A Quantitative Glycomics et protéomique Stratégie Purification Combined

Résumé

Un protocole à haut débit a été développé pour la purification combinée de la protéomique et de la glycomique et la quantification LC-MS/MS dans le plasma. L’analyse par désamidation des motifs de glycosylation liés à l’azote était spécifique aux sites déglycosylés. Une quantification précise des N-glycanes a été obtenue en couplant la séparation des N-glycanes assistée par filtre à la normalisation de l’individualité lors du marquage avec la stratégie de marquage avec des marqueurs d’hydrazide de glycane.

Résumé

Il y a un désir croissant dans les sciences biologiques et cliniques d’intégrer et de corréler plusieurs classes de biomolécules pour démêler la biologie, définir les voies, améliorer le traitement, comprendre la maladie et aider à la découverte de biomarqueurs. La glycosylation liée à l’azote est l’une des modifications post-traductionnelles les plus importantes et les plus robustes des protéines et régule les fonctions cellulaires critiques telles que la signalisation, l’adhésion et la fonction enzymatique. Les techniques analytiques de purification et d’analyse des N-glycanes sont restées relativement statiques au cours de la dernière décennie. Bien que précis et efficaces, ils nécessitent généralement une expertise et des ressources importantes. Bien que certains systèmes de purification à haut débit aient été développés, ils n’ont pas encore été largement adoptés et reposent souvent sur l’enrichissement en glycopeptides. Une méthode prometteuse, développée par Thomas-Oates et al., la séparation des N-glycanes assistée par filtre (FANGS), a été démontrée qualitativement sur des tissus. Ici, nous avons adapté FANGS au plasma et l’avons couplé à la normalisation de l’individualité lors du marquage avec des marqueurs d’hydrazide de glycane afin d’obtenir une quantification relative précise par chromatographie liquide, spectrométrie de masse et ionisation par électronébulisation améliorée. De plus, nous avons conçu de nouvelles fonctionnalités pour le protocole en réalisant une analyse en tandem, en protéomique et en site de glycosylation sur du plasma de poule. Nous avons montré que les N-glycanes purifiés sur filtre et dérivés par des marqueurs d’hydrazide hydrophobes étaient comparables en termes d’abondance et de classe à ceux par extraction en phase solide (SPE) ; Ce dernier est considéré comme une référence dans le domaine. Il est important de noter que la variabilité entre les deux protocoles n’était pas statistiquement différente. Les données protéomiques recueillies en ligne avec les données glycomiques avaient la même profondeur qu’une digestion standard à la trypsine. La désamidation peptidique est minimisée dans le protocole, limitant la désamidation non spécifique détectée aux motifs de glycosylation. Cela a permis une analyse directe du site de glycosylation, bien que le protocole puisse également prendre en charge le marquage du site ¹⁸O. Dans l’ensemble, nous avons fait la démonstration d’un nouveau protocole en ligne, à haut débit, non biaisé et basé sur un filtre pour l’analyse quantitative de la glycomique et de la protéomique.

Introduction

Dans le domaine de la protéomique, filtre aidé la préparation de l' échantillon (FASP) a été largement adopté pour sa capacité à réduire la quantité de matériau de départ, diminuer l' échantillon des artefacts de préparation, et de maximiser le débit d' échantillons ^1. Cependant, une telle méthode n'a pas encore d'émerger et de gagner du terrain pour le domaine de la glycomique. Développement de haut débit, les flux quantitatifs sont nécessaires en raison du rôle essentiel de la glycosylation dans la défense biologique et sa modulation par le cancer ou les maladies ^2,3. Chez les mammifères, N -glycans sont composées de motifs répétitifs saccharides (hexoses (Hex), hexosamines (HexNAc), acides sialique (NeuAc), et fucoses (Fuc)), qui décorent une structure de noyau (Hex ₃ HexNAc ₂₎ ⁴ à liaison covalente asparagine. Bien que le glycospace est considérablement élevée lorsque les isomères sont comptés (> 10 ^12), il est tout à fait petite sur une base de la composition et les poids moléculaires varient généralement de 1,000-8,000 Da ^{5 <}/ Sup>. L'homogénéité de la composition de la classe et l'hydrophilie de glycanes posent des défis uniques pour la purification, la séparation et la spectrométrie de masse (MS) workflows ^6.

Traditionnellement, N -glycans sont digérées à partir des protéines ou des peptides par le peptide N -glycosidase F (PNGase F), puis enrichi par chromatographie d'affinité sur lectine ^7, capturé par des billes ⁸ hydrazide ou purifiés par extraction en phase solide (SPE) ^9,10. Bien que ces méthodes sont très efficaces, ils introduisent des étapes supplémentaires pour le dessalage et de limiter le nombre d'échantillons traités simultanément. Au cours de la dernière décennie, un certain nombre de plates-formes à haut débit pour glycomique ont été proposées. Kim et al. , Publié un procédé semi-automatisé à l' aide, d' une plaque SPE de 96 puits à commande par aspiration ^11. Alternativement, une méthode d' affinité-filtre (N -glyco-FASP) a été développé par le groupe Mann, qui a nécessité la dérivation initiale de la filtre avec un composite de lectines ^12. Enfin, le groupe Thomas-Oates a proposé une méthode semi-quantitative, le filtre Aided N Séparation -Glycan (FANGS), qui exploitait la taille étroite de composition du glycospace ^13. En se fondant sur ​​les filtres coupe-off poids moléculaire, de petits contaminants ont d' abord été lavés à perdre et ensuite les -glycans N ont été digérés et élues. protéines déglycosylée restent sur le filtre dans ce protocole et peuvent être soumis à FASP en ligne.

