Article de méthode

En détection de visage de l'oxyde nitrique et de superoxyde dans la couche endothéliale des artères intactes

DOI :

10.3791/53718

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25 février 2016

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1Cardiovascular and Aging Research, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg, 2Kidney Control of Homeostasis, Swiss National Centre of Competence in Research, 3System Physiology, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cet article , nous décrivons une méthode relativement facile adaptée en utilisant le colorant fluorescent diaminofluorescéine-2 diacétate (DAF-2DA) et dihydroethidium (DHE) pour en face à la détection simultanée et la visualisation de l' oxyde nitrique intracellulaire (NO) et l' anion superoxyde (O 2 .- ) respectivement, fraîchement isolés aortes intactes d'un modèle d'obésité de la souris.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

l'oxyde nitrique endothélial (NO) produit à partir de NO-synthase endothéliale (eNOS) est l'une des molécules vasoprotecteurs les plus importantes dans la physiologie cardiovasculaire. Dysfonctionnel eNOS tel que le désaccouplement de la eNOS conduit à diminuer la biodisponibilité du NO et l' augmentation de l' anion superoxyde (O 2 .-) la production et à son tour , favorise les maladies cardiovasculaires. Par conséquent, la mesure appropriée de NO et O 2 .- niveaux dans les cellules endothéliales sont essentiels à la recherche sur les maladies cardiovasculaires et les complications. En raison de la nature extrêmement labile de NO et O 2 .-, il est difficile de mesurer le NO et O 2 .- directement dans un vaisseau sanguin. De nombreuses méthodes ont été mises au point pour mesurer le NO et O 2 .- production. Il est, cependant, que ce soit insensible ou non spécifique, ou techniquement exigeant et nécessite un équipement spécial. Nous décrivons ici une adaptationde la méthode de fluorescence de colorant pour en détection simultanée du visage et la visualisation des intracellulaire de NO et O 2 .- utilisant la cellule perméable diaminofluorescéine-2 diacétate (DAF 2DA) et dihydroethidium (DHE), respectivement, dans les aortes intactes d'un modèle d' obésité chez les souris induites par une forte teneur en matière grasse-régime alimentaire. Nous avons pu démontrer une diminution intracellulaire NO et O 2 .- amélioré les niveaux dans les aortes intactes fraîchement isolés de l' obésité souris par rapport à la commande souris maigre. Nous démontrons que cette méthode est une technique facile pour la détection directe et la visualisation de NO et O 2 .- dans les vaisseaux sanguins intacts et peut être largement appliquée pour l' étude de la fonction endothéliale (dys) sous (physio) conditions pathologiques.

Introduction

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Les cellules endothéliales vasculaires maintiennent l' intégrité fonctionnelle et structurelle vasculaire en libérant des facteurs vasoactifs 1. Parmi ces facteurs, l' oxyde nitrique dérivé de l' endothélium (NO) produit à partir de L-arginine via NO-synthase endothéliale (eNOS) est le facteur le plus important et le mieux caractérisé en physiologie cardiovasculaire 2. NO provoque la relaxation des muscles lisses et inhibe la prolifération des cellules, inhibe l' agrégation plaquettaire et l' adhésion des cellules inflammatoires et une infiltration dans l'espace sous - endothélial, par conséquent , la protection contre le développement de maladies vasculaires 3. Dans de nombreuses conditions physiologiques et pathologiques, y compris le vieillissement, l' hypertension, le diabète, l' hyperlipidémie, etc., d'un dysfonctionnement endothélial , caractérisé par une diminution augmente la biodisponibilité du NO et O 2 .- production est présent et favorise la pathogenèse de l' athérosclérose 2. Les études de ces dernières années montrent que le désaccouplement de la eNOS est unmécanisme important pour la dysfonction endothéliale, dans laquelle l'enzyme eNOS génère O 2 .- au lieu de NO, dans les diverses conditions précitées 1,4. Par conséquent, l' analyse de la fonction endothéliale, en particulier, la production de NO endothelial et O 2 .- génération est essentielle pour la recherche expérimentale sur les maladies cardio - vasculaires et des complications.

