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Article de méthode

A Haute Résolution méthode de surveillance activation phosphorylation dépendante de IRF3

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DOI :

10.3791/53723

⸱

24 janvier 2016

 ,  ,  , 
1CRCHUM - Research center, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, Université de Montréal, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, 3Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une procédure permettant une analyse détaillée de l’activation dépendante de la phosphorylation du facteur de transcription IRF3. Ceci est réalisé grâce à la combinaison d’un SDS-PAGE haute résolution et d’un PAGE-natif couplé à des immunoblots utilisant plusieurs anticorps phosphospécifiques.

Résumé

Le facteur de transcription IRF3 est essentiel pour la première ligne de défense contre les agents pathogènes, principalement par le biais de l’interféron β et de l’expression des gènes antiviraux. Une analyse détaillée de l’activation d’IRF3 est essentielle pour comprendre comment les agents pathogènes induisent ou échappent à la réponse antivirale innée. Des formes activées distinctes d’IRF3 peuvent être distinguées en fonction de leur phosphorylation et de leur statut monomère vs dimère. La discrimination in vivo entre les différentes espèces activées d’IRF3 peut être réalisée par la séparation des formes phosphorylées d’IRF3 en fonction de leurs déplacements de mobilité sur SDS-PAGE. De plus, les niveaux de monomères et de dimères IRF3 peuvent être surveillés à l’aide d’une électrophorèse non dénaturante. Ici, nous détaillons une procédure pour atteindre la résolution la plus élevée afin d’obtenir le plus d’informations concernant l’état d’activation de l’IRF3. Ceci est réalisé grâce à la combinaison d’un SDS-PAGE haute résolution et d’un PAGE-natif couplé à des immunoblots utilisant plusieurs anticorps totaux et phosphospécifiques. Cette stratégie expérimentale constitue une approche abordable et sensible pour acquérir toutes les informations nécessaires à une analyse complète de l’activation d’IRF3 par la phosphorylation.

Introduction

Le facteur de transcription ubiquitaire et exprimé de façon constitutive interféron (IFN) Facteur de réglementation 3 (IRF3) est crucial pour la première ligne de défense contre les agents pathogènes principalement par l'induction d'IFNß, mais aussi grâce à l'induction de la chimiokine (CC motif) ligand 5 (CCL5 ) et de plusieurs protéines, y compris la protéine antivirale de l'IFN-induite avec tétratricopeptide répète IFIT1 / 2/3 de 1-3. Activation de IRF3 a été rapporté ci-après infection avec de nombreux virus, ou l'exposition à l'acide polyinosinique-polycytidylique (poly I: C) ou un lipopolysaccharide (LPS) 4. Surtout, les virus les plus étudiés ont développé des mécanismes pour échapper à la réponse de IRF3 médiation, et ainsi échapper à l'hôte de la défense immunitaire innée 5. Ainsi, le suivi de l'activation IRF3 est d'une grande importance pour comprendre les mécanismes moléculaires de la défense de l'hôte antivirale innée, mais aussi d'identifier la stratégie utilisée par les virus pour contrer cette réponse.