Identification et quantification des glycanes par ionisation électrospray (ESI) MS exige des séparations hors ligne pour (partielle) la résolution des isomères et dérivatisation pour la détection d'espèces à faible abondance. Marquer l'individualité quand la normalisation avec la stratégie de balises hydrazide glycanes confère une compatibilité avec la chromatographie liquide en phase inverse (RECH) ^14,15. Le 4-phénéthyl-benzohydrazide (P2PGN) tag hydrophobe médie l'hydrophilie des glycanes, enhFINANCEZ ionisation par, en moyenne, quatre fois ^16. Bien que d' autres techniques, telles que perméthylation ou ¹⁷ chimies de marquage amine réactive ^18, présentent des avantages similaires hydrazide dans la réaction, on fait réagir glycanes 1: 1 stoechiométriquement dans des conditions faciles. Quantification relative est obtenue par l' analyse en tandem d'échantillons dérivés avec native (NAT) ou ¹³ C ₆ étiquettes stabile isotopiques (SIL).

La méthode suivante évolue FANGS pour les applications de plasma et les couples à l'étiquette hydrophobe P2GPN pour la quantification relative précise. En outre, il a été conçu pour effectuer la protéomique shot-gun, désamidation profilage, et glycomique quantitatives sur une seule aliquote de l'échantillon, sans compromettre l'intégrité des analyses.

Protocole

1. Les protéines et glycoprotéines Dénaturation et Alkylation

1. Pour les préparations standard, charge 2,5 ul d'une / solution ul de 0,1 ug de glycoprotéine (par exemple Fetuin ou RNase B) sur une 30 kDa ou 10 kDa de poids moléculaire (MW) de coupure du filtre.
   1. Pour les échantillons de plasma biologiques, vérifier la concentration de protéine par un dosage ²⁰ (BCA) protéine acide de référence Bradford ¹⁹ ou bicinchoninique. On dilue le plasma, le cas échéant, avec mM de bicarbonate d'ammonium 100 (NH ₄ HCO ₃₎ dans _H2O (PNGase Digest tampon) à un pH de ~ 7 à contenir entre 10 à 100 mg / ml de protéine totale. Charge 2,5 pi de plasma (25 à 250 ug de protéine) sur un filtre.
      Remarque: Ce protocole a été testé sur le plasma à partir d'échantillons de sang prélevés en présence d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
2. Ajouter 2 ul de dithiothreitol 1 M de solution (TNT) à chaque échantillon dans le filtre.
3. Diluer l'échantillon avec 200 ul de tampon de digestion PNGase.
4. Boucher le tube d'échantillon de filtre et légèrement vortex, en faisant attention à ne pas perturber le filtre de son siège. Incuber l'échantillon à 56 ° C pendant 30 min pour dénaturer les protéines et glycoprotéines.
5. Pour alkyler des échantillons, ajouter 50 pi de 1 M iodoacétamide, pour obtenir une concentration finale de ~ 200 mM et on incube à 37 ° C pendant 60 min.
   NOTE: Si l'analyse protéomique est pas souhaitée, l'étape 1.5 peut être ignorée.
6. Concentrer la glycoprotéine dénaturée sur le filtre par centrifugation des échantillons à 14000 xg pendant 40 min. Jeter circuler à travers.