Il existe de nombreuses approches méthodologiques qui ont été développés pour analyser et mesurer la production de NO dans des échantillons biologiques. En raison de la nature extrêmement labile de NO qui est facilement oxydé en NO 2 - et NO 3 - avec une demi-vie de 3 à 6 sec, il est difficile de mesurer NO directement. Par conséquent , la détermination de NO 2 - / NO 3 - dans les échantillons de fluide a été utilisé comme indice de NO libéré à partir de cellules ou de tissus 5. Bien que la procédure est relativement aisée, le procédé est, cependant, chsily affectée par un bruit de fond du NO stable 2 - / NO 3 - contenu dans la solution. Parce que NO stimule la guanylate cyclase soluble pour produire la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) 6, le niveau de cGMP cellulaire a également été déterminée pour estimer la libération de NO 7. Encore une fois, ceci est une estimation indirecte et ne peut pas être spécifique, puisque certains facteurs de endothéliale tels que C-peptide natriurétique de type (CNP) pourrait également améliorer les niveaux de cGMP par l' activation de la guanylate cyclase particulaire 8. Le NO est produit à partir de la L-arginine avec la production de L-citrulline en tant que sous-produit 9, la mesure de la production de L-citrulline est donc également utilisée comme méthode indirecte d'estimation de la production de NO. Les inconvénients majeurs de ce procédé sont qu'il est radioactif et il ne permet pas de mesurer les niveaux de NO bioactif, puisque NO pourrait être libéré rapidement inactivée par O 2 .-; En outre, la L-citrulline peut être recyclé à L-10 l' arginine. D' autres méthodes chimiques telles que la détection de chimioluminescence 11, résonance de spin électronique 12, ou porphyrinique électrochimique NO capteur 13 sont utilisés par plusieurs chercheurs. Ces méthodes ne sont généralement pas faciles à exploiter, les procédures de détection et nécessitent un équipement spécial. Il est également de mentionner que de nombreuses études appliquent des expériences de bain d'organe avec les vaisseaux sanguins isolés avec ou sans l'endothélium pour évaluer la fonction endothéliale et indirectement mesurer NO médiée relaxations vasculaires endothéliales dérivés. Cependant, cette méthode, même si elle est le plus souvent proche de la situation physiologique, mais strictement à-dire, ne mesure pas NO fonction, il évalue plutôt les réponses vasomotrices endothélium médiée en général qui reflètent les effets nets de la fonction eNOS, la production d'autres endothélial détente les facteurs et les facteurs contractants endothéliale, la production de O 2 .-, ainsi que les réponses des cellules musculaires lissesà ces facteurs. Une analyse spécifique de la fonction eNOS ou la production de NO est habituellement exigé 3.

De nombreux groupes de recherche , y compris la nôtre ont, ces dernières années utilisé la méthode de colorant fluorescent pour détecter la production intracellulaire de NO 14-19. Dans cette méthode , la cellule indicateur de fluorescence perméable diaminofluorescéine-2 diacétate (DAF-2DA) a été utilisé pour mesurer la fonction libre NO et NO dans les cellules et tissus in vitro ou ex vivo vivant. Le principe est que dans les cellules vivantes, DAF-2DA est désacétylé par une estérase intracellulaire non fluorescent 4,5-diaminofluorescéine (DAF-2) qui a été ensuite converti en fluorescent DAF-2 triazole (DAF-2T) par réaction avec le NO . La fluorescence du DAF-2T peut être observée sous un microscope à fluorescence ou un microscope à fluorescence confocale à 14. L'intensité de fluorescence intracellulaire reflète donc la production de NO intracellulaire dans les cellules ou l'endothélium intact d'un vesse dans le sangl. Combiné avec un colorant fluorescent spécifique tel que dihydroethidium (DHE), on peut évaluer à la fois intracellulaire de NO et O 2 .- génération dans les cellules ou dans les vaisseaux sanguins 14. De même, la DHE est également un composé cellulaire perméable qui est oxydé par O 2 .- intérieur des cellules, et le produit d'oxydation puis intercale avec des acides nucléiques à émettre une couleur rouge vif détectable quantitativement par microscope à fluorescence ou un microscope à fluorescence confocale. DHE est un colorant très spécifique pour la détection d'O 2 .- partir d' échantillons biologiques, comme il détecte essentiellement des radicaux superoxydes, est bien conservé par les cellules, et peut même tolérer une légère fixation 20. L' un des avantages de cette méthode de fluorescence du colorant est qu'il détecte et visualise NO et / ou O 2 .- en surface directement sur ​​la couche endotheliale intacte d'un vaisseau sanguin vivant.

