuber le tissu à 37 ° C pendant 20 min en agitant doucement.
  11. Tube à centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant soigneusement à l'aide d'une pipette en verre stérile fixée à une ligne de vide. Ajouter 10 ml astrocyte placage moyen et trituré (20 - 30 fois) à l'aide d'un feu poli pipette en verre jusqu'à ce que les morceaux de tissu homogénéisent.
  12. Tube à centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et ajouter 2 mL de milieu frais astrocyte de placage préchauffée. Passer les cellules à travers un filtre à mailles de 70 pm (tamis cellulaire) dans un nouveau tube de 50 ml conique.
  13. toute la plaque de suspension cellulaire dans un flacon de culture T25 stérile revêtue de poly-D-lysine / laminine contenant 3 ml d'médias astrocytes placage, puis incuber le ballon à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 de 5%.
  14. Ensemble Aspirer médias à jour- i n-vitro (DIV) 1, DIV 3 et DIV 7, et le remplacer par 2 ml de milieu d'astrocytes placage frais. Observer la progression et la confluence astrocytaire au microscope optique à chaque fois, tout en remplaçant les médias astrocyte de placage.
    NOTE: A DIV 1, tous les astrocytes viables sont fixés à la surface du flacon de culture et les cellules mortes ou mourantes qui incluent les neurones flottent dans le surnageant. A DIV 3, les cellules attachées commencent à se diviser pour former la couche de cellules astrocytes. En l'absence des conditions favorables, la culture est presque dépourvue de toute croissance neuronale. À DIV 7, la couche d'astrocytes est d'environ 80 - 90% de confluence et quelques microglie ainsi que des cellules précurseurs d'oligodendrocytes sont présents au-dessus de la couche astrocytaire.
  15. Aspirer le milieu de placage du flacon, ajouter 2 mL de milieu de astrocyte placage préchauffée frais, rincer unend retirer de nouveau à DIV 11, lorsque les astrocytes sont confluentes et prêt pour les sous-culture.
  16. Ajouter 2 ml de trypsine à 0,25%, tourner doucement le flacon à quelques reprises et aspirez trypsine en utilisant une pipette en verre stérile.
  17. Ajouter 2 mL de 0,25% de trypsine et de laisser le flacon reposer dans le tissu culture capot pendant 4 - 5 min à température ambiante.
  18. Retirer la trypsine et de maintenir le ballon à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant 10 min. Ajouter 5 ml préchauffée astrocyte placage moyen et détacher la couche astrocytaire en tapant le ballon contre la paume de votre main (3 - 4 fois) suivie d'une trituration douce pour atteindre le détachement complet et de recueillir les astrocytes dans un tube de 15 ml conique.
  19. Tube à centrifuger à 300 xg pendant 5 min, aspirer le surnageant et ajouter 1 ml de milieu astrocyte de placage frais.
  20. Ajouter 10 ul de la suspension cellulaire à un hémocytomètre et compter les cellules dans la grande surface quadrillée centrale (1 mm 2) à l' aide d' un microscope à contraste de phase inversé (objectif 10X). Multiply de 10 4 pour estimer le nombre de cellules par ml. Un flacon T25 donnera ~ 1 x 10 6 cellules totales dissociées. Semences ~ 1 x 10 5 cellules dans 2 ml de milieu astrocytes placage sur un diamètre de 12 mm Poly-D-Lysine lamelle de verre pré - enduit dans le puits d'une boîte de culture de 24 puits.
  21. Incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Effectuer OGD / REOX à DIV 12-14 (section 2).
  22. Traiter les cultures d'astrocytes au DIV 3 avec 5 mM de L-leucine Ester méthylique (LME) chlorhydrate jusqu'à DIV 11 si les cultures hippocampiques dépourvues de microglies sont souhaitées. Après LME incubation, les cultures soumises à agitation (300 rpm pendant 1 h) pour éliminer la contamination microglie.
    REMARQUE: la LME est un agent cytotoxique microglie qui a été largement utilisé comme procédé pour éliminer la prolifération des 22 cellules microgliales.