ent "> De nombreux rapports publiés fournissent cependant seule une analyse limitée de l'activation du IRF3 effectuée par la surveillance de l'induction du gène IRF3-cible (IFNB1 et IFIT1) et / ou de dosage de gène rapporteur de luciférase couplée à une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de Polyacrylamide à faible résolution de sodium (SDS- PAGE) analyse des IRF3. Cependant, de nombreuses études biochimiques, l'analyse du comportement des différents mutants IRF3 et l'élucidation de la structure cristalline de IRF3 6-11 ont contribué à établir que IRF3 est soumis à un ensemble complexe de modifications post-traductionnelles séquentielles par phosphorylation au plusieurs sites. L'ensemble de phosphorylation impliqué dans l'activation des IRF3 semble être dépendante de la stimulation et le plus probable sur le type cellulaire. Dans les cellules non infectées, IRF3 coexiste comme espèce non phosphorylés et hypophosphorylé contenant phosphoresidues, y compris Thr135 et Ser173, dans la 1 -198 aa région N-terminale 6,12-14. L'accumulation de cette hypophosphorylé form de IRF3 est induite par des inducteurs de stress, des facteurs de croissance et des agents endommageant l'ADN 6. La phosphorylation de résidus Ser / Thr dans la région C-terminale de IRF3 contenant le domaine de transactivation est déclenchée suite à l'activation par des virus, le poly I: C, ou le LPS dans un type de cellules de manière dépendante de 15 à 17. C-terminal phosphorylation de IRF3 implique pas moins de 7 sites de phosphoacceptor distincts organisés en deux groupes principaux, Ser385 / Ser386 et Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, qui contribuent chacun à l'activation de IRF3 par dimérisation, accumulation nucléaire, association avec le CREB protéine liant le (CBP) / co-activateurs p300, se liant à l'IFN élément de réponse sensible (ISRE) des séquences consensus et la transactivation de gènes cibles 9,10,17-19 ADN. La phosphorylation de Thr390 est également pensé pour contribuer à IRF3 activation induite par le virus 20. Analyses de spectrométrie de masse IRF3 ont démontré que les résidus Ser386, Thr390, Ser396 et Ser402 sont directement phosphorylated par l'inhibiteur de kinase kB ε (IKKε) / TANK contraignant kinase 1 (TBK1) kinases 9,10. Phosphorylation sur les résidus C-terminal est également nécessaire pour la terminaison de l'activation de IRF3 travers polyubiquitination et le protéasome de dégradation 10. Ce processus est également dépendante de la phosphorylation sur Ser339, qui est nécessaire pour le recrutement du propyle isomérase Pin1 10,11. Espèces IRF3 contenant au moins phospho-Ser339 / 386/396 résidus sont considérés comme des formes hyperphosphorylées. La séquence exacte et la fonction de chaque site reste un sujet de discussion 10,21. Il est maintenant clair que IRF3 activé ne représente pas un état ​​homogène, mais que les différentes espèces activées présentant des caractéristiques de phosphorylation ou dimérisation distinctes existent 10,22.

Pour fournir une compréhension complète de l'activation de IRF3 en réponse à des agents pathogènes spécifiques, il est donc nécessaire de characterize laquelle des espèces activées sont induites. L'induction de gènes cibles, de IRF3 IFNB1 et IFIT1, est révélée fournir une lecture fiable de l'activation du IRF3. Toutefois, le suivi expression de ces gènes ne fait pas de distinction entre les différents états d'activation du IRF3. Une analyse complète des états d'activation IRF3 dans un contexte particulier repose sur la caractérisation détaillée de sa phosphorylation et dimérisation état ​​10. Phosphorylée (formulaire I), hypophosphorylée (forme II) et (hyperphosphorylées formes III et IV) de formes IRF3 6,18,23 peut être résolu avec succès par une mobilité réduite en haute résolution analyse SDS-PAGE. Espèces IRF3 monomères et dimères peuvent être efficacement identifiés par analyse PAGE natif. Ces approches sont grandement améliorées lorsqu'il est utilisé en combinaison avec des anticorps dirigés contre les sites phosphospécifiques IRF3 de phosphoacceptor distinctes.

Les protocoles standard permettent une faible résolution deprotéines qui ne permettent pas une séparation efficace des IRF3 distincte formes phosphorylée. Ici, nous décrivons en détail une procédure pour obtenir la plus haute résolution pour surveiller l'induction d'espèces IRF3 de virus activé distinctes en utilisant SDS-PAGE couplé à PAGE natif en combinaison avec immunoblot utilisant des anticorps totaux et phosphospécifiques. In vivo discrimination entre les différentes activé formes de IRF3 est effectuée sur la base de leurs quarts de mobilité observées sur SDS-PAGE. En outre, le monomère et le dimère IRF3 peuvent être distingués par électrophorèse non dénaturantes. La combinaison de ces deux techniques complémentaires avec immunotransfert révèle être une approche abordable et sensible à l'acquisition de toutes les informations nécessaires pour une analyse complète de l'activation de la phosphorylation médiée par IRF3.

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Protocole

REMARQUE: Le protocole est décrit ici en utilisant des cellules A549 infectées avec le virus Sendai (SeV). Toutefois, le protocole de SDS-PAGE et PAGE natif travaille également avec tous les types humains et murins cellulaires testées jusqu'à présent, en particulier les cellules myéloïdes stimulées par divers stimuli 9,15,19,24,25 IRF3 activation.