Dans cet article,nous décrivons cette méthode de fluorescence de colorant pour détecter NO et O 2 .- que nous avons adapté pour en détection de visage de NO et O 2 .- dans les aortes intactes d'un modèle de souris de l' obésité induite par une forte teneur en matière grasse-alimentation (SIH) l' alimentation. Nous démontrons que cette méthode pourrait avec succès et de manière fiable de mesurer NO et O 2 .- niveaux et évaluer la fonction eNOS (dys) dans la couche endothéliale des aortes de souris intactes fraîchement isolées dans l' obésité.

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Protocole

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le travail des animaux a été approuvé par le comité d'éthique de l'Office vétérinaire de Fribourg, Suisse. Le protocole suit les lignes directrices sur la protection des animaux et de l'expérimentation dans notre institution.

1. Préparation d'un Set-up pour incubation de Artères isolé

  1. Construire un système de bain d'organe qui peut être chauffé à 37 ° C et aéré avec 95% O 2 et 5% de CO 2 à partir d' un réservoir de gaz carbonique.
  2. Préparer un tampon de bicarbonate autant de Krebs-Ringer au besoin avec la concentration de la composition suivante: (mM de NaCl 118 mM , KCl 4,7, CaCl2 2,5 mM, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4 25 mM NaHCO 3 0,026 mM d'EDTA et 11,1 mM de D-glucose).
  3. Gardez le tampon du stock sur la glace et aérer le tampon avec 95% O 2 et 5% de CO 2.
  4. Allumez le système de bain d'organe, régler la température à 37 ° C, ajouter 5 ml du tampon prêt à utiliser à chaque chambreet maintenir en aérant le tampon avec 95% O 2 et 5% de CO 2.
  5. Laver les chambres une fois avec un tampon Krebs-Ringer pendant 30 min.
  6. Ajouter 5 ml de tampon Krebs-Ringer à chaque chambre et couvrir la chambre pour éviter l'évaporation.

2. Isolement des aortes de souris

  1. Injecter du pentobarbital qui est dissous dans NaCl à 0,9% par voie intrapéritonéale à la concentration de 150 mg / kg de sacrifier les souris.
  2. Poser la souris passivement sur une planche chirurgicale.
  3. Vaporiser la fourrure de la région de la poitrine avec de l'éthanol à 70% à des fins de désinfection et de l'humidité.
  4. Ouvrir la cavité thoracique en coupant autour de la nervure pour exposer le cœur et les poumons, et enlever les poumons.
  5. Retirer le sang dans la cavité thoracique doucement avec un mouchoir en papier.
  6. Saisir le coeur délicatement avec une pince et détacher l'aorte thoracique en coupant le tissu adipeux périvasculaire entre l'aorte et la colonne vertébrale avec des ciseaux chirurgicaux.
  7. immerger immédiatement le grotissus e dans le froid de la glace (4 ° C) tampon Krebs-Ringer.
  8. Retirer le cœur et l'arc aortique sous un microscope de dissection et de garder le segment de l'aorte thoracique dans le tampon.
  9. Disséquer l'aorte libre d'adhérer le tissu périvasculaire sous un microscope avec des ciseaux et des pinces chirurgicales.
  10. Saisir le bord d'extrémité de l'aorte avec une pince, et rincer le sang dans la lumière vasculaire en rinçant doucement tampon Krebs-Ringer avec 26 G × 1 / 2" seringue.
  11. Couper les anneaux aortiques nettoyés dans de longs segments de 3 mm.
    Remarque: Faites attention à cette étape pour ne pas endommager la couche endothéliale.