2. OGD / Traitement REOX

  1. Aspirer le milieu de culture contenant de la lamelle astrocyte adhérente (DIV 12-14) et rincer 3 foisen faisant tourner doucement la boîte de culture 24 puits tenant la lamelle une ou deux fois avec 1 ml de solution isotonique OGD (pH 7,4) contenant (en mM): 0 glucose, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,27 CaCl 2, et 0,81 MgSO 4.
  2. Ajouter 0,2 mL solution OGD bien pour couvrir la lamelle et incuber pendant 2 h dans un incubateur hypoxique contenant 94% de N 2, 1% O 2, et 5% de CO 2. Mélanger délicatement avec un agitateur orbital (50 rpm) pendant les 30 premières minutes de l'hypoxie pour faciliter l'échange de gaz.
  3. Incuber les cellules de contrôle normoxiques pendant 2 h à 5% de CO 2 et de l' air atmosphérique dans un tampon identique à la solution OGD sauf pour l'ajout de 5,5 mM de glucose.
  4. Pour REOX, solution OGD Aspirer et ajouter 2 ml de astrocyte placage moyen. Incuber à 5% de CO 2 et de l' air atmosphérique à 37 ° C pendant 5 h.

3. immunocytochimique Coloration

  1. Aspirer le milieu de culture à l'aide d'une pipette en verre stérile attachée à une ligne de vide et rincer rapidement lamelle une fois en ajoutant 1 ml de 0,1 M Tris Buffered Saline (TBS) (NaCl 154, 16 mM Trizma Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) au puits. Aspirer et ajouter 2 mL de paraformaldéhyde 4% (PFA) dans 1x tampon phosphate salin (PBS). Incuber pendant 15 min à température ambiante.
  2. Aspirer et ajouter 1 mL de 0,1 M TBS, puis placer ensuite sur un agitateur oscillant pendant 2 min. Répétez 3 fois. Ajouter 1 ml de solution de blocage (sérum de chèvre à 10%, 10 mg / ml de SAB, 0,025% de Triton X-100 à 0,1 M TBS) et on incube pendant 30 min à 37 ° C sur un agitateur basculant.
  3. Aspirer la solution de blocage et ajouter monoclonal de souris primaire anticorps GFAP anti- (0,2 ml d'une dilution 1: 500 dans une solution de blocage) et polyclonal de lapin anti-S100B (1: 500) ou de lapin polyclonal anti-HIF1α (1: 200) pendant 60 min à 37 ° C sur un agitateur basculant.
  4. Alternativement, certains astrocytes sont incubés avec le lapin polyclonaux anti-IBA1 (1: 200) et mon sourisanti-MAP2 oclonal pour accéder à la pureté de la culture.
  5. anticorps primaire Aspirer et rincer la lamelle en ajoutant 1 mL de 0,1 M TBS et placement sur un agitateur oscillant pendant 2 min puis aspirée. Répéter deux fois.
  6. Ajouter 0,2 ml d'une dilution 1: 200 de l'anti-anticorps de lapin conjugués à 568 488 conjuguées et anti-souris de chèvre secondaire dans la solution de blocage pendant 60 min à 37 ° C sur un agitateur basculant.
  7. Aspirer anticorps secondaire et rincer la lamelle en ajoutant 1 mL de 0,1 M TBS et placer sur un agitateur oscillant pendant 2 min puis aspirée. Répéter deux fois.
  8. Retirer la lamelle du puits sec et en plaçant sur une lame placée sur une lame-cheveux. Mont lamelle sur une nouvelle diapositive en inversant sur une seule goutte de Vectashield hardset milieu de montage avec DAPI (1,5 ng / ul).
  9. lamelles d'image sur un microscope confocal en utilisant soit 20X objectif d'huile sèche ou 60X. Acquérir les images (512 x 512) pour DAPI (405 nm ex / em 450 nm) et fluorochrome 488 tagged anticorps GFAP (488 nm ex / 515 nmem). Gardez les paramètres d'acquisition constants au sein du 20X et 60X groupes.

