Un système d'injection de pression pour les enquêtes de la neuropharmacologie de traitement de l'information dans Awake Behaving Singe Macaque Cortex

Résumé

Ici, nous montrons l’injection sous pression de substances neuropharmacologiques lors de l’enregistrement d’une cellule unique chez un singe macaque éveillé et au comportement défavorable. Cette procédure permet une manipulation pharmacologique à proximité directe d’un site d’enregistrement cortical.

Résumé

La modulation descendante du traitement de l’information corticale par anticipation est fonctionnellement importante pour de nombreux processus cognitifs, y compris la modulation du traitement de l’information sensorielle par l’attention. Cependant, on sait peu de choses sur les systèmes de neurotransmetteurs impliqués dans de telles modulations. Une façon pratique de répondre à cette question est de combiner l’enregistrement d’une cellule unique avec une manipulation neuropharmacologique locale et temporaire dans un modèle animal approprié. Nous démontrons ici une technique combinant des enregistrements aigus de cellules uniques avec l’injection d’agents neuropharmacologiques à proximité directe de l’électrode d’enregistrement. La vidéo montre la préparation du système d’injection/d’enregistrement sous pression, y compris la préparation de la substance à injecter. Nous montrons un singe rhésus effectuant une tâche d’attention visuelle et la procédure d’enregistrement unitaire avec des manipulations pharmacologiques par blocs.

Introduction

Dans les zones corticales et sous-corticales, l’activité neuronale est affectée par divers neuromodulateurs, par exemple l’acétylcholine¹. Ces effets modulateurs sur les réponses neuronales ont été rapportés dans des études in vitro ², ainsi que dans des enregistrements électrophysiologiques d’animaux anesthésiés³ et des manipulations pharmacologiques systémiques chez l’homme⁴. Néanmoins, le rôle exact des différents neuromodulateurs et l’implication de divers sous-types de récepteurs sont largement inconnus. Pour mesurer les effets de neuromodulateurs spécifiques sur l’activité de neurones uniques, il est souhaitable d’induire un changement temporaire de neuromodulateur aussi près que possible de l’électrode enregistreuse. De plus, il est important que ces manipulations soient effectuées chez les animaux éveillés, car les fonctions cognitives ne sont présentes qu’en l’absence d’anesthésie. De plus, l’anesthésie interagit avec les systèmes cholinergique et GABAergique^5,6 et peut entraîner des modifications de l’activité neuronale³.

Au cours des dernières décennies, deux méthodes principales d’administration locale de médicaments ont été développées et perfectionnées : l’ionophorèse et l’injection sous pression. Dans les deux méthodes, les médicaments sont administrés à l’aide de micropipettes en verre ou en acier. Avec l’ionophorèse, un courant électrique régule la libération du médicament⁷. De plus, il existe une contribution significative de l’électro-osmose à la quantité totale de molécules éjectées⁸, en corrélation avec le diamètre de la pointe⁹ de la micropipette ainsi qu’avec la concentration⁸ de la substance utilisée. L’ionophorèse est un outil puissant pour manipuler rapidement et précisément de petits volumes de tissu nerveux. Pour les injections iontophorétiques, on utilise généralement 10 micropipettes à barils^multiples, l’une faisant office d’appareil d’enregistrement tandis que les autres positions servent de pipettes de refoulement. Une limite de cette méthode est que seules des molécules chargées peuvent être utilisées, ce qui limite considérablement la sélection des médicaments.

L’injection sous pression utilise soit la compression d’air, soit la pression mécanique pour éjecter une substance d’une micropipette. En utilisant cette méthode, n’importe quelle substance soluble, chargée ou non, peut être utilisée, y compris de grosses molécules. La méthode d’injection sous pression a été décrite pour la première fois par Reyniers en 1933 et affinée dans les années 1950 (voir Lalley¹¹ pour une revue). Dans les années 1980, la méthode a été affinée pour permettre l’administration de quantités de l’ordre du nanolitre (principalement de la lidocaïne¹²) à une zone cérébrale définie¹³ tout en effectuant simultanément un enregistrement sur cellule unique. Le volume éjecté était généralement surveillé en observant le mouvement d’un marqueur, tel que le ménisque dans la partie supérieure de la pipette¹³. L’injection sous pression a été utilisée pour la première fois dans les années 1990 chez des animaux éveillés, à la fois extracellulaires¹⁴ et intracellulaires^15,16. Sur la base de l’expertise cumulée acquise dans ces études, il est maintenant possible d’enregistrer de manière fiable différentes structures cérébrales en combinaison avec des manipulations pharmacologiques (voir¹⁷ pour une comparaison des systèmes d’injection de pression récents).