2. N Glycan lié en digestion enzymatique

1. Laver l'échantillon avec 100 pi PNGase tampon de digestion. Concentrer la glycoprotéine sur le filtre à 14.000 xg pendant 20 minutes et jeter circuler à travers.
   1. Répéter l'étape de lavage et concentré deux fois, pour un total de trois fois, ce qui donne un concentré dans le volume mort de filtre (~ 5 pi). Jetez touss'écouler à travers.
   2. Jeter collection flacon une fois les lavages sont complets. Collecter toutes les éluants et lavages à venir dans une nouvelle collection flacon.
      NOTE: PNGase digest tampon dans H ₂ ¹⁸ O peut être utilisé lors de l'étape de digestion PNGase F pour stable marquage isotopique des sites asparagine de-glycosylée, qui deviennent chimiquement désamidée.
2. Ajouter 2 pl de libre glycérol-PNGase F (75.000 x unités / ml) pour filtrer après avoir transféré dans une collection flacon frais. Ajouter 98 pi de PNGase digérer tampon, ce qui porte le volume total à 100 pi, et doucement pipeter de haut en bas sur le filtre pour mélanger. digérer enzymatiquement les glycanes dans les conditions des étapes 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 OU.
   REMARQUE: Trois méthodes pour la déglycosylation de protéines peuvent être utilisées. Pour l'analyse uniquement des glycomique (pas de protéomique), la longue période d'incubation à l'étape 2.2.1 est recommandée. Pour glycomique et en protéomique, les étapes 2.2.2 et 2.2.3 produira des peptides de haute qualité avec un minimum de non-spdésamidation écifiques.
   1. Glycomics-seulement le protocole de digestion (de 18hr): Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 18 heures pour cliver enzymatiquement tous N -glycans.
   2. De Spike dans le protocole de digestion (SPI): Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 2 heures. En travaillant rapidement, prélever des échantillons et pic dans un 2 pl supplémentaire de libre glycérol-PNGase F (75.000 x unités / ml). vortex légèrement les échantillons pour 1-2 sec pour mélanger. Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 2 heures supplémentaires.
   3. Micro-ondes protocole de digestion (MD): Placer les échantillons dans un rack tube de microcentrifugation flottant. Des échantillons de flotteur dans un bécher de 1 L remplis de 1 L d'eau désionisée (DI). Placer le bêcher dans le centre d'un four à micro-ondes (950 W) avec une plaque tournante. Micro-ondes à puissance de 60% (570 W) pendant 5 min. Pour refroidir, prélever des échantillons et maintenir à température ambiante pendant 2 min. Ensuite, micro-ondes pendant 5 min de plus à 60% de puissance.
      REMARQUE: les paramètres d'alimentation à micro-ondes doivent être ajustées en fonction de la puissance de sortie maximale du micro-ondes.Puissance moyenne devrait être maintenue constante entre les modèles.

3. Elution de la N -glycans

1. Eluer glycanes par centrifugation de l'échantillon à 14.000 xg pendant 20 min à 20 ° C.
2. Ajouter 100 pi de PNGase digérer tampon au filtre et centrifuger à 14 000 xg pendant 20 min à 20 ° C. Collecter lavage contenant tout en restant N glycane lié en , dans la même collection flacon comme éluant. Répéter deux fois. Supprimer le filtre et le placer dans la nouvelle collection flacon.
3. Incuber échantillons glycanes dans le -80 ° C congélateur jusqu'à congélation (30-60 min). Sec jusqu'à la fin, à la température ambiante, dans un concentrateur à vide (4-6 heures).
   NOTE: N -glycans peuvent être conservés à -20 ° C pendant jusqu'à six mois avant dérivatisation.

4. Protein FASP Digestion

NOTE: Si la protéomique ou l'analyse du site de désamidation est pas souhaitée, l'article 4 du protocole peut être ignoré.

1. Rincer til filtre, contenant les peptides désamidée, avec 400 pi de tampon 8 M d'urée. Boucher le flacon de collecte et légèrement vortex pour mélanger. Concentrez-vous sur le filtre à 14.000 xg pendant 15 min. Jeter tout écoulement.
   1. Répétez l'étape 4.1 deux fois supplémentaires, pour un total de trois lavages de tampon d'urée.
2. Rincez le filtre, contenant les peptides désamidée, avec 400 ul de 2 M d' urée, mM CaCl tampon 10 ₂ (trypsine tampon de digestion). Boucher le flacon de collecte et légèrement vortex pour mélanger. Concentrez-vous sur le filtre à 14.000 xg pendant 15 min. Jeter tout écoulement.
   1. Répétez l'étape 4.1 deux fois supplémentaires, pour un total de trois trypsine digérer lavages de tampon.
   2. Jeter collection flacon une fois les lavages sont complets. Collecter toutes les éluants et lavages à venir dans une nouvelle collection flacon.
3. Ajouter 50 ul de trypsine porcine modifiée dans une 1:50 ou 1: 5 trypsine: protéine (p / p), respectivement, le rapport des expériences de découverte ou protéomiques quantitatives.Boucher le flacon de collecte et légèrement vortex pour mélanger.
4. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 2 heures. En travaillant rapidement, prélever des échantillons et pic dans un 50 pi supplémentaires de trypsine à 1:50 ou 1: taux de protéines: 5 trypsine. vortex légèrement les échantillons pour 1-2 sec pour mélanger. Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 2 heures supplémentaires.
5. Éluer les peptides par centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min.
6. Rincer les peptides restants du filtre avec de l'acide formique, 400 ul de 1% et 0,001% Zwittergent 3-16 (tampon de trempe). Éluer le filtre par centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min.
7. Quantifier la concentration du peptide dans les échantillons par Bradford ¹⁹ ou ²⁰ BCA.
8. Incuber les échantillons peptidiques dans le congélateur à -80 ° C jusqu'à congélation (30-60 min). Sec jusqu'à la fin, à la température ambiante, dans un concentrateur à vide (4-6 heures).
   NOTE: Dried peptides peuvent être conservés à -20 ° C pendant jusqu'à trois mois.
9. Resuspendre protéines tryptiques juste avant Liquid chromatographie-spectrométrie de masse (LC-MS) analyse 2% d' acétonitrile, 98% H ₂ O, et de l' acide formique à 0,1% (phase mobile A) à la concentration souhaitée. concentrations de peptides tryptiques de la gamme de plasma de 2,5 ul 100-300 ng / ul.