1. L'infection de cellules A549

  1. Maintenir cellules A549 en culture dans une plaque de 15 cm à 37 ° C / 5% CO 2 dans 20 ml F12K moyen / Ham contenant 10% de sérum inactivé par la chaleur de veau fœtal (HI-FBS) et 1% de L-glutamine (F12K complet / moyen Ham).
    NOTE: Toutes les solutions utilisées pour la culture et les traitements cellules doivent être stériles.
  2. À 24 h avant l'infection, aspirer le milieu et laver les cellules avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate distillée (D-PBS) à température ambiante.
  3. Ajouter 1 ml de solution de trypsine-EDTA à 0,25% à chaque plaque pour couvrir les cellules et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
  4. Arrêtez l'incubation dès que ee cellules commencent à se détacher de la plaque en tapotant doucement la plaque avec une seule main. Inactiver la trypsine par addition de 10 ml de milieu complet F12K préchauffé / Ham par plaque et transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml.
  5. Centrifuger à 350 g pendant 3 min à température ambiante. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 8 ml de milieu complet F12K / Ham pour obtenir une suspension cellulaire unique homogène.
  6. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Ensemencer les cellules à une densité de 1 x 10 6 cellules par 60 mm plaque dans 4 ml d'F12K moyen / Ham complète pré-chauffé. Incuber pendant 20 - 24 heures à 37 ° C / 5% de CO 2. Après 20 à 24 h, les cellules forment une monocouche confluente à 90% (ce qui correspond à 1,5 x 10 6 cellules).
  7. Retirer le moyen et laver les cellules avec 2 ml d'F12K sans sérum / milieu Ham (AFD). Ajouter 2 ml de GDF frais par 60 mm plaque.
  8. Décongeler une aliquote de virus Sendai (SeV) (stockée en aliquotes à -80 ° C) sur de la glace et le vortex brièvement.
  9. Diluer evirus de la e en pré-chauffée GDF pour obtenir 60 HAU / 100 pi. Mélanger en pipetant doucement et ajouter 100 ul de virus dilué par plaque pour effectuer l'infection à 40 HAU / 10 6 cellules. Ne pas ajouter de virus dans la plaque témoin non infecté.
  10. Incuber les cellules dans l'incubateur à 37 ° C / 5% CO 2. Agiter à la main les plaques 3 ou 4 fois, ou en utilisant un agitateur orbital à bascule ou automatique placé directement dans l'incubateur, pendant la première heure de l'infection.
  11. À 2 heures post-infection, ajouter 2 ml de milieu F12K / Ham contenant 20% HI-FBS pour obtenir une concentration finale de 10% HI-FBS.
  12. Incuber les cellules dans l'incubateur à 37 ° C / 5% de CO 2 pour un montant supplémentaire de 1, 4 et 7 heures pour atteindre le temps total d'infection de 3, 6, et 9 h, respectivement. À chacun de ces points dans le temps, passez à l'étape 2.1.