3. DHE et DAF-2DA Coloration

  1. Transférez les segments aortiques nettoyés avec une pince aux chambres de bain d'organe rempli avec le tampon de Krebs-Ringer à 37 ° C aéré avec 95% O 2 et 5% de CO 2.
    Remarque: Touchez seulement le côté adventice des anneaux aortiques avec une pince et ne serrer pas le bnavires Lood.
  2. Equilibrer les artères dans la chambre de bain d'organe pendant 30 min.
  3. Ajouter l'acétylcholine (Ach) au bain d'organe à la concentration finale de 1 uM, et on incube les artères pendant 10 min.
  4. Préparer 1 ml de solution DHE / DAF-2DA (5 uM de chaque colorant, dilué de 1000 × stock) avec un tampon Krebs-Ringer préchauffé dans 1,5 ml microtube. Envelopper le tube de microcentrifugation de papier d'aluminium pour éviter exposition à la lumière.
  5. Après stimulation, transférer les anneaux aortiques de bain d'organe à la solution de DHE / DAF-2DA dans un tube de microcentrifugeuse à 37 ° C , aérée avec 95% O 2 et 5% de CO 2 et on incube les anneaux aortiques pendant 30 min.
    Remarque: A partir de cette étape, garder les aortes toujours dans l'obscurité.
  6. Transférez les anneaux aortiques à un nouveau tube avec un tampon Krebs-Ringer pour le lavage et répéter le lavage trois fois en 1 min.
  7. Transférez les anneaux aortiques à une solution de paraformaldéhyde 4% pour la fixation 30min.
  8. Préparer 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) solution (300 nM, dilué de 1000 × stock) avec tampon phosphate salin (PBS) dans un tube de 1,5 ml. Counterstain les aortes pendant 3 min.
  9. Transférer les aortes au nouveau tube avec du tampon PBS pour le lavage pendant 1 min. Répétez le lavage trois fois.
    Remarque: Faites attention de ne pas serrer les anneaux aortiques ou endommager la couche endothéliale.

4. En face de montage

  1. Ajouter une goutte de milieu de montage à la diapositive.
  2. Couper les anneaux aortiques longitudinalement avec des ciseaux de microchirurgie sous microscope, faire les aortes retroussées plat et monter en surface sur le support de montage avec l'endothélium vers le bas sur la lame de verre. Ne déplacez pas les aortes avant et en arrière.
  3. Recouvrir la lame avec lamelle et sceller la lame avec le vernis à ongles.
  4. Après séchage à l'air sous la protection de la lumière, utiliser les diapositives pour l'imagerie directe en quelques heures ou de les stocker à -20 ° C pour les prochains jours.

5. confocale Microscopique Imaging

  1. Utiliser un microscope confocal pour détecter les signaux de fluorescence. Allumer la machine et optimiser les paramètres d'imagerie telles que le grossissement, la vitesse de balayage, la résolution, Z-stack.
    1. Pour ce protocole, utilisez un 200 Hz vitesse de balayage, la résolution de 1024 × 1024 pixels et la taille Z-étape de 0,25 um. Excite fluorescence de DAF-2DA avec 488 nm laser à l'argon et de détecter à 515 nm, alors exciter la fluorescence de DHE à 514 nm et de détecter à 605 nm d'émission.
  2. Utilisez 10X grossissements de se concentrer sur l'échantillon jusqu'à ce que le signal DAPI est clair avec des rayons ultraviolets, puis ajuster l'objectif de 40X grossissements.
  3. Définir la plage de la couche endothéliale en ajustant la position de Z sur le panneau de commande. Les signaux des noyaux DAPI colorées sont des points ovales ou rondes dans la couche endothéliale.
  4. Numérisation à partir du haut(Couche endothéliale à la frontière de la lumière) de l'échantillon à travers toute l'épaisseur de signal et d'enregistrer des images endothéliales. Choisissez au moins 3 champs différents pour balayer chaque échantillon.