5. dérivatisation de N lié en glycanes avec Hydrophobes hydrazide Balises

1. Reconstituer lourds (SIL) ou de la lumière (NAT) des réactifs secs P2GPN dans 1 ml de MeOH 75:25: acide acétique (solution de dérivatisation), pour une concentration finale de 0,25 mg / ml. Réactifs vont prendre jusqu'à 10 min pour solubiliser complètement. Intensivement vortex pour garantir une solubilisation complète.
   Remarque: Dans le cas où ce protocole de dérivatisation est utilisé avec -glycans N standard, par rapport glycanes purifiés, le rapport molaire de P2GPN: glycane doit être d' environ (et non inférieure) à 17: 1.
2. Tag séchée N -glycans avec 200 ul (50 ug) de SIL ou NAT P2GPN réactif. Pipeter haut et bas pour resuspendre glycanes séchées. Vortex samples puis décélèrent échantillons pour ~ 5 sec dans une centrifugeuse de paillasse.
3. Réagir glycanes avec le réactif pendant 3 heures à 56 ° C.
4. Déplacer immédiatement glycanes de l'incubateur au concentrateur à vide. Sec à l'achèvement à 55 ° C (3-5 heures).
   REMARQUE: Cette étape désaltère la réaction de dérivatisation; l'échantillon doit être complètement sec pour éviter une réactivité croisée dans les étapes suivantes.
   NOTE: Les échantillons séchés, étiquetés peuvent être conservés à -20 ° C pendant jusqu'à six mois.
5. Remettre en suspension tagged N -glycans dans 25-50 ul de H ₂ O juste avant l'analyse LC-MS. Pipeter haut et en bas pour assurer N -glycans sont entièrement solubilisé.
   NOTE: Le volume pour la remise en suspension dépend de la concentration de départ de la glycoprotéine, qui peut être estimée à partir de la concentration en protéines de départ. Cependant, la gamme va varier selon le type d'échantillon et doit être optimisé individuellement.
6. Centrifuger les échantillons à 14000 xg pendant 5 min. Retirez le Supernatant, en faisant attention de ne pas laisser la pointe de la pipette toucher le fond du tube de centrifugation.
   Remarque: L'excès de tag peut ne pas être visible à l'oeil, mais sera réduite par centrifugation.
7. Combiner une paire d'échantillons de NAT et SIL, le cas échéant, pour la quantification relative, dans un rapport de 1: 1 pour une analyse en tandem.

6. Ultra-haute pression chromatographie en phase liquide et analyse de spectrométrie de masse

NOTE: Le LC et MS conditions décrites pour un Easy NLC-1000 et un haut champ Q Exactive, respectivement, ont été optimisés en interne pour l' analyse protéomique et pour l' analyse des glycanes ^21. Ces conditions peuvent être adaptées à d'autres systèmes LC pression ou nano- ultra-haute et d'autres spectromètres de masse à haute résolution de puissance, mais peuvent nécessiter de légères modifications. L'utilisation de la résolution élevée de spectrométrie de masse de puissance est nécessaire pour l' identification et l' analyse des glycanes de désamidation ^22,23.

REMARQUE: Les étapes 6.1-6.3 peuvent être skipped si une chromatographie en phase inverse appropriée ou une interaction hydrophile piège commercial et de la colonne sont utilisés.

1. Synthétiser une fritte à 100 uM ID capillaire selon l' une Meiring et al. , ²⁴ destiné à être utilisé en tant que piège.
2. Emballez le piège sous pression avec 2,6 uM, 100 Å, C ₁₈ matériau d'emballage et coupé à une longueur de 5 cm.
3. Emballez une colonne ID d'émetteur 75 uM sous pression avec 2,6 uM, 100 Å, C ₁₈ matériau d'emballage et coupé à une longueur de 30 cm.
4. Préparer deux méthodes LC-MS pour les différentes protéomique (6.4.1) et glycomique (6.4.2) workflows.
   Remarque: Les protéines et les échantillons glycanes peuvent être exécutés sur la même configuration piège / colonne dans un ordre quelconque.
   1. Pour l'analyse des protéines, injecter ~ 400 ng de protéine sur la colonne dans la phase mobile A (MPA). Exécuter l'échantillon à 300 Nl / min, selon le tableau 1, avec un pré-équilibrage de la colonne 1 pi (500 bars) et une colonne d' analyse 5 pi équilibration(500 bars). Ioniser protéines dans les conditions de MS fournies dans le tableau 2.
   2. Pour l'analyse des glycanes, injecter 5 pi de remise en suspension, P2GPN étiqueté NAT / SIL échantillons équimolaires sur la colonne. Exécuter l'échantillon à 300 Nl / min, selon le tableau 3, avec un pré-équilibrage de la colonne 2 pi (500 bars) et une analyse équilibration de la colonne 5 ul (500 bars). Ioniser glycanes dans les conditions prévues MS dans le tableau 4.

Temps	% MPA	% MPB
0	100	0
5	98	2
105	80	20
135	68	32
136	5	95
151	5	95
152	100	0
167	100	0

Tableau 1. conditions LC pour l' analyse protéomique. Une élution de gradient avec la phase mobile B (MPB, 98% d' acétonitrile, 2% de H ₂ O, l' acide formique à 0,1%) a été réalisée pour éluer peptides pour la protéomique shot-gun, dépendant des données d'acquisition , des expériences MS.