Un problème persistant pour les deux méthodes d’administration de médicaments est la difficulté de déterminer le volume précis injecté. Il s’agit d’un défi encore plus grand pour les expériences avec des singes rhésus éveillés et comportementaux où l’animal effectue la tâche expérimentale dans une pièce séparée. Cela peut être atténué par l’utilisation d’un système contrôlé par logiciel au lieu de s’appuyer sur un marqueur visuel pour surveiller en permanence une injection.

Le système décrit ici est une extension d’un système d’enregistrement électrophysiologique bien établi (Mini Matrix System) et combine une pipette d’injection avec plusieurs électrodes d’enregistrement orientées en parallèle à des distances définies dans un arrangement personnalisable. La manipulation pharmacologique du tissu près de l’électrode d’enregistrement est possible en utilisant seulement une petite quantité de substance, assurant une récupération rapide et permettant plusieurs blocs d’injection et de contrôle/récupération dans la fenêtre de temps limitée offerte par la tâche comportementale de l’animal.

Protocole

soins aux animaux et toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux lois allemandes régissant les soins aux animaux et approuvés par le gouvernement du district de Braunschweig, Basse-Saxe, Allemagne.

Remarque: Comme l'expérience est réalisée in vivo, il est crucial de maintenir les normes d'hygiène les plus élevées possibles. Chaque fois que possible, travailler dans des conditions stériles.

1. Préparation du système d'injection / Enregistrement

1. Stériliser le tube qui relie la micropipette avec la seringue. Utilisez la longueur la plus courte possible tube dans le dispositif expérimental entre la pompe d'injection et le système d'enregistrement électrophysiologique.
2. Nettoyer les tubes de guidage du système d'enregistrement en utilisant des fils de nettoyage. Trempez-les dans l'huile de silicone stérile et les nourrir à travers les tubes de guidage individuels plusieurs fois.
3. Insérer la micropipette en verre de quartz dans un tube de guidage du système d'enregistrement. Voir la figure 1A.
4. Après la fixation de la micropipette dansle système d'enregistrement, fixer le tube stérile à la broche métallique de la micropipette. Prend soin de toi; bien que la micropipette est fixé dans le système, il peut facilement se briser lors de la fixation du tube. Utilisez deux pinces stériles pour appliquer une pression égale sur la broche et le tube.
5. Utilisez la colle super liquide pour sceller la jonction entre le tube et micropipette. Attendre au moins 3 heures pour la colle de durcir avant de remplir le micropipette avec le liquide.
6. Insérer microélectrodes (par exemple, le verre de quartz tungstène isolé du platine) dans les autres positions du système d'enregistrement avant ou après l' insertion de la micropipette.

2. Préparation de la substance

1. Stériliser 1,5 ml microtubes pour le stockage ultérieur de solutions d'injection à l'aide d'un autoclave ou d'une autre procédure fiable.
2. Peser le chlorhydrate de scopolamine substance correspondante pour préparer 5 ml d'une solution 0,1 molaire. Dissoudre dans une solution saline stérile (0,9% NaCl).
3. Dans des conditions stériles ina sorbonne, on filtre la solution en utilisant un filtre à seringue ayant un diamètre suffisamment larges pores, par exemple de 0,2 um.
4. Sous la hotte, aliquoter la solution dans des volumes suffisants pour une expérience unique, par exemple, pour la scopolamine, 500 ul dans le tube de 1,5 ml stérile. Utiliser des tubes sombres pour protéger la substance de la lumière; alternativement, envelopper les tubes dans une feuille d'aluminium. Pour scopolamine, conserver la solution pour un maximum de 14 jours à 4 ° C.

3. Préparation quotidienne du système d'injection / Enregistrement

Remarque: lorsque monté dans le système d'enregistrement, les électrodes et les micropipettes sont stockés dans une solution enzymatique (Tergazyme, solution à 1% avec de l'eau déminéralisée) entre les enregistrements. Les étapes suivantes doivent être effectuées avant chaque enregistrement.

