Déficitaires et approche Gain de fonction d'enquêter sur les cellules précoce destin déterminants dans les embryons de souris préimplantatoire

Résumé

L'objectif de ce protocole est de décrire un déficitaire et d'acquérir de-méthode de la fonction qui est applicable pour identifier néogénine comme un récepteur spécifique de stade qui mène à trophectoderme et la différenciation cellulaire interne de masse dans des embryons de souris préimplantatoire.

Résumé

Les techniques de silençage et de surexpression géniques sont essentielles à l’identification des gènes impliqués dans le développement embryonnaire. La modification directe des gènes cibles chez les embryons préimplantatoires permet d’étudier les mécanismes sous-jacents des gènes impliqués, par exemple, dans la différenciation cellulaire en trophectoderme (TE) et en masse cellulaire interne (ICM). Ici, nous décrivons un protocole qui examine le rôle de la néogénine en tant que récepteur authentique pour la détermination initiale du destin cellulaire dans les embryons de souris préimplantatoires. Tout d’abord, nous discutons des manipulations expérimentales qui ont été utilisées pour produire un gain et une perte de la fonction de la néogénine en micro-injectant de l’ADNc et de l’ARNh de la néogénine ; l’efficacité de cette approche a été confirmée par une forte corrélation entre les niveaux d’expression par paires de la protéine fluorescente rouge (RFP) ou de la protéine fluorescente verte (GFP) et la quantification immunocytochimique de l’expression de la néogénine. Deuxièmement, la surexpression de la néogénine dans les embryons de souris préimplantatoires conduit au développement normal de l’ICM, tandis que l’inactivation de la néogénine provoque le développement anormal de l’ICM, ce qui implique que la néogénine pourrait être un récepteur qui relaie les signaux extracellulaires pour conduire les blastomères au destin cellulaire précoce. Étant donné le succès de ce protocole détaillé dans l’étude de la fonction d’un nouveau récepteur embryonnaire spécifique au stade de développement, nous proposons qu’il ait le potentiel d’aider à l’exploration et à l’identification d’autres gènes spécifiques au stade au cours de l’embryogenèse.

Introduction

Préimplantatoire de développement embryonnaire peut être divisé en plusieurs étapes distinctes, à partir du stade d'une cellule à la morula et blastocyste. Beaucoup de preuves suggère que la polarité et les indices de position jouent un rôle au début de la détermination du destin cellulaire dans le trophectoderme (TE) et la masse cellulaire interne (ICM). Cependant, la nature des indices, la façon dont ils sont transduits en signaux cellulaires et les contextes physiologiques dans lesquels ces signaux sont capables d'initier la différenciation de la lignée cellulaire ne sont pas connues. Ces cellules différenciées sont ensuite soumis à la spécialisation, à commencer à prendre des structures caractéristiques et fonctions nécessaires à l' embryon la formation et à la croissance du placenta ^1-3.

embryons de pré-implantation sont particulièrement favorables à la manipulation par injection directe de matériel génétique modifié comme siRNA ou l'ADNc cible et peuvent donc être utilisés pour étudier des molécules cibles spécifiques. Il y a une compréhension croissante que génétiqueanalyse des embryons de vertébrés est essentielle pour faire progresser notre compréhension du développement embryonnaire ^4. l'introduction précise d'un gène de type sauvage ou une forme mutante dans un embryon dans un contexte en temps opportun pour accomplir ou intensité forte perte de fonction du gène a grandement facilité l'étude des gènes régulés par le développement. Et déficitaires gain de fonction par microinjection de matériel génétique dans des embryons non mammifères et mammifères début individuels est relativement simple en raison de leur grande taille et de grande réceptivité ^5. La micro-injection est typiquement réalisée en utilisant des vecteurs non viraux. Un avantage particulier a été pris de la facilité d'utilisation de vecteurs non viraux sur des vecteurs viraux et des transgènes. Un rapide ou déficitaire système d'expression gain de fonction dans des embryons de souris a été développée qui nous permet de disséquer et de comprendre les fonctions des gènes en embryologie vertébré ^6,7.

Le marquage fluorescent des embryons serait grandement faciliter la sélection des microinjected ou génétiquement manipulées et les embryons en même temps , délivrer un moyen pour quantifier indirectement le niveau d'ARNsi ou d' ADNc microinjecté expression basée sur l' intensité de fluorescence ^8. Pour ce faire l'étiquetage, l'ADNc de la protéine fluorescente, la GFP ou RFP, sont co-injectées soit des constructions de fusion ou séparément. L'intensité de fluorescence de la GFP ou RFP révèle l'ampleur de l'expression d'ARNsi ou d'ADN étranger à faire en sorte que déficitaire ou gain de fonction a été accomplie.