MS 1 Paramètres
Gamme de masse (Th)	375-1500
Résolution	120.000
AGC	1 × 10 6
Max Ionisation Temps	30
S-Lens FR Niveau	55
capillaire Temp (° C)	300
Vaporiser tension	1.75
MS 2 Paramètres
type d'acquisition	Top20
Résolution	15,000
AGC	1 × 10 5
Max Ionisation Temps	30
Ratio underfill	2%
Isolation Fenêtre (Th)	1.4
Exclusion Etat Charge	+1
Énergie de collision normalisée	27
Heure (s) d'exclusion	20

Tableau 2: conditions MS pour l' analyse protéomique Les paramètres pour ionisation par électrospray, MS ¹ acquisition et MS acquisition ² dans un instrument de Orbitrap utilisant dissociatio plus haute énergie.n (HCD) sont donnés.

Temps	% MPA	% MPB
0	95	5
1	70	30
41	60	40
46	37	63
47	dix	90
55	dix	90
56	95	5
66	95	5

Tableau 3:. Conditions LC pour l' analyse glycane Un gradient d' élution a été réalisée pour éluer hydrazide tagged N -glycans pour l' analyse MS.

MS 1 Paramètres
Gamme de masse (Th)	600-1900
Résolution	60.000
AGC	5 × 10 5
Max Ionisation Temps	64
S-Lens FR Niveau	65
Capillaire Temp (° C)	325
Vaporiser tension	1.75
MS 2 Paramètres
type d'acquisition	Top12
Résolution	15,000
AGC	5 × 10 4
Max Ionisation Temps	100
Ratio underfill	1%
Isolation Fenêtre (Th)	1.4
Première messe fixe
Stepped Normalized Collision Energy	10/20/30
Exclusion Temps (s)	15

125

Tableau 4: conditions MS pour hydrazide tagged N analyse -glycan Les paramètres pour ionisation électrospray, MS ¹ acquisition, et MS ² acquisition dans un instrument de Orbitrap utilisant une dissociation plus haute énergie (HCD) sont donnés..

7. protéomique et analyse désamidation

1. Identifier les protéines / peptides en utilisant des outils de recherche de bio-informatique standard.
   Remarque: Le protocole d'analyse qui suit a été conçu en utilisant les bases de données Swiss-Prot / TrEMBL en UniProtKB et la recherche via SEQUEST dans le logiciel Proteome Discoverer 1.4, cependant, le protocole peut être traduit directement à un moteur de recherche de protéines et la notation à l'aide d'un logiciel graphique. Toutes les commandes indiquées ci-dessous sont accessibles dans les interfaces logicielles dans les menus déroulants.
   1. Créer ou télécharger une base de données de séquences de protéines de l' organisme approprié à partir de données génomiques ou des bases de données protéomiques disponibles comme décrit par Apweiler et al. ²⁵
      Remarque: les bases de données protéomiques communs incluent Swiss-Prot, TrEMBL, et NCBI, mais peuvent être construits à partir de données internes ainsi.
2. Dans le logiciel, choisissez un moteur de recherche de base de données et sélectionner les paramètres en fonction de la qualité des données acquises et la rigueur de la recherche souhaitée, comme décrit par Perkins et al. pour MASCOT ²⁶ ou Eng et al. pour SEQUEST ^27.
   1. Pour des données de haute masse de précision, définissez les paramètres de la recherche dans le logiciel comme suit: max 2 manquée clivages, 5 ppm précurseur tolérance de masse, et 0,02 Da fragment tolérance de masse (pour la détection optimisée de désamidation précise ²²⁾ et inclure les modifications de peptides tryptiques suivants : «carbamidomethyl (C)" modification statique et "désamidation (N / Q)" et "oxidation (M) "des modifications dynamiques. En cas d' utilisation ¹⁸ O étiquetage de la digestion, comprennent" désamidation ¹⁸ O (1) "comme une modification dynamique supplémentaire.
   2. La recherche, à l'aide du moteur sélectionné, les données brutes de peptides contre la base de données de protéines (7.1.1).
      Remarque: les tolérances de masse doivent être adaptées à l'instrument utilisé et non arbitrairement faible.
      Remarque: La fonction de recherche est terminée automatiquement par le logiciel en utilisant des algorithmes spécifiques différents moteurs de recherche. L'algorithme de percolateur (MASCOT), SEQUEST, ou d'autres combinaisons d'algorithmes sont utilisés pour identifier des protéines à partir de peptides et de marquer la validité des résultats; plus d' informations sur les outils disponibles sont couverts dans une revue de Gonzalez-Galarza et al. ^28,29. Selon le logiciel, il faudra peut être choisi en fonction de la discrétion de l'utilisateur paramètres de recherche supplémentaires.
3. Exporter les peptides identifiés pour curation manuelle et furthanalyse de er.

Curate manuellement une liste de peptides contenant une désamidation identifiée sur la asparagine N motif de glycosylation lié en (NX (S / T), où X ≠ P). Cross-valider ces sites avec des motifs de glycosylation connus de la littérature et de créer deux groupes de résultats (validé et théorique).