1. Recueillir un tube de la substance à injecter. Lui permettre d'atteindre la température ambiante si elle est réfrigérée.
2. Enlever le système d'injection / d'enregistrement à partir de la solution d'enzyme et de rinçage des électrodeset micropipette avec de l'eau déminéralisée pour nettoyer complètement la solution enzymatique.
3. Retirez le couvercle avant du système d'enregistrement afin de vérifier visuellement l'étanchéité entre micropipette et le tube.
4. Appliquer l' huile de silicone stérile à l'écart de tube de guidage (voir la figure 1A) et des conseils d'électrodes et micropipette afin de lubrifier le système de mouvement en douceur.
5. Vérifiez conseils des électrodes et micropipette à l'aide d'un microscope pour assurer qu'ils sont intacts. Aligner les électrodes et la micropipette sous le microscope afin qu'ils prolongent hors des tubes de guidage avec la même longueur. Conduisez dans les tubes de guidage, l'arrêt dès qu'ils ne sont plus visibles. Elle est définie comme position zéro de l'électrode. Régler la profondeur des électrodes et micropipette à 0 dans le logiciel.
6. Remplir une seringue stérile avec une solution saline stérile et insérer l'aiguille dans le tube, en prenant soin de ne pas percer la paroi du tube. Conduisez la micropipette sur le tube de guidage pour Visule contrôle al de l'écoulement de la substance.
7. Affleurant au moins 2 ml de solution saline stérile à travers le tube et micropipette pour assurer l'air ne reste dans la seringue ou dans le tube. Ne pas appliquer trop de pression sur le piston de la seringue. Veiller à la jonction entre le tube et micropipette est scellé. Si une fuite est visible, re-coller la jonction (voir l'étape 1.5) et de reporter l'enregistrement.
8. Remplir une nouvelle seringue stérile avec la solution à injecter et à échanger avec le corps de la seringue de sérum physiologique, à savoir maintenir l'aiguille de la seringue rempli de solution saline dans le tube. Assurez-vous que l'air est transféré dans le système. Ceci se fait en remplissant le moyeu d'aiguille avec une solution saline après avoir retiré le tube rempli de sérum physiologique.
9. Rincer le système avec 250 pi de la solution à injecter, afin d'éliminer complètement la solution saline du tube.
10. Utilisation du logiciel de commande du moteur, retirer les électrodes et micropipette dans le guidetubesto une profondeur d'au moins -500 um.
11. Lower l'anneau de tube de guidage (figure 1A) à la partie inférieure des tubes de guidage pour maintenir leur position relative fixe.
12. Nettoyer la base du système avec de l'éthanol, en particulier là où il touchera la chambre d'enregistrement du singe.
13. Fermez le système d'enregistrement en remplaçant le capot avant et serrer les vis.

4. Validation du système d'injection

Note: Bien que la société étalonne le système, il est recommandé de valider les volumes éjectés avec les matériaux utilisés dans le montage expérimental (tubes, seringues, etc.).

1. Préparer le système tel que décrit dans l'étape 3, en gardant les électrodes et les micro-pipette étendu hors des tubes de guidage. Une profondeur d'au moins 7,000 um est recommandé d'éviter la perte de volume de mesure due à l'adhérence sur la surface extérieure de la micropipette et des électrodes.
2. Placer le système d'enregistrement dans la position qu'elle sera utilisée au cours de l'expérimentation et la mise Syringe dans la pompe de micro-injection. Fixer la seringue en place à l' aide de la bande de caoutchouc et poignée réglable (voir la figure 1A). Faites glisser la partie mobile de la pompe jusqu'à ce qu'il soit bien en place derrière le piston de la seringue.
3. Utilisation de l'unité de moteur commandé par logiciel, éjecter un volume assez grand pour être mesuré avec précision, par exemple., 1000 nl. Il est préférable d'utiliser une seule étape pour éjecter le volume total afin d'éviter les effets de capillarité le long de la surface de la micropipette. Très faibles vitesses (1 nl / s) peuvent également conduire à cet effet au cours de la procédure de validation.
4. Recueillir le volume total dans un récipient placé sous la micropipette, ou recueillir soigneusement la goutte éjectée directement à partir de la pointe de la micropipette. Estimer le volume éjecté à l'aide d'une pipette ou par pesée avec une balance de précision.
5. Répétez la procédure plusieurs fois pour confirmer les mesures.