Ici, nous présentons un protocole de micromanipulation pour la technique de la fonction déficitaire et le gain-of qui nous a permis d'identifier néogénine comme un récepteur qui transmet des signaux extracellulaires importants dans la différenciation cellulaire précoce chez les embryons de souris préimplantatoire.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures pour l'élevage et soins des animaux ont été effectués selon les règlements de l'Université IACUC Sahmyook, Séoul, Corée du Sud.

1. Superovulation, Elevage et isolement Oviducte

1. Maintenir C57BL / 6 souris consanguines dans les conditions suivantes: 22 ± 3 ° C, ~ 60% d'humidité, 12 h cycle lumière / obscurité, et de l'eau et de la nourriture ad libitum.
2. Provoquer superovulation des souris femelles 3-5 semaines d'âge par une injection intrapéritonéale de 5 UI jument gravide gonadotrophine sérique (PMSG) à 0,1 ml / tête suivie 48 heures plus tard par une injection intrapéritonéale de 5 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) à 0,1 ml /tête.
3. Immédiatement après l'injection hCG, accoupler les femelles induite superovulation-avec des mâles sexuellement matures de la même souche en les gardant dans la même cage pendant la nuit.
4. Le lendemain matin, confirmer l'accouplement par la présence d'un bouchon d'accouplement ou de bouchon vaginal sur l'appareil génital féminin.
5. Sacrifiez les souris femelles enceintespar CO ₂ intoxication suivie cervicale dislocation 18-20 h après l' injection hCG.
6. Ouvrez la cavité abdominale en coupant la peau, puis la couche péritonéale avec des ciseaux fins.
7. Ramassez les cornes utérines avec une pince fine et se détache de l'utérus, l'oviducte, de l'ovaire, et coussinet adipeux doucement de la cavité du corps.
8. Couper la zone située entre l'oviducte et l'ovaire avec des ciseaux fins. Repositionner la pince et couper l'utérus près de l'oviducte, en laissant au moins 1 cm de la partie supérieure de l'utérus fixé.
9. Transférer le ampulla oviducte à une boîte de Pétri de 35 mm contenant du milieu M16 à la température ambiante. Réunir les oviductes de plusieurs souris dans le même plat.
10. Placez les plats sous un stéréomicroscope pour la récupération des embryons.

2. Extraction et culture de 2-pronucléaire (2-PN) Embryons

1. Coupez l'extrémité d'une aiguille hypodermique G 30 ou 32, moudre en une pointe émoussée, et l'utiliser comme une aiguille de rinçage.
2. Utilisationune pince fine pour faire glisser l'extrémité de l'oviducte sur l'aiguille de rinçage. Appuyez doucement sur la pointe de l'aiguille de rinçage contre le fond du plat pour le maintenir en place. Rincer l'oviducte avec ~ 0,1 ml de milieu M16 pour libérer les embryons 2-PN dans une boîte de Pétri.
3. Récupérer les embryons 2-PN avec entourant les masses cumulus du milieu M16 rincée sous la loupe binoculaire à l'aide d'une pipette en verre stérile et de les transférer dans une nouvelle boîte de Pétri.
4. Dissocier les cellules du cumulus à partir des embryons de 2-PN par digestion enzymatique avec 1,0 ml de 0,1 à 0,5% d'hyaluronidase dans un tampon phosphate salin de Dulbecco (DPBS) à 37 ° C pendant 5 à 10 min.
5. Dénudent embryons par pipetage doucement avec une pipette en verre et l'élimination physique des cellules du cumulus.
6. Laver les embryons dénudés trois fois avec 30-50 ml de solution saline tamponnée au phosphate frais (PBS) par embryon.
7. Incuber les embryons dans une boîte de Petri en plastique de 35 mm dans un milieu M16 additionné de 10 mg / ml d'albumine de sérum bovin (BSA, Fraction V) à 37 ° C dans 5% de _CO2 dans un incubateur humidifié jusqu'à ce que la micro - injection est effectuée, ce qui est généralement inférieure à 4 heures plus tard.