Utiliser le comptage spectrale ³⁰ pour cent pour comparer l'occupation d'un site de glycosylation déterminé en comparant l'abondance des formes désamidée et non désamidée.

8. Glycan Quantification Relative

Remarque: L'identification et la quantification suivante a été complétée en utilisant le logiciel XCalibur. Cependant, tout logiciel qui analyse les données brutes et automatiquement intègre des pics chromatographiques peuvent être substitués.

1. Générer une liste théorique des compositions glycanes des combinaisons biologiquement possibles de hexoses, désoxy-hexoses, hexosamines, acide sialique, et d'autres saccharides. A cet effet, une base de données glycane humaine a été publiée par Walker et al. ¹⁵ et peut être utilisé tel quel. Pour les bases théoriques, les contraintes biologiques spécifiques à l' espèce doivent être imposées à l'espace combinatoire, et ces règles sont décrites par Kronewitter et al. ^31.
2. Calculer les masses monoisotopiques glycanes (M) des masses atomiques pour chaque composition pour la charge de protons états + 1-3. Modifier les masses monoisotopiques pour inclure l'ajout de la NAT (254,14191 g / mol) ou SIL (260,162042 g / mol) P2GPN tag.
3. Ouvrez le programme "Configuration du traitement" de la vue de la feuille de route en XCalibur. Mettre en place un procédé de traitement tel que décrit exactement dans le matériel supplémentaire de Walker et al. ¹⁵ en utilisant la liste générée à l' étape 8.2 contenant les masses monoisotopiques théoriques pour le [M + H] ^1+, [M + 2H] ²⁺ et [ M + 3H] ³⁺ espèces.
   Remarque: Pour confirmer l'identité glycane au-delà de précisionmasse, pour le NAT / SIL duplexée fonctionne, vérifiez que NAT et SIL N paires -glycan co-éluent avec le même temps de rétention. Qualitativement, la validation croisée de la station mobile avec les identifications ² spectres qui doit contenir des pics appartenant à la série d'ions oxonium ^32.
4. Export de la, chromatogramme ionique extrait intégré (XIC) zones à Excel pour obtenir les abondances SIL et NAT comme décrit exactement dans le matériel supplémentaire de Walker et al. ¹⁵
5. Dans Excel, programmer les cellules dans une nouvelle colonne pour calculer la correction pour le recouvrement de la masse moléculaire en ajustant l'abondance SIL selon l'équation publiée par Walker et al ¹ . ^5:
   ,
   où A est le pic d'monoisotopique et le chevauchement isotopique théorique, , Peut être calculé indépendamment par composition.
6. Dans une seconde colonne, les cellules programme pour normaliser les canaux de NAT et SIL en utilisant l'équation pour le facteur de glycane normalisée totale (TGNF), par spectre, comme décrit par Walker et al ¹ . ^5:
   ,
   où N est le nombre de N -glycans au- dessus de la limite de quantification.
7. Dans une nouvelle colonne, programmer les cellules à prendre le rapport de SIL: glycanes NAT (ou vice versa) pour calculer le facteur de variation de la concentration entre les deux échantillons.

Résultats

Figure 1:. Le schéma de la méthode FANGS-P2GPN marquage hydrophobe couplé (méthode A) pour la protéomique et glycomique combinés analyse est donnée étapes qui diffèrent entre glycomique-seulement le traitement et tandem glycomique et analyse protéomique, avec l' identification des sites de glycosylation, sont mis en évidence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L'en-ligne protéomique et glycomique, P2GPN méthode de marquage hydrophobe à base de filtre (méthode A) a été validée pour l' identification, la quantification, et le biais de poids moléculaire en utilisant des échantillons de plasma de poule groupée (figure 1). Pour uniquement glycomique expériences, inter-comparaisons dans les abondances de N -glycans extraites par la méthodeA à Carbograph SPE (étalon-or, méthode B) ont été faites (Figure 2). Il n'y avait aucune différence significative dans les abondances de glycanes entre les deux méthodes. La variabilité intra a également été évaluée par la quantification de la SIL: NAT rapport de glycanes obtenus par la même méthode. Le log ₂ -distributions des deux méthodes étaient gaussienne, centrée sur zéro, et non significativement différents (figure 3A-B). Le poids moléculaire se situe entre les deux protocoles complètement superposées, ce qui suggère que le filtre ne discriminait pas N -glycans basée sur la gamme de poids moléculaire et hydrophilie (Figure 4).