4. Sex Détermination Utilisation PCR

  1. Chiot chaleur orteil ou de doigt rognures à 95 ° C pendant 45 minutes dans du NaOH 50 mM et neutralisent avec un volume égal de 1 M de Tris, pH 6,8.
  2. Ajouter 1 pi de la solution d'ADN extrait de 19 ul du mélange suivant: 5 pmoles d'amorces pour les gènes et Myog Sry, un tampon de réaction 1 x, 0,2 mM de chaque désoxynucléotide et 8 U de Taq polymérase.
  3. Utiliser des amorces de séquences; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' et Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 '5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Exécuter le protocole PCR suivant: 95 ° C pendant 3 min, puis 30 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 15 s, annelage à 58 ° C pendant 15 s et allongement à 72 ° C pendant 1 min. À la suite de ces 30 cycles, la réaction se termine par une finale d'allongement à 72 ° C pendant 1 min.
  5. PC séparéR produits par électrophorèse sur un gel contenant du bromure d'éthidium agarose à 2% et visualisent sous illumination UV. (Figure 2A). ATTENTION! Le bromure d' éthidium est un cancérigène potentiel et doit être manipulé avec soin et éliminés de façon appropriée selon les règlements de l' institution.

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Résultats

Comprendre les rôles des fonctions d'astrocytes sexués dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques ont été immensément élucidé par la culture de ces cellules dans des conditions in vitro. L'aspect important de réaliser la culture sexué est de déterminer le sexe du chiot de la souris avant son utilisation. On a déterminé le sexe de la souris génétiquement par PCR et par une évaluation visuelle (figure 2) 16. La méthodologie de dét...

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Discussion

Afin d'étudier les différences entre les sexes dans les propriétés et la fonction des astrocytes dans des conditions physiologiques et pathologiques, la préparation des astrocytes primaires sexués dans la culture cellulaire est un outil important à utiliser. Dans la présente étude , nous rapportons une population homogène hautement enrichi d'astrocytes hippocampiques sexués de nouveau - né (P0-P2) C57BL / 6 (type sauvage) ou K19F (GFAP de null) souriceaux très efficace et une méthode reproductible à la culture <...

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Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs ont des intérêts concurrents ou contradictoires.

Remerciements

Programme de prix en sciences cliniques et translationnelles des TR0000427 NCATS UL1 et KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 à l’ICTR UW des NIH/NCATS et des fonds du Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 du NINDS (Cengiz P) et du NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). Nous tenons à remercier Albee Messing, PhD, de nous avoir fourni les souris knock-out GFAP.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieux de culture d’astrocytes
DMEM, haute teneur en glucosecellgro10-013-CV
Sérum de chevalGibco26050-070Concentration finale : 10 %
Pénicilline-StreptomycineCellgro  ;30-002-CIConcentration finale : 1 %
L-chlorhydrate d’ester méthylique de L-LeucineAldrichL1002-25GConcentration finale : 5 mM
Solution pour la digestion des tissus cérébraux
HBSSLife Technologies14170-088
Trypsinecellgro25-050-CIConcentration finale : 0,25 %
Autre
Éthanol à 70 % (vol/vol)Roth9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm ronds  ;Corning354087
WaterSigmaW3500Qualité de culture cellulaire
PBScellgro21-040-CVCatégorie de culture cellulaire
0,05 % Trypsine-EDTA  ;Life Technologies25300-062
70 &mu ; m Passoire à cellules stériles  ;Fisher scientific22363548 Boîte de
Pétri 3,5 cmBD Falcon353001
15 mL Tube FalconBD Falcon352096
50 mL Tube FalconBD Falcon352070
Pince, fine  ;Dumont2-1032 ; 2-1033# 3c ; # 5
Pince, pointe plateKLS Martin12-120-11
Ciseaux chirurgicaux 13 cmAesculapBC-140-R
Microscope confocalNikonA1RSi  ;
CentrifugeuseEppendorf5805000.0175804R
Agitateur orbitalThermo ScientificSHKE 4450-1CEMaxQ 4450  ;
Anti-IBA1Wako019-19741Lapin monoclonal
Anti-MAP2SigmaM2320Souris monoclonal
Anti-HIF1alphaabcamab179483Lapin monoclonal
Anti-S100BSigmaHPA015768Lapin polyclonal
Anti-GFAP (cocktail)Biolegend837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Lapin IgG)Vector LabsPK-6101contient 4 réactifs  ;
Chèvre Anti Lapin Alexa-Fluor 488InvitrogenA11070
Chèvre Anti Souris Alexa-Fluor 568InvitrogenA11004

Références

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Mots-clés

Privation d oxyg ne et de glucoseCulture d astrocytesAstrogliose r activeExpression de la GFAPExpression de S100BL sion c r brale n onataleMarquage par immunofluorescence

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