2. Préparation des extraits de cellules entières (WCE)

  1. Enlever le milieu d'infection. Récolter les cellules par grattage dans 1 mlrefroidi à la glace de D-PBS et transférer la suspension cellulaire à un tube de 1,5 ml centrifugeuse pré-refroidi.
  2. Pellet les cellules par centrifugation à 16 000 xg à 4 ° C pendant 20 s et décanter soigneusement toutes les traces de D-PBS.
    NOTE: À cette étape, le culot cellulaire peut être soumis directement à l'extraction des protéines ou surgelé dans de l'azote liquide ou de glace / bain d'éthanol sec et stocké à -80 ° C jusqu'à ce que la lyse.
  3. Préparer le tampon de lyse contenant 50 mM de HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 10% de glycerol et 1% de Nonidet P-40 dans de l'eau désionisée (ddH 2 O). Ajouter Extemporarily protease (1 pg / leupeptine ml et 2 ug / ml d'aprotinine) et la phosphatase inhibiteurs (fluorure de sodium à 5 mM, 1 mM activé orthovanadate de sodium, 2 mM de phosphate de p-nitrophényle et 10 mM de β-glycérophosphate, pH 7,5).
    NOTE: Le tampon de lyse sans inhibiteurs peut être conservé à 4 ° C. Un protocole spécifique pour l'activation de l'orthovanadate de sodium est décrite dans le tableau des réactifs spécifiques / Equipment.
  4. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 70 ul de tampon de lyse. Typiquement, la concentration du lysat sera d'environ 2 ug / ul.
  5. Incuber sur de la glace pendant 20 min. Flash gel du lysat par incubation dans un bain d'azote liquide pendant 15 secondes. Décongeler le lysat à température ambiante jusqu'à ce qu'il soit complètement fondu et vortex pendant 10 sec. Répétez le dégel cycle de congélation / / Vortex 3 fois.
    1. Sinon, effectuer l'étape de congélation dans un / bain de glace sèche d'éthanol pendant 1 min.
  6. Centrifuger à 16 000 xg à 4 ° C pendant 20 min. Transférer le surnageant (correspondant à la WCE) à 1,5 ml d'un nouveau tube de centrifugation de pré-refroidi. Gardez le WCE sur la glace en tout temps.
  7. Quantifier les protéines en utilisant une procédure de quantification de protéine compatible avec le tampon de lyse tel que à base de protéines de Bradford 26 dosage.

3. Résolution du WCE par High Résolution SDS-PAGE

  1. Préparer trois gels d'électrophorèse dénaturant.
    1. Pour la détection deFormes IRF3, verser deux gels d'au moins 16 cm de longueur avec un gel de séparation, composé de 7,5% d'acrylamide / bis-acrylamide (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% de dodécylsulfate de sodium (SDS ), 1% de persulfate d'ammonium et 0,1% de TEMED à ddH 2 O et d'un gel d'empilement composé de 4% d'acrylamide, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% de SDS, 1% de persulfate d'ammonium et 0,1% de TEMED à ddH 2 O.
      Prudence! Acrylamide, TEMED et SDS sont toxiques et / ou irritants. Porter des gants et manipuler sous une hotte.
    2. Pour la détection des protéines SEV, verser un gel d'au moins 8,5 cm de longueur avec des caractéristiques similaires au gel décrit dans 3.1.1, sauf que le gel de séparation contient 12% d'acrylamide.
  2. Dénaturer le WCE obtenu à l'étape 2.6 en ajoutant de 1: 4 (v / v) de tampon 5x de chargement (Tris-HCl 125 mM, pH 6,8 (température ambiante), 10% de SDS, 20% (p / v) de glycerol, 0,0005% de bleu de bromophénol et β-mercaptoéthanol 25% en ddH 2 O) puis on chauffe à 100 °C pendant 10 min. Rotation rapide des tubes pour faire baisser la condensation qui se forme dans le capuchon.
    Prudence! β-mercaptoéthanol est toxique par inhalation. Porter des gants et manipuler sous une hotte.
  3. Montez les gels dans l'appareil de la migration. Remplir les chambres supérieure et inférieure avec un tampon contenant 25 mM Tris-base, 0,1% de SDS et 192 mM de glycine dans de l'eau distillée (dH 2 O) en cours d'exécution.
  4. La charge 14 pi de standard de poids moléculaire dans un puits de chaque gel de 16 cm et 7 ul de standard de poids moléculaire dans un puits du gel 8,5 cm. Charge 30 pg de WCE dénaturé (préparé comme décrit dans l'étape 3.2) par puits des deux gels préparés à l'étape 3.1.1 pour la détection des formes de IRF3. Charge 8-10 pg de WCE dénaturé (préparé comme décrit dans l'étape 3.2) par puits sur le gel préparé dans l'étape 3.1.2 pour l'analyse de SeV.
  5. Faire passer les gels à 30 mA de courant constant jusqu'à ce que le front de migration atteigne le fond du gel.
    Remarque: La migration dure généralement approximationdiatement 3 h pour un gel de 16 cm et 45 min pour un gel de 8,5 cm.
  6. Procéder au transfert sur des membranes de nitrocellulose (étape 5).

4. Analyse des IRF3 dimérisation par Native-PAGE

NOTE: Cette méthode a été décrite par le groupe du Dr T. Fujita 27.