6. Analyse des Images

  1. Utilisez le logiciel pour ouvrir les données numérisées par microscope confocal. Choisissez trois images consécutives par champ pour l'analyse et l'évaluation d'au moins 3 champs différents par échantillon. Exporter les images choisies et de les enregistrer sous forme de fichiers JPEG.
  2. Quantifier les images de DAF-2DA, DHE et DAPI coloration avec le logiciel de traitement d'image. Pour l'image de coloration DAPI, choisissez 'Plugins' → 'Analyser' → 'compteur de cellules »pour compter le nombre de DAPI noyau positif.
    1. Pour les images de DAF-2DA et DHE coloration, choisissez «Analyser» → «Mesure» pour analyser l'intensité des signaux, et de prendre la valeur «moyenne» comme l'intensité relative du signal. Présenter ensuite les résultats que le rapport du DAF-2DA ànoyaux positifs DAPI ou rapport de DHE à DAPI. Pour chaque échantillon, prendre la valeur moyenne de chaque image et sur le terrain.
  3. Divisez le résultat de chaque échantillon par la moyenne du groupe témoin pour obtenir le facteur de changement. L'analyse statistique a été réalisée avec apparié test t de Student ou ANOVA avec Dunnett ou post-test de Bonferroni. Fournir des données en moyenne ± SEM. Considérer les différences de valeurs moyennes comme significatives à p <0,05 14.

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Résultats

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L' obésité est un facteur de risque important de maladie ischémique cardiaque coronaire et est associée à une diminution endothéliales biodisponibilité du NO, une caractéristique de la maladie vasculaire athéroscléreuse 21. eNOS désaccouplement a été démontré être un mécanisme important de la dysfonction endothéliale sous de nombreuses conditions physiologiques et pathologiques , y compris le vieillissement de 22, l' athérosclérose, l' obésité et 14. Par ...

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Discussion

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Détection de NO ou O 2 .- avec des colorants fluorescents a été fréquemment utilisé dans de nombreuses études dans les cellules endothéliales en culture et aussi dans cryosections de tissus 23. Ici , nous avons étendu cette méthode pour les vaisseaux sanguins de vie intacte, à savoir, en détection de visage de NO et O 2 .- niveaux dans la couche endothéliale avec DAF-2DA et DHE, respectivement, ce qui est efficace, relativement simple et i...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse (310030_141070/1), le Fonds suisse de cardiologie et le Pôle de recherche national (NCCR-Kidney.CH) Suisse. Yu Yi est soutenu par le Conseil chinois des bourses d’études.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dihydroéthidium (DHE)InvitrogenD 1168dissoudre avec du DMSO à 5  ; mmol/L sous forme de stock 1 000x, stocké à -20  ; ° ; C
Diacétate de diaminofluorescéine-2 (DAF-2DA)Calbiochem251505se dissoudre avec le DMSO à 5  ; mmol/L sous forme de stock 1 000x, stocké à -20  ; ° ; C
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)InvitrogenD 1306dissoudre avec de l’eau à 300  ; et micro ; mol/L comme 1 000x le stock, stocké à 4  ; ° ; C
Support de montageVector main-d’œuvre. (réactolab)H-1000
Nω ; Chlorhydrate d’ester méthylique Nitro-L-arginine (L-NAME)Sigma-aldrichN5751
PentobarbitalSigma-aldrichP3636
Système multi-myographe  ;Microscope danois Myo Technology A/Smodèle 610M
NikonSMZ800
  ;Leica  ;DM6000  ;
Logiciel de traitementd’images National Institute of Health (NIH)Image J  ;
Ciseaux chirurgicaux  ;S& T AGSDC-11
Ciseaux microchirurgicaux  ;F.S.T15000-01
PinceS& T AGJF-5
Lamelle ronde diamètre 15  ; mmVWR631-1579
Embouts 1 mlVWRRFL-1200c  ;
Pointes 200 μ ; lVWR613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 mlEppendorf  ;
Chlorure d’acétylcholineSigma-aldrichA-6625
Microscope confocal 30120086

Références

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Mots-clés

D tection du monoxyde d azoted tection du superoxydeimagerie en facemicroscopie confocalemarquage par colorant fluorescentd couplage de l eNOSmod le murin d ob sitendoth lium vasculaire

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