3. Embryo transcription inverse (RT) et la réaction en chaîne par polymérase (PCR)

1. Recueillir au moins 10 embryons provenant de chaque étape jusqu'à l'étape blastocyste et mettre en commun les dans 4,0 pi de 5x inverse solution de pré-mélange transcriptase contenant la transcriptase inverse, un inhibiteur de la RNase, amorce oligo dT, 6mers aléatoire, d'un mélange de dNTP et le tampon de réaction dans un tube PCR.
2. Ajouter RNase-H ₂ O distillée à un volume total de 20 pi et sonication les embryons mis en commun pendant 30 secondes à 200 W. Initier la réaction RT immédiatement à 42 ° C pendant 1 heure puis 5 minutes d' incubation à 95 ° C.
3. Pour chaque 5,0 ul de solution d'ADNc généré, effectue une amplification par PCR avec des amorces normales pour néogénine, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4, ou β-actine (séquences d' amorce donnés dans le tableau 1. PCR comprend 40 cycles de 15 sec d' incubation à 95 ° C, 30 s à la température de recuit (indiqué dans le Tableau 1) et 30 s à 72 ° C.
4. Les produits de PCR séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2% et de visualiser le gel sous lumière UV après coloration au bromure d'éthidium.
5. Normaliser l'expression du gène cible par rapport aux niveaux de ß-actine.

4. Immunocytochimie des Embryons

1. Fixer les embryons provenant de chaque étage avec 4% de paraformaldehyde dans du PBS pendant 30 min à température ambiante, suivie par un bref lavage 3 fois avec du PBS contenant 0,01% de BSA.
2. Les membranes cellulaires perméabiliser par incubation d'embryons 10 dans 1,0 ml de PBS contenant 0,1% de Tween 20 et 0,1% de Triton X-100 à température ambiante pendant 10 min.
3. Pour bloquer la liaison non spécifique incuber les embryons perméabilisées dans 1,0 ml de PBS additionné de 10% de sérum de chèvre normal pendant 30 minutes à température ambiante.
4. Incuber l'embryon d'esprit bloquéh anticorps de lapin anti néogénine à dilution 1: 100 dans du PBS contenant 0,1% de BSA pendant une nuit à 4 ° C.
5. Après trois lavages pendant 30 secondes chacune dans des gouttes de PBS, laisser incuber les embryons soit avec Alexa IgG de chèvre anti-lapin 488 conjugué ou Alexa 568 conjugué de chèvre anti-IgG de lapin à dilution 1: 500 dans une solution PBS / BSA pendant une nuit à 4 ° C .
6. Pour visualiser les filaments d'actine, incuber les embryons in 1 pg / ml dans du PBS phalloïdine pendant 1 heure à température ambiante.
7. Colorer les noyaux en ajoutant 5 ml de PBS contenant 1 pg / ml de DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole, dihydrochlorure) pendant 5 min à température ambiante.
8. Laver les embryons trois fois brièvement avec du PBS.
9. Transfert d'embryons à une lame de verre et les couvrir avec une goutte d'huile minérale.
10. Prenez des images à 1,000X grossissement avec un microscope confocal avec une excitation de la longueur d'onde appropriée.

5. Préparation de néogénine-DP et néogénine-siRNA GFP Plasmides

1. Sousclone ADNc codant néogénine de la souris dans une protéine fluorescente rouge (RFP) contenant vecteur, résultant en néogénine-flag-DP.
2. Subclone petit ARN en épingle à cheveux ciblage néogénine dans une protéine Emerald Green Fluorescent (EmGFP) contenant vecteur, résultant en pcDNA-EmGFP-miR-néogénine (voir figure 1).
3. Amplifier les deux néogénine-flag-DP et plasmides pcDNA-EmGFP-miR-néogénine et les purifier par des méthodes classiques.
4. Ajuster les concentrations finales des plasmides à ~ 1,0 pg / ml dans un tampon stérile Tris-EDTA (TE).