  1. Préparer les supérieurs - (+) des tampons d'électrophorèse et de la chambre inférieure (). Le tampon de la chambre supérieure est constituée de 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT), 192 mM de glycine et 1% de désoxycholate de sodium (DOC) en ddH 2 O. Le tampon de la chambre inférieure contient 25 mM de Tris-HCl pH 8,4 (RT) et 192 mM de glycine dans ddH 2 O.
    REMARQUE: Les tampons d'électrophorèse chambre supérieure et inférieure peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'à utilisation. Cependant, assurez-vous qu'ils sont pré-chauffés à température ambiante avant d'effectuer l'électrophorèse.
  2. Pour un gel non dénaturant de résoudre une longueur minimum de 8,5 cm contenant 7,5% d'acrylamide / bis-acrylamide (37,5: 1), 375 mM de Tris-HCl pH 8,8 (RT), 1% munitionsnium persulfate et de 0,1% dans TEMED ddH 2 O.
  3. Pré-exécuter le gel à 40 mA de courant constant pendant 30 minutes sur la glace. Appuyez sur l'appareil en cours d'exécution dans la glace à environ le niveau du tampon d'électrophorèse de la chambre inférieure. Il est important que le gel se trouve pas dans la glace.
  4. Pendant la pré-course, mélanger WCE conservés sur la glace avec 2x PAGE natif tampon de charge 1: 1 (v / v) contenant 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% de glycérol et 0,1% de bleu de bromophénol dans ddH 2 O.
  5. Charge 8 - 10 pg WCE (préparé comme décrit dans l'étape 4.4) immédiatement à la fin de la pré-course.
  6. Exécuter le gel à 25 mA de courant constant sur de la glace, comme décrit ci-dessus pour la pré-course, jusqu'à ce que le front de migration atteigne le fond du gel (environ 40 min).