5. Les enregistrements aigus

1. Réglez la position xydu système d'enregistrement. Ceci définit le point à partir duquel les tubes de guidage atteignent la dure-mère à l'intérieur de la chambre d'enregistrement implantés de manière chronique. Assurez-vous que les tubes de guidage sont rétractés complètement (tube de guidage z position 0).
2. Apportez le système d'enregistrement en position et placer la seringue dans la pompe de microinjection. Fixer la seringue en place à l' aide de la bande de caoutchouc et poignée réglable (voir la figure 1A). Faites glisser la partie mobile de la pompe jusqu'à ce qu'il soit bien en place derrière le piston de la seringue. Si une goutte de substance est visible à l'extrémité des tubes de guidage, retirez avec précaution à l'aide d'un coton-tige stérile.
3. Préparer l'animal pour l' enregistrement selon la procédure du laboratoire (voir ¹⁸ par exemple des lignes directrices).
4. Monter en toute sécurité, le système d'enregistrement sur la chambre d'enregistrement du singe.
5. Abaissez lentement les tubes de guidage manuellement dans la chambre d'enregistrement jusqu'à ce que la dure soit atteinte, puis conduire les électrodes en utilisant le co moteurlogiciel ntrol.
6. Comme il est impossible de mesurer l'impédance de la micropipette, d'abord conduire avec des électrodes et vérifier leurs impédances régulièrement à des profondeurs différentes. Après une pénétration de la dure-mère est réalisée avec succès, sans endommager les électrodes, faire avancer la micropipette.
7. Conduisez les électrodes et la micropipette à la profondeur de l'électrode cible à laquelle il est prévu la zone du cerveau d'intérêt à trouver. Avancer lentement l'électrode jusqu'à ce qu'il soit assez proche pour enregistrer l'activité d'une seule unité, comme en témoigne un bon rapport signal-bruit dans le signal enregistré. Fait important, la position de l'électrode d'enregistrement et la micropipette à la même profondeur afin d'assurer une distance minimale entre l'électrode et micropipette.
   1. Si possible, gardez les électrodes et micropipette à cette profondeur pour la totalité de l'enregistrement. Toutefois, si la seule façon de maintenir la qualité de la cellule enregistrée du signal est de déplacer les électrodes, puis conduire les électrodes et la micropipetteen même temps pour maintenir la distance entre eux.

6. Attention Spatial Task

1. Dans une série d'essais, présentent deux motifs de points qui se déplacent sur ​​l'écran, l' un positionné dans le champ récepteur du neurone enregistré et l'autre à l' extérieur de celui - ci, avec un point de fixation présenté au centre que l'animal doit foveate tout au long de chaque essai ^{19, 20.}
   Remarque: Le singe est formé pour répondre à un changement de direction dans le motif de points indicé (l'événement cible) tout en ignorant tout changement de direction dans l'autre motif de points, et est récompensé par une goutte de liquide pour chaque réussite d'un essai ^{19, 20.} Comme condition de contrôle sensoriel, le singe doit signaler un changement de luminance du point de fixation , tout en ignorant les deux motifs de points mobiles (voir la figure 2 pour une description plus détaillée de la tâche).

7. Manipulation pharmacologique pendant l'enregistrement

Note: Bien que le singe exécute la tâche, injecter la substance d'une manière par bloc. Trois blocs consécutifs sont définis: le contrôle, qui agit comme une base de référence; l'injection, au cours de laquelle une substance est éjectée; et la récupération, au cours de laquelle les cellules ciblées par le retour à l'état initial d'injection.