Figure 2: Un mélange équimolaire de NAT et SIL N -glycans extrait par la méthode A ou B a été préparé à partir de 2,5 pi de poule plasma (N = 4) Les échantillons ont été anal.yzed par UPLC-MS selon les paramètres recommandés suggérés dans la section 6. Les abondances pour chaque glycane, dans chaque canal NAT / SIL, ont été calculés en intégrant la zone sous le chromatogramme ionique extrait (MMA = 3 ppm), la correction de la molécule poids de chevauchement, et l'ajustement par le TGNF. Ces ratios sont présentés avec leurs erreurs standard. Les abondances de la Méthode B: Méthode A N -glycans sont pas significativement différentes (p> 0,05). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: La variabilité intra-en (A) Méthode A (N = 133) ou (B) Méthode B (n = 123) des stratégies ont été comparées. NAT et SIL mélanges équimolaires de N -glycans, du même schéma d'extraction, Ont été analysés sur trois répétitions techniques. Le journal ₂ -distributions étaient centrés sur zéro et ne sont pas significativement différents entre les deux flux de travail. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Les gammes de poids moléculaires de glycanes à partir de chacune de ces stratégies ont été comparées. Les deux flux de travail ont donné glycanes couvrant la même gamme de poids moléculaire. N -glycans détecté dans un protocole par rapport à l'autre est tombé juste au- dessus de la limite de détection (1 × 10 ⁵ abondance) et ne reflètent pas de biais systématique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

(tableau 5). Notre typique filtre 18 h base PNGase F de digestion, suivie par FASP trypsine digest (protocole Std) a donné lieu à des niveaux significatifs de désamidation non spécifique, ce qui peut interférer avec l'identification des glycosites. Par conséquent, un procédé utilisant un temps d'incubation plus courte à une température élevée (50 ° C) et une étape de pointe dans la PNGase F (protocole SPI) a été étudiée comme une alternative, ainsi qu'un protocole de micro-ondes de digestion (protocole MD), pour réduire au minimum la non- désamidation spécifique. Les glycanes observées dans les nouvelles méthodes de digestion ne sont pas significativement différents dans les compositions ou les abondances de 18 h standard, 37 ° C filtre PNGase F digest ( (tableau 5).

		Protéines					peptides					peptides Désaminée					Glycosites					glycoprotéines
		+		-			+		-			+		-			+		-			+		-
FASP								3083					795					5					5
18hr		217		304			6013		5086			1029		733			257		24			112		18
MARYLAND		270		266			5190		5125			465		455			254		8			102		7
SPI		281		288			4729		4482			602		573			232		dix			145		8

. Tableau 5: Comparaison des données protéomiques d'une trypsine norme digérer par rapport à la méthode de marquage en ligne FANGS-P2GPN ont fait des préparatifs ont été effectués avec (+) et sans (-) PNGase F pour déterminer les taux de désamidation et une estimation non spécifique fond glycosite taux de faux positifs. Les protéines ont été identifiées avec 1% le taux de fausses découvertes (FDR); peptides ont été filtrés en fonction de "haut" la confiance des peptides dans Proteome Discoverer 1.4 (q <0,01); glycosites ont été identified sur la base de séquences uniques contenant désamidation du motif de glycosylation conservés (NXS / T); et glycoprotéines ont été définies comme des protéines identifiées contenant au moins une glycosite identifiée.

Figure 5: Raccourcissement des protocoles de glycanes ont été mis au point pour minimiser la désamination dans les échantillons et on les compare à la PNGase F 18hr FANGS digestion. Les différences moyennes en abondances étaient de 10% et 5% pour le rapport de gestion (2.2.3) et SPI (2.2.2) protocoles, respectivement. Sur les 48 glycanes identifiés, 90% affiché moins de variation de 1,5 fois. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Des méthodes quantitatives à haut débit sont nécessaires pour faciliter l’analyse de routine des glycanes. Au cours des trente dernières années, l’analyse glycomique a été limitée à un sous-ensemble de groupes de recherche, malgré son importance dans les maladies, les applications cliniques et les produits pharmaceutiques. La méthode de purification et de marquage FANGS-P2GPN pour la glycomique et la protéomique effectue la même analyse sur une seule aliquote d’échantillon, réduisant ainsi le coût des fournitures et la quantité de matériel nécessaire (particulièrement important dans les études humaines et murines). De plus, les efforts visant à minimiser la variabilité des préparations sont d’une importance cruciale, car chaque étape supplémentaire contribue à l’erreur, masquant potentiellement des changements importants mais peu abondants dans les études cas-témoins. Le couplage des FANGS au marquage hydrophobe des hydrazides permet d’analyser des échantillons de protéines et de glycanes sur la même colonne RPLC, améliore l’ionisation des glycanes, permet une quantification relative et peut être appliqué quantitativement au plasma.

Pour l’analyse des N-glycanes, il est essentiel d’utiliser le niveau suggéré de PNGase F pour obtenir une déglycosylation complète. Bien que les glycanes soient exposés aux solvants, la dénaturation des protéines et l’excès d’enzymes aident à assurer un clivage efficace et complet. Pour une quantification précise des glycanes, il est nécessaire de s’assurer qu’ils sont complètement séchés après la dérivatisation afin d’éteindre la réaction et d’éviter les réactions croisées lors du mélange des espèces NAT et SIL. Enfin, lors de l’extension du flux de travail à l’analyse de glycosite, le timing des étapes est essentiel pour minimiser la désamidation non spécifique. Les protocoles modifiés prévoyaient que l’analyse combinée de la glycomique et de la protéomique fonctionnait de manière cohérente lorsqu’elle était effectuée en conséquence.