5. Analyse par immunoblot de IRF3 espèces

  1. Préparer le tampon de transfert contenant 25 mM Tris-base 192 mM et de la glycine en ddH 2 O. Réfrigérer le tampon de transfert à 4 ° C avant utilisation.
  2. Wet trois morceaux de membrane de nitrocellulose coupés à une taille légèrement plus grande que les gels dans une boîte en plastique / verre contenant le tampon de transfert. Indiquer l'orientation de la membrane en coupant un coin. Le tampon de transfert peut être réutilisé 3 fois. Stocker le tampon à 4 ° C entre les utilisations.
  3. Les gels Uncast (SDS-PAGE et PAGE natif) et couper un coin de chaque gel pour une orientation correcte.
    1. Pour PAGE natif, incuber le gel à température ambiante avec agitation douce pendant au moins 30 min dans le tampon SDS-PAGE courante pour enlever le DOC avant de les transférer dans la mémoire tampon de transfert.
  4. Incuber les gels de SDS-PAGE (natif et-PAGE) dans le tampon de transfert de 5 - 10 min.
  5. Monter un sandwich de transfert par gel dans une cassette de transfert avec la membrane vers l'électrode positive (mousse papier pad / filtre / membrane / gel / papier filtre / tapis de mousse). Veillez à retirer toutes les bulles entre les couches du sandwich.
  6. Effectuer le transfert que b recommandéy le fabricant pour l'appareil de transfert utilisé.
    REMARQUE: Effectuer toutes les incubations et lavages dans les prochaines étapes sur une plate-forme à bascule ou secouer orbitale.
  7. A la fin du temps de transfert, incuber les membranes pendant 15 min dans la solution de fixation contenant de l'acide acétique à 7%, 40% d'éthanol et 3% de glycerol dans ddH 2 O. Laver les membranes 3x 5 min dans du PBS (137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10,2 mM Na 2 HPO 4 et 1,8 mM KH 2 PO 4 en DH 2 O).
    Prudence! L'acide acétique est toxique, irritant et inflammable. Porter des gants et manipuler sous la hotte.
    NOTE: La solution de fixation peut être réutilisé plusieurs fois.
  8. Pour la membrane PAGE natif passer directement à l'étape 5.11.
  9. Rincer les membranes trois SDS-PAGE rapidement dans dH 2 O avant de les faire incuber pendant 1 minute dans une solution de rouge ponceau contenant 6,57 mM de rouge Ponceau et de l'acide acétique à 1% dans ddH 2 O.
    NOTE: La solution de ponceau rouge peut être r eused plusieurs fois.
  10. Rincer les membranes dans dH 2 O jusqu'à ce que le fond est assez blanche pour voir les bandes de protéines colorées en rouge. Notez les marqueurs avec un crayon et couper la membrane excès autour de protéines. Destain les membranes par incubation pendant 5 min dans du PBS sous agitation.
  11. Incuber les membranes pendant 1 heure à la température ambiante ou O / N à 4 ° C dans la solution de blocage (PBS contenant 0,05% de Tween 20 et de lait en poudre 5% non gras (PBS-T-lait). Laver les membranes 3x 5 min à PBS-T.
    NOTE: Le lavage PBS-T est en option et nécessaire seulement lors de l'application stricte des anticorps dilué dans du PBS-T contenant 5% d'albumine de sérum bovin (PBS-BSA-T) (figure 1 et tableau 1) dans l'étape suivante.
  12. Incuber les quatre membranes (par SDS-PAGE et PAGE natif) avec les anticorps primaires selon l'ordre séquentiel indiqué dans la Figure 1 et le Tableau 1. Effectuer 5x 5 min lavages dans du PBS-T.
"> figure-protocol-1
Figure 1. Séquence des analyses immunoblot. Le schéma décrit les SDS-PAGE et PAGE natif gels individuels nécessaires pour détecter les différentes formes phosphorylées et monomères / dimères IRF3. L'ordre spécifique des anticorps appliqués à la membrane obtenue à partir de chaque gel dans la procédure d'immuno-empreinte est décrite. On notera que les anticorps anti-actine sont utilisés d'abord à assurer l'égalité de chargement des échantillons avant l'application d'autres anticorps spécifiques. La séquence alternée, avec des anticorps anti-actine étant appliquée après que les anticorps anti-phospho-IRF3, fonctionne aussi. Décapage est utilisé entre anti-actine et des anticorps anti-SEV, ou entre anti-phospho-IRF3 et des anticorps anti-IRF3 en raison du chevauchement taille des signaux. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les anticorps primaires Dilution Tampon de dilution Incubation Anticorps secondaires commentaires
Anti-actine 1 / 10.000 PBS-T-BSA 15 min à température ambiante Anti-souris Utilisez après SDS-PAGE
Antibodyies dilué peuvent être réutilisés plusieurs fois si elle est stockée à 4 ° C en présence de 0,02% d'azoture de sodium.
Anti-IRF3-P-Ser386 1/200 PBS-T-BSA O / N à 4 ° C Anti-lapin Utilisez après Native-PAGE.
Il est recommandé de ne pas réutiliser l'anticorps dilué
Anti-IRF3-P-Ser396 1 / 10.000 PBS-T-BSA O / N à 4 ° C Anti-lapin Utilisez après SDS-PAGE.
Il est recommandé de ne pas réutiliser l'anticorps anti-IRF3-P-396 dilué est également disponible auprès de Cell Signaling. Dilution optimale a été définie comme 1 / 1.000 pour cet anticorps, mais peut varier entre les lots.
Anti-IRF3-P-Ser398 1 / 10.000 PBS-T-BSA O / N à 4 ° C Anti-lapin Utilisez après SDS-PAGE. Il est recommandé de ne pas réutiliser l'anticorps dilué
Pleine longueur Anti-IRF3 1/7500 PBS-T-lait 3 heures à température ambiante Anti-lapin Utilisez après SDS-PAGE. Anticorps pleine longueur Anti-IRF3 peut être utilisé après PAGE natif, mais il est moins sensible pour détecter le monomère. Anticorps dilué peuvent être réutilisés plusieurs fois si elle est stockée à 4 ° C en présence de 0,02% d'azoture de sodium.
Anti-IRF3-NES 0,5 pg / ml PBS-T-lait 3 heures à température ambiante Anti-lapin Utilisez après Native-PAGE. Antibodyies dilué peuvent être réutilisés plusieurs fois si elle est stockée à 4 ° C en présence de 0,02% d'azoture de sodium.
Anti-SEV 1 / 14.000 PBS-T-BSA 3 heures à température ambiante Anti-lapin Utilisez après SDS-PAGE. Antibodyies dilué peuvent être réutilisés plusieurs fois si elle est stockée à 4 ° C en présence de 0,02% d'azoture de sodium.
REMARQUE: Dilution et tampon utilisé pour Anticorps secondaires HRP-couplées doivent être optimisés car il varie d'une entreprise à l'autre.