1. Au cours d' un bloc d'injection, injecter une quantité prédéfinie de la substance à intervalles réguliers , par exemple., 2 nl chaque minute à un taux de 2 nl / s. Pour cet exemple, utiliser le chlorhydrate de scopolamine. Le procédé d'injection est contrôlé en utilisant un logiciel qui fournit diverses options. Par exemple, utiliser la fonction de l'étape pour définir le volume d'injection, et appuyez sur le bouton d'injection à chaque minute selon l'horloge du logiciel d'enregistrement.
   Remarque: La durée exacte du bloc d'injection est la substance et l' expérimentation dépend, par exemple, pour une utilisation de scopolamine 2 injections nl chaque minute pendant 10 minutes (20 nl au total).. Il est préférable de ne pas faire avancer les électrodes et duri micropipetteng du bloc d'injection.
2. Noter le temps et l'essai au cours de laquelle la substance est injectée, la profondeur des électrodes et des micro-pipette, ainsi que la quantité de matière éjectée.
3. Suivre le bloc d'injection avec un bloc de récupération, dans lequel aucune substance est injectée. La durée du bloc de récupération est substance spécifique et doit être défini dans la pré-tests. Surveiller et maintenir la qualité des unités individuelles sélectionnées d'enregistrement jusqu'à la fin du bloc de récupération.
4. Répétez les trois blocs pour autant que la qualité de l'enregistrement et de la motivation du singe permettent.

8. Procédures post-enregistrement

1. Une fois l'enregistrement des données, rétracter les électrodes et les micro-pipette dans des tubes de guidage, puis rétracter manuellement les tubes de guidage. Enlever le système d'enregistrement à partir de la chambre d'enregistrement du singe. Libérer la seringue de la pompe d'injection et le transfert du système dans la zone de préparation pour le nettoyage.
2. Manipuler l'animal(y compris le nettoyage de la chambre d'enregistrement ¹⁸⁾ selon les procédures standard de laboratoire et de le renvoyer à l'usine de logement.
3. Rincer à l'extérieur des tubes de guidage avec du peroxyde d'hydrogène (3%), puis avec de l'eau déminéralisée. électrodes d'entraînement et micropipette sur les tubes de guidage, rincer avec du peroxyde d'hydrogène et de l'eau puis déminéralisée.
4. Échanger le corps de la seringue avec un cylindre d'une seringue remplie d'une solution saline stérile, en maintenant l'aiguille dans le tube. Rincer le tube et la micropipette avec 1-2 ml d'une solution saline. Après le rinçage, retirer le canon et le remplir avec de l'air. Réinsérer le canon dans l'aiguille et sécher le tube et la micropipette de l'intérieur en poussant doucement l'air à travers.
5. Stocker les tubes de guidage, des électrodes étendues et micropipette immergées dans la solution enzymatique pour éviter le séchage, ainsi que pour assurer la décomposition des matières organiques.

Résultats

La figure 2 représente la tâche de l' attention spatiale singe réalisée alors que le processus d'injection a été réalisée. Le singe a été formé pour assister soit au stimulus situé dans le champ récepteur du neurone enregistré (assister à-in), le stimulus situé à l'extérieur du champ récepteur (assister-out) ou le point de fixation (assister à-fix). Ces conditions permettent une comparaison de l'activité neuronale dans différents états attentionnels.

La figure 3 montre une péri-stimulus histogramme temporel d'un échantillon neurone dans une expérience utilisant la scopolamine, un antagoniste des récepteurs muscariniques. L'intrigue démontre la suppression de réponse lors de l'injection de scopolamine par rapport à aucune injection, lorsqu'un motif se déplaçant dans la direction préférée de la cellule est présentée à l'intérieur champ récepteur du neurone et est assisté par l'animal. Les deux premiers pics représentent le neurone9; s réponse au bilan et décalage de la queue spatiale, qui apparaît à l'intérieur de son champ récepteur. Elle est suivie par la réponse à la configuration mobile qui apparaît sur l'écran de 500 ms après cue apparition. La zone grisée représente la période d'analyse utilisée pour calculer le taux de tir moyenne pour chaque essai. La zone verte met en évidence l'influence suppressive de l'injection de scopolamine sur le taux de tir de la cellule. La région vert foncé montre la suppression dans la période d'analyse.

La figure 4A montre l'effet de la scopolamine sur la vitesse de combustion moyenne de l'échantillon des neurones dans chacune des trois conditions attentionnels. Le taux du neurone de tir pour les deux conditions de l'attention spatiale (d'attention à l'intérieur ou à l'extérieur du champ récepteur du neurone d'enregistrement) ainsi que pour la condition sensorielle (attention au point de fixation) a chuté peu après la première injection du bloc d'injection (grisé sonta) et pendant le bloc de récupération augmenté après un retard au même niveau qu'avant l'injection.