6. microinjection de Plasmides en 2-PN Embryons

1. Laver les 2 dénudées-PN embryons une fois, brièvement, avec les médias M16 frais.
2. Centrifuger les embryons 2-PN pendant 10 min à 1000 xg dans une centrifugeuse de table pour permettre l'observation de la pronuclei.
3. Incuber les embryons dans une micro goutte de 20 à 30 pi de milieux M16 par embryon dans l' huile minérale à 37 ° C dans 5% de CO ₂ pour un additional 1-2 heures.
4. Fabrication pipettes d'injection et pipettes de maintien en tirant un tube capillaire borosilicate de verre (DO = 1,2 mm; ID = 0,94 mm) avec un extracteur mécanique.
5. Fabriquez pipettes d'injection pour avoir des conseils contondants et ouvertures polies de <500 um longueur de la pointe et 1-2 pointe um diamètre intérieur en utilisant un micromoteur et un microforger.
6. Fabriquer tenant pipettes de telle sorte qu'ils ont des extrémités franches et des ouvertures polies avec un diamètre intérieur de 20 um et un diamètre externe de 100 um.
7. pipettes d'injection de charge avec une quantité suffisante (> 200 nl) de solution de plasmide à 1,0 pg / pl.
8. Micro-injection ~ 10 pi de solution de plasmide de chaque embryon 2-PN dans l'une des pronuclei en utilisant un micro-injecteur attaché à un micromanipulateur motorisé; au cours de ce processus, conserver les embryons en position en appliquant une pression négative avec une pipette de maintien.
9. Après microinjection, laver les embryons 2-PN 3 fois avec des milieux frais M16 pour less de 1 min à chaque fois.
10. Culture des embryons 2-PN dans une goutte de milieu M16 frais sur une boîte de culture en plastique recouverte d'une goutte d'huile minérale pour éviter l'évaporation des médias.
11. Observer les embryons à intervalles de 24 heures sous un contraste d'interférence différentiel (DIC) de microscope inversé au grossissement de 200x.

Résultats

Nous avons découvert que néogénine est transitoirement exprimée au cours des premiers stades de développement des embryons préimplantatoire de souris, apparaissant dès au stade 2 cellules et durable jusqu'au début du morula , mais devenir déficient à la fin morula et stades blastocyste (Figure 2A). En outre, la répartition spatiale des néogénine a été limitée principalement à l'extérieur des cellules. Les résultats de l' analyse par RT-PCR étaient compatibles...

Discussion

Dans le présent protocole, nous démontrons de nouvelles méthodes de microinjection du matériel génétique, soit l'ADNc ou shRNA, dans les embryons 2-PN souris pour explorer le rôle de néogénine dans la différenciation cellulaire précoce au cours de l'embryogenèse de la souris. La modification génétique des embryons préimplantatoires est une technique puissante dans la découverte des informations clés sur les mécanismes sous-jacents moléculaires pour, par exemple, la première détermination de la lignée cellulaire....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
M16 medium,Gibco	BRL (Grand Island, NY)	M7292 LOT# 11A832
Sérum de chèvre,  ;	Dako (Glostrup, Danemark)	X0907
PMSG	Folligon, Intervet, Hollande	G4877-1000IU LOT#SLBD0719V
Huile minérale	Sigma Aldrich	CG5-1VL LOT# SLBC6783V
gonadotrophine chorionique humaine et gonadotrophine sérique de jument gestante  ;	(Intervet, Holland)	(invitrogen , 15596-026)
SuperScript® ; III Transcriptase inversetechnologies	la vie	18080-044
Prémélange PCR	;( Bioneer, Daejon, Corée du Sud)	GenDEPOT , A0224-050
Agarose (grade moléculaire)	BioRad	161-3101
Solution de paraformaldéhyde, 4 % dans PBS	Affymetrix USA	19943
polyclonal lapin anti-néogénine	anticorps Santa Cruz Biotechnology, US	SC-15337
Alexa fluor 488 marqué anti-lapin	Anticorps Molecular Probes (Invitrogen, USA)	A-11094
moléculaires d’anticorps anti-lapin marquées Alexa fluor 555	(Invitrogen, États-Unis)	A-21428
Alexa Fluor® ; 555 Phalloïdine	(Invitrogen, États-Unis)	A34055
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate)	Invitrogen, États-Unis	D1306
Humain recombinant RGM-C/Hemojuvelin	R&;D systèmes	3720-RG
toutes constructions plasmidiques  ;	Prof. Wen Cheng Xiong à l’Université des sciences de la santé de Géorgie (Agusta, GA).		Pour le moment, les études ont été aimablement fournies par  ;
Néon® ;   ; Système de transfection	lifetech	MPK10096
Stereo Microscrope	Nikon	SMZ1000
Système de micromainpulation avec Nikon	Nikon	Narishige ONM-1
Micro injecteur	Nikon Narishige	GASTIGHT #1750
Support	Nikon Narishige	Narishige IM 16
Microfuge	Nikon Narishige	Broyeur Narishige MF-900
	Narishige	EG400
Extracteur	Sutter Instrumnet company	P-97
CO2	incubateur Thermo Scientific Forma	EW-39320-16
Veriti® ; Thermocycleur 384 puits  ;	lifetechnologies	4388444

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