Tableau 1. Spécifications d'anticorps utilisés dans la procédure Immunoblotting.

  1. Incuber les membranes avec la peroxydase de raifort (RHP) conjugué à des anticorps secondaires comme détaillé sur la figure 1 et le tableau 1. Laver les membranes 5 fois 5 min dans du PBS-T, suivi de 2 x 5 min dans du PBS pour éliminer complètement les traces de Tween.
  2. Incuber les membranes pendant 1 min dans un volume de réactif de chimioluminescence amélioré suffisante pour couvrir complètement les membranes. Sécher les membranes à l'aide du papier filtre.
  3. Placer la membrane dans un analyseur d'image luminescent pour visualiser les bandes immunoréactives.
    1. Sinon, effectuer la détection des bandes immunoréactives utilisant sensibles films X-Ray.
  4. Laver les membranes 3x 5 min dans du PBS.
    NOTE: À cette étape, les membranes peuvent être gardés au sec. Cependant, si d'autres décapage est requis, il est préférable d'effectuer le décapage avant le séchage de la membrane. Les membranes peuvent également être stockées à court terme dans le PBS.
  5. Pour les membranes qui ne nécessitent pas de décapage entre incubation avec des anticorps (voir la figure 1) de procéder directement à l'étape5.20.
  6. Lorsque le décapage est nécessaire entre des anticorps (voir Figure 1), incuber les membranes dans une solution pré-chauffé décapage contenant 2% de SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) et de 0,7% β-mercaptoéthanol dans le trou DDH 2 O à 50 ° C pendant 20 min sous agitation régulière. Laver les membranes 3x 5 min dans du PBS.
    REMARQUE: Agitation pendant la procédure de décapage est la clé. Décapage peut être effectué dans un four à hybridation. Alternativement, le décapage peut être effectuée en utilisant des membranes scellés dans des sacs en plastique et immergé dans un bain d'eau. Dans ce cas, il est important d'agiter les membranes 4 - 5 fois au cours de l'incubation.
  7. Incuber les membranes pendant 1 heure à température ambiante ou O / N à 4 ° C dans du PBS-T-lait.
  8. Répéter les étapes 5,12 à 5,16 selon la figure 1.

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Résultats

La figure 2 montre une image typique de immunoblot IRF3 détecté avec IRF3 anticorps totaux et des anticorps IRF3-phosphospécifiques contre Ser396 et Ser398 après la résolution de WCE par haute résolution SDS-PAGE. Dans les cellules non stimulées A549, IRF3 est détecté comme deux bandes à 50 et 53 kDa sur SDS-PAGE correspondant à la non-phosphorylée (formulaire I) et le hypophosphorylé (forme II) espèces de IRF3. L'exposition des cellules A549 au SEV pour les 3 - 9 ré...