La figure 4B représente une commande d' enregistrement à partir d' un second neurone d'échantillon dans laquelle la solution saline (0,9% NaCl) a été injecté, en utilisant le même protocole que pour l'injection de scopolamine. Lors de l'injection bloque aucun changement dans la cadence de tir du neurone a été observée par rapport au bloc de contrôle.

Figure 1. Mise en place utilisée pour la manipulation pharmacologique pendant l' enregistrement. (A) représente la pompe de micro - injection et le système d'enregistrement électrophysiologique équipé d'électrodes et micropipette. L'écart de tube de guidage, dans laquelle l'huile de silicone est inséré pour lubrifier les électrodes et micropipette, est montrée agrandie. (B) Affiche un exemple micropipette (ci - dessus)et une électrode d'enregistrement (ci-dessous). A titre de comparaison de la taille, un centime d'euro (diamètre: 16 mm). Est placé sous S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Conception de la tâche de guider l' attention spatiale. Les singes ont été formés pour détecter un changement de direction du mouvement dans le motif de points indicé. La queue a été soit placé dans le champ récepteur des neurones (assister à-in), comme le montre la figure, ou à l'extérieur de celui-ci (assister à-out). En tant que contrôle sensoriel, le singe a été formé pour détecter un changement de luminance du point de fixation (assister à -fix). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Influence de l' antagoniste scopolamine sur la cadence de tir. L'histogramme en temps péri-stimulus pour un échantillon neurone est montré pour la fréquentent en condition (attention à l' intérieur du champ récepteur du neurone enregistré) pendant le bloc d'injection et pendant le bloc de contrôle. L'axe des x représente le temps en millisecondes après cue apparition et l'axe des ordonnées représente le taux d'allumage en épis / sec. La zone grise représente la période d'analyse (300-800 ms après le début du stimulus) utilisé pour calculer le taux de tir d'essai d'utilisation moyenne. La zone ombrée verte indique la suppression du taux dans les deux conditions de tir. La couleur vert foncé met en évidence la suppression dans le délai d'analyse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4. Effet de la scopolamine et du sérum physiologique à la cadence de tir. Injection de scopolamine (A) Antagoniste. Le taux d' allumage procès-moyenne de la cellule de l' échantillon de la figure 3 au cours de l'expérience est montré pour le stimulus préféré pour les trois conditions attentionnelles. L'axe des x représente l'heure de début du procès en quelques minutes et l'axe des ordonnées représente la cadence de tir de l'unité en épis par secondes. Symboles ( assister en, assister à-fix, assister à-out) représentent la cadence de tir du neurone dans la période d'analyse dans chaque essai réalisé avec succès, et les lignes horizontales (ligne continue: assister en, ligne pointillée: assister-fix, ligne en pointillés: assister-out) montrer cadence de tir moyenne pour la trois bl expérimental différenttroupeaux (contrôle, injection, récupération). La zone grisée représente le bloc d'injection, en commençant par la première injection et se terminant 1 min après la dernière injection. Lors de l'injection bloc 2 nL de 0,1 scopolamine molaire ont été injectés chaque minute avec une vitesse d'injection de 2 nl / s. (B) injection de solution saline. Le taux d'allumage d'une cellule de l'échantillon au cours de l'expérience de contrôle est indiqué pour le stimulus préféré pour les trois conditions attentionnelles. Gris zone ombrée visualise le bloc d'injection de solution saline. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ici, nous avons illustré en détail comment effectuer des injections fiables et précises et les enregistrements mono-cellulaires de haute qualité avec un système d'injection de pression "off-the-shelf". Bien que cette méthode d'administration du médicament a déjà été utilisé dans le comportement des singes (revue dans ^17), le système présenté ici présente des avantages, examinés ci - dessous.

Comme cela est illustré sur la figure 4A, le système décrit ici peut fournir une mesure stable de l' activité du neurone unique avec ou sans injections pharmacologiques dans le voisinage immédiat du site d'enregistrement. Comme le montre la figure 4B, l'injection d'une substance de contrôle, une solution saline, n'a pas conduit à un changement de cadence de tir. Ce contrôle démontre que le procédé d'injection elle-même n'a aucune influence mesurable sur les propriétés de cuisson des neurones enregistrés.