Le flux de travail permet d’obtenir une quantification relative précise des N-glycanes à partir du plasma par rapport à la méthode SPE de référence. Il n’y a pas de biais apparent dans les types de glycanes extraits en termes de poids moléculaire, d’hydrophilie et de structure de composition. Bien que nous n’ayons pas exploré l’analyse qualitative des glycanes liés à l’O, nous nous attendons à ce que FANGS puisse s’adapter à l’ajout d’une étape de β-élimination après la digestion de la PNGase F des glycanes liés à l’N. Cependant, les procédures nécessiteraient des modifications importantes pour le nettoyage des réactifs avant la spectrométrie de masse, et l’analyse des peptides serait considérablement affectée. Pour la protéomique, la même profondeur de couverture du protéome est obtenue par rapport aux méthodes FASP traditionnelles. Il est important de noter que les méthodes permettent d’obtenir un taux minimal de fausses découvertes pour la désamidation des N-glycanes. Bien que la méthode soit compatible avec le marquage ¹⁸O de l’Asn lors de l’étape^{de digestion PNGase 22,23}, le faible taux de fausses découvertes au site de glycosylation suggère qu’elle n’est peut-être pas nécessaire, ce qui réduit encore les coûts et la complexité.

Le protéome n’est pas enrichi en glycoprotéines dans cette méthode, ce qui présente à la fois des avantages et des inconvénients. Certaines glycoprotéines peu abondantes peuvent ne pas être détectées dans l’analyse. Cependant, l’occupation des sites glycosylés par protéine peut être comparée entre les échantillons biologiques. De plus, l’erreur et le biais introduits par la purification de l’affinité des lectines ou l’enrichissement chimique sont éliminés. En conclusion, le couplage de FANGS à la normalisation de l’individualité lors du marquage avec des marqueurs d’hydrazide de glycane permet d’obtenir une méthode simplifiée, quantitative et à haut débit pour l’analyse en tandem du glycome et du protéome avec un grand potentiel d’application dans les études cliniques cas-témoins.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide acétique (50 %)	Sigma Aldrich  ;	45754
Acétonitrile, grade HPLC	Burdick & Jackson  ;	AH015-4
Bicarbonate d’ammonium	Sigma Aldrich  ;	A6141
Réactif Bradford	Sigma Aldrich  ;	B6916	Alternative : Kit d’acide bicchoninique (Sigma Aldrich BCA1)
Chlorure de calcium	Sigma Aldrich  ;	C1016
Centrifugeuse	Eppendorf	5804 R	Les centrifugeuses alternatives qui atteignent 14 000 x g conviennent
DL-Dithiothreitol, 1  ; M en solution	Sigma Aldrich  ;
Easy-nLC 1000	Thermo Scientific	LC120	Les LC alternatifs nano ou ultra haute pression produiront des données similaires, telles que : 1. Dionex UltiMateÒ ; 3000 LC (Thermo Scientific) ; 2. Acquity UPLC (Waters).
Rack à tubes flottants	TedPella	20831-20
Fetuin	New England Biolabs  ;	P6042S
Fisher Scientific Isotemp Fours de laboratoire standard	Fisher Scientific	11-690-625F	Incubateurs alternatifs atteignant 56 ° ; C conviennent à
l’acide formique	Sigma Aldrich  ;	56302
GE Four à micro-ondes	General Electric	57B5 E82904	Tout four à micro-ondes avec des réglages de puissance réglables convient
INLIGHT Glycane Kit d’étiquetage  ;	Cambridge Isotope Laboratories	GTK-1000	Le kit INLIGHT fournit des versions NAT et SIL du réactif P2GPN.
Iodoacétamide	Sigma Aldrich  ;	A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 &�ring ;, C18 phase stationnaire en vrac	Phenomenex  ;	Alternative aux supports en vrac	: Tout C18 phase stationnaire 5 mM
Mascot Daemon Software et Server	Matrix Science		Alternative : Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Méthanol, grade HPLC	Burdick & Jackson  ;	AH230-4
PicoFrit Colonne auto-pack : 360  ; μ ; m, OD 75  ; μ ; m ID, 15  ; μ ; pointe m, non enduite, 5 par boîte, 50 cm	Nouvel objectif	1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (sans glycérol), 75 000  ; unités/ml	New England BioLabs	P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Spectromètre de masse	Thermo Scientific		Alternate haute précision de masse (5  ; ppm) fournira des données similaires
RNase B	New England Biolabs  ;	P7817S
Trypsine du pancréas	porcin Sigma Aldrich  ;	T6567-5X
Urée	Sigma Aldrich  ;	51456
Concentrateur sous videSavant SPD131DDA Concentrateur SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA	Les concentrateurs sous vide alternatifs conviennent Vivacon
500 30 kDa Filtres  ;	à la VN01H22	Sartorius Stedim Biotech	filtration centrifuge Amicon Ultra 0.5 avec Ultracel-10  ; Membrane kDa (Millipore UFC501096)
Eau, grade HPLC	Burdick & Jackson  ;	AH365-4
Eau, 18O	Cambridge Isotope Laboratories	OLM-240-97-1	L’ajout de 18O dans l’étape de digestion PNGase F est facultatif et peut ne pas être nécessaire pour les études de désamidation réalisées avec un degré de confiance de 95 %
Xcalibur 2.0	Thermo Scientific	XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit	Merck Millipore	693030