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Discussion

Le protocole que nous décrivons ici se compose d'une combinaison de haute résolution SDS-PAGE et PAGE natif couplé à l'utilisation de plusieurs anticorps phosphospécifiques à distinguer le monomère / dimère et phosphoforms I-IV de IRF3. Détection approprié de ces espèces IRF3 est essentiel pour caractériser complètement l'activation de IRF3 dans un contexte spécifique. Par exemple, LPS stimulation de macrophages activés conduit à la formation de dimères, Ser396 / 398 IRF3 phosphorylée qui présente une hypoph...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs remercient les membres précédents et actuels du laboratoire pour le développement des protocoles. Les travaux ont été financés par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) [subvention # MOP-130527] et le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada [CRSNG-355306-2012]. NG est récipiendaire d’une chaire de recherche du Canada de niveau II. AR est titulaire d’une bourse d’études du programme de formation du Réseau de recherche en santé respiratoire du Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
F12/HamLife Technologies11765-054Chaud dans un 37 ° ; C avant utilisation.
Sérum fœtal bovinLife Technologies12483-020
L-glutamineLife Technologies25030-081
D-PBSLife Technologies14190-144Pour la culture cellulaire.
Trypsine/EDTA 0,25 %Life Technologies25200-072
Virus de Sendai Souche CharlesRiver Laboratories600503
HepesBioshopHEP001
Chlorure de sodium (NaCl)BioshopSOD001.5
EDTABioshopEDT001
GlycérolBioshopGLY001.1Coupez l’extrémité de la pointe et pipetez lentement car elle est très épaisse.
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI7771Marque déposée correspondant à Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) détergent
LeupeptinBioshopLEU001
AprotininBioshopAPR600.25  ;
Fluorure de sodiumSigma-Aldrich201154
Orthovanadate de sodiumMP Biomedicals159664Activation de l’orthovanadate de sodium 0,2 M : 1) Ajuster le pH à 10,0 en utilisant soit 1 N NaOH, soit 1 N HCl. Le pH de départ de la solution d’orthotovanadate de sodium peut varier avec beaucoup de produit chimique. 2) La solution est jaune à pH 10,0. 3) Faire bouillir jusqu’à ce qu’il soit incolore. 5) Ajustez le pH à 10,0 et répétez les étapes 3 et 4 jusqu’à ce que la solution reste incolore et se stabilise à 10,0. Stocker les aliquotes d’orthovanadate de sodium activé à -20 °C.
phosphate de p-nitrophényle sel disodique hexahydratéSigma-AldrichP1585
Bêta-glycérophosphateSigma-AldrichG6376  ;
Réactif de dosage des protéines Bio-Rad  ;Bio-Rad500-0006  ;cytotoxique
Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 %BioshopACR005  ;cytotoxique
Tris-BaseBioshopDEO701
Acide chlorhydrique (HCl)LabChemLC15320-4  ;Travailler sous hotte. Toxique et irritant.
Dodécylsulfate de sodium (SDS)BioshopSDS001.1  ;irritant.
Persulfate d’ammoniumSigma-AldrichA3678
TEMEDInvitrogen15524-010Toxique et irritant.
Bleu de bromophénolFisher ScientificB392-5
Bêta-mercaptoéthanolSigma-AldrichM6250Fonctionne sous hotte. Toxique pour le système nerveux, les muqueuses. Peut être toxique pour les voies respiratoires supérieures, les yeux, le système nerveux central.
GlycineBioshopGLN001.5
Désoxycholate de sodiumSigma-AldrichD6750
Hydroxyde de sodium (NaOH)BioshopSHY700  ;irritant.
Membrane nitrocellulosique (0,45 mm)Bio-Rad162-0115
Acide acétique glacialBioshopACE222.4Travail sous hotte. Toxique, irritant et inflammable.
Ponceau rougeSigma-AldrichP3504  ;   ;
Chlorure de potassium (KCl)Sigma-AldrichP3911  ;Pour la composition PBS pour immunoblot.
Na2HPO4BioshopSPD307.5Pour une composition PBS pour immunoblot.
KH2PO4Sigma-AldrichP0662  ;Pour la composition PBS pour immunoblot.
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA7906Pour la composition de PBS-T-BSA pour immunoblot.
Lait écrémé en poudreCarnation
Poly sorbate 20 (Tween)MP Biomedicals103168Coupez l’extrémité de la pointe et pipetez lentement car elle est très épaisse.
Anti-IRF-3-P-Ser386IBL-America18783Stocker aliquote à -20 oC. Eviter le gel/dégel.
Anti-IRF-3-P-Ser396Fait maison19Store aliquote à -80 oC. Eviter le gel/dégel.
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)Technologie de signalisation cellulaire4947sStocker à -20 oC.
Anti-IRF-3-P-Ser398Fait maison15Store aliquote à -80 oC. Eviter le gel/dégel.
Anti-IRF-3-full-lengthActif motif39033Store aliquote à -80 oC. Eviter le gel/dégel.
Anti-IRF3-NESIBL-America18781Magasin aliquote à -20 oC.
Western Lightning Réactif de chimiluminescence PlusPerkin-Elmer Life SciencesNEL104001EA
LAS4000mini Appareil de caméra CCDGE healthcare
SDS-PAGE Normes de poids moléculaire, large gammeBio-Rad161-0317Magasin aliquote à -20 oC.

Références

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