La configuration spatiale de neurones, l'électrode d'enregistrement et micropipette est cruciale importance dans ces expériences. Bien qu'une mesure précise de leur position relative dans le tissu lors de l'enregistrement est pas possible, nous pouvons considérer et de contrôle pour les sources possibles de variance. Tout d'abord, lors de l'injection de volume il existe un risque que le neurone d'intérêt peut être déplacé à une distance de l'électrode d'enregistrement, ce qui affecte la stabilité des signaux enregistrés. Pour cette raison, il est prudent de comparer le taux d'allumage avant et après le bloc d'injection afin de vérifier la stabilité du signal. D' autre part, la configuration du tube de guidage du système d'enregistrement définit la distance entre les électrodes et micropipette (par ex., 305 um dans le système 3-canal concentrique utilisé dans cette expérience). Le système offre un contrôle de position précise pour la profondeur des électrodes et micropipette dans le tissu, la distance entre eux peut être minimisée en calibrant soigneusement la profondeur relative avant l'enregistrement (étape 3.5), et de les garder à une profondeur commune pendant les enregistrements.

ent "> limitations potentielles
En plus du contrôle interne de la qualité par le fabricant, le système doit être validée dans des conditions de laboratoire, comme les différentes marques de tubes, seringues, etc., peuvent être utilisés et pourraient entraîner des différences de volumes éjectés. Bien que le système puisse être utilisé pour injecter des volumes très faibles, comme dans l'expérience présentée ici, ceux-ci sont inférieurs au volume minimum pouvant être validé en raison des limites pratiques de mesure dans un environnement de laboratoire normal. Cependant, de plus grands volumes d'injection peuvent être utilisées pour déduire la relation entre le volume défini par logiciel et que le volume éjecté par le matériel. Si des tubes transparents sont utilisés, un contrôle visuel supplémentaire du processus d'injection est possible en mesurant le déplacement d'un repère visuel.

L'insertion de la micro-pipette dans le système est plus exigeant que l'insertion de l'électrode, que le diamètre de la micropipette est légèrement plus grand et le matériau est plus fragile. En outre,joignant le tube à la broche de la micropipette est difficile car il implique un risque élevé de rupture de la partie supérieure de la micropipette. Cependant, la durée de vie d'un micropipette chargé avec succès est de plusieurs mois, même avec une utilisation quotidienne.

Dans la pratique, on n'a pas encore rencontré un blocage dans le système d'injection pendant le post-enregistrement nettoyage du système. Néanmoins, aucun contrôle "en ligne" est possible, et il y a un risque qu'un blocage physique (tel que le tissu à la pointe de micropipette) pourrait empêcher l'injection de substance. Il pourrait donc être souhaitable d'analyser les données de façon conservatrice, comme incluant uniquement les cellules dans une analyse plus approfondie qui montrent des changements significatifs dans la cuisson des taux entre contrôle et d'injection des blocs de l'expérience.

En dépit de leur petit diamètre, microélectrodes et pipettes vont déplacer les tissus du cerveau et peuvent causer des dommages aux tissus locaux. Ceci peut être minimisé en positionnant manuellement la pointe de thtubes de guidage e juste au-dessus de la dure-mère. Les électrodes pénètrent alors la dure-mère et leur intégrité est déduite en mesurant leurs impédances en ligne. Par la suite, la micropipette est insérée. Lors de l'utilisation de cette approche, l'élimination régulière du tissu au-dessus de la dure-mère est recommandé de réduire davantage le risque d'électrode ou d'une pipette de rupture.

Comparaison des méthodes alternatives
Le système utilisé ici présente des avantages évidents par rapport à d'autres systèmes d'injection sous pression. Un avantage fort est le diamètre de la micropipette (environ 100 pm), ce qui est la moitié de la taille d'autres sondes disponibles ¹⁷ et minimise ainsi les dommages aux tissus nerveux. Contrairement aux modèles précédents, le système actuel emploie spatialement séparé électrode d'enregistrement et de micropipette. Bien que d'autres systèmes offrent une plus petite distance entre l'électrode et la pipette, le système décrit ici permet de modifier la profondeur indépendantes des électrodes et une pipette, ainsi permiPrép distances relatives variables au sein d'une session d'enregistrement. Fait important, aucun compromis quant à la qualité de l'enregistrement doit être effectué, selon le système d'injection est une extension d'un dispositif d'enregistrement établi. Bien qu'un seul micropipette et donc une substance est utilisée dans ce protocole, il est possible d'injecter plusieurs substances au sein d'un procédé expérimental. Pour ce faire, plusieurs micropipettes peuvent être vissés dans les tubes de guidage séparés et reliés à des seringues montées dans les pompes d'injection individuelles. Enfin, la commande du système est aisée, car un seul programme d'ordinateur est nécessaire pour faire avancer les électrodes et micropipette, et d'effectuer l'injection sous pression pendant l'expérience.

En comparant l'injection sous pression à iontophorèse, il y a des avantages et des inconvénients. Par exemple, l'injection sous pression nécessite un plus grand volume à introduire dans le tissu que l'iontophorèse, augmentant ainsi le risque de déplacement des neurones. Le proto courantcol utilisé volumes dans la gamme nL, et nous avons rarement connu des changements notables dans la qualité du signal d'une cellule enregistrée. Le système permet également de plus grands volumes à injecter, ce qui est potentiellement utile pour les manipulations comportementales, mais pourrait avoir une incidence stabilité de l'enregistrement neuronal. Un net avantage de l'injection de pression sur l'ionophorèse est la plus grande variété de substances utilisables comme il n'y a pas d'obligation d'utiliser des substances chargées. Cependant, les valeurs de pH doivent être vérifiés et comparés entre les substances expérimentales et de contrôle (par exemple., Une solution saline).

La question peut se demander pourquoi utiliser la méthode établie de longue date de l'injection au lieu de nouvelles techniques de pression tels que optogénétique pour manipuler l'activité neuronale. Bien que bien établie chez les rongeurs, optogénétique est pas encore établie de manière fiable chez les singes rhésus. En particulier, elle ne permet pas encore la manipulation locale de cellules sélectives pour un type de neurotransmetteur particulier. À plus long terme, nous voyonsun grand potentiel pour la combinaison des avantages des manipulations pharmacologiques avec les avantages des manipulations optogentic dans l'élucidation de la base neurale de fonctions cognitives.

Ici, nous avons montré que l'injection sous pression peut être utilisé pour manipuler le plan pharmacologique d'une zone limitée localement dans le cerveau d'éveil, comportant des singes rhésus. Nous espérons que cette méthode inspire d'autres scientifiques pour enquêter sur les contributions neuromodulateurs à la dynamique de l'activité neuronale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(-)-Chlorhydrate de scopolamine	Sigma-Aldrich	55-16-3	Mr 339,81 g/mol
NaCl 0,9 %  ;	B. Braun Melsungen AG	3079870	5ml  ;
Terg-a-zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	enzyme detergen
Peroxyde d’hydrogène	Roth		Utilisé en solution à 3 % avec de l’eau déminéralisée
Éthanol	Chemie-Vertieb Hannover	104642	70 %
Eau
Injekt 40 Duo	B. Braun Melsungen AG	9166432V	Seringue et aiguille  ;
Eppendorf Safe-Lock Tubes à centrifuger, ambre	Eppendorf	0030 120.191	1,5ml  ;
Micropipette en verre quarz	Thomas Recording Électrode d’enregistrement
	Thomas Recording		Électrode en fibre de quartz/platine-tungstène ; valeur d’impédance 1-2 M&Omega ;   ; et 0,3-0,5 M&Omega ;
PharmedBPT-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics  ;	3702003	; Taille : 0,25 x 2,05 mm (Ld : 0,9mm)
Loctite 401	Henkel	233641	Superglue
Huile de silicone	Thomas Recording	M-1000
Minisart RC15	Sartorius	17761----------R	Filtre à seringue
Système de micro-injection multicanal	Thomas Recording		manipulateur à microélectrodes multicanaux " Système Eckhorn" équipé de microélectrodes et de micropipettes et d’une pompe de micro-injection multicanaux de précision
	Logiciel de laboratoire interne		McLab

déminéralisée personnalisé pour contrôler la présentation du stimulus