L'isolement, la caractérisation et de l'examen fonctionnel du Réseau de cellules gingivale immunitaire

Résumé

Nous avons établi une technique pour l'isolement, la caractérisation phénotypique et l'analyse fonctionnelle des cellules immunitaires de gencive murin.

Résumé

Les réseaux de cellules immunitaires dans les tissus jouent un rôle essentiel dans la médiation de l’immunité locale et le maintien de l’homéostasie tissulaire, mais on sait peu de choses sur les populations de cellules immunitaires résidentes dans la muqueuse buccale et la gencive. Nous avons mis au point une technique d’isolement et d’étude des cellules immunitaires des tissus gingivaux murins, une zone d’exposition microbienne constante et un site vulnérable à une maladie inflammatoire courante, la parodontite. Notre protocole permet une caractérisation phénotypique détaillée des populations de cellules immunitaires résidant dans la gencive, même à l’état d’équilibre. Notre procédure produit également suffisamment de cellules à haute viabilité pour être utilisées dans des études fonctionnelles, telles que l’évaluation de la sécrétion de cytokines ex vivo. Cette combinaison de caractérisation phénotypique et fonctionnelle du réseau de cellules immunitaires gingivales devrait aider à étudier les mécanismes impliqués dans l’immunité orale et l’homéostasie parodontale, mais fera également progresser notre compréhension des mécanismes impliqués dans l’immunopathologie locale.

Introduction

Tissus gingivaux entourent la dentition humaine et murine et sont constamment exposés à biofilm complexe de la dent ^1. Le réseau des cellules immunitaires de police la barrière gingivale est essentiel au maintien de l'intégrité des tissus, assurant l'homéostasie avec les microbes commensaux locales et, dans le même temps, fournir une immunité efficace contre une infection pathogène ^2. Pour atteindre l'homéostasie, le système immunitaire est soigneusement adaptée à l'environnement gingival création d'un réseau de cellules immunitaires très spécialisé, mais peu de détails sont connus des populations de cellules immunitaires gin....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales décrites dans ce protocole ont suivi les directives nécessaires et ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et l'utilisation Comité, NIDCR / NIH.

1. Préparez à l'avance

1. Préparer des milieux complètes: RPMI supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 10% de FBS.
2. Préparer des milieux de DNase: 50 ml de milieu RPMI supplémenté avec 7,5 pg de DNase (Ajouter frais, garder sur la glace en tout temps).
3. Préparer les médias collagénase-DNase: 5 ml de milieu DNase, plus de 3,2 mg / ml de collagénase de type IV (Ajouter frais....

Résultats

Pour illustrer l'application du protocole, nous montrons des résultats représentatifs examinant le réseau des cellules immunitaires dans la gencive de souris avec et sans la parodontite (WT vs LFA ^{- / -,} Figure 2A - C). FACS représentatifs parcelles montrent cellules CD45 ⁺ hématopoïétiques vivantes dans la gencive (figure 2A, 2C). L'isolement et le traitement des cellules immunitaires avec .......

Discussion

La technique actuelle obtient avec succès un grand nombre de cellules immunitaires (à partir d'une seule souris) adapté, non seulement pour la caractérisation phénotypique, mais aussi pour des études fonctionnelles ex vivo. Un autre groupe avait déjà publié un protocole pour isoler et caractériser les cellules immunitaires gingivales murin et introduit la valeur de l'utilisation de la cytométrie de flux multicolore dans l'étude de la parodontite chez des modèles animaux ^9. À la suite de d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ciseaux fins	Outils scientifiques	fins 14058-11
Manche de scalpel #3	Outils scientifiques fins	10003-12
Lames de scalpel #10	Outils scientifiques fins	10010-00	Pince à
échardes	stériles Integra Miltex	6-304
Aiguilles à biseau régulier  ;	BD Medical	305109	27 G, longueur 12,7 mm
Seringues	Monoject Covidien	8881513934	Embout Luer-lock, 3 ml
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-049	Sans Calcium et Magnésium
RPMI 1640	Lonza	12-167F	Sans L-glutamine
DNase I du pancréas bovin	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Colgénase de type IV	Gibco (par Life technologies)	17104-019
Sérum de veau fœtal	Gemini Bio-products	100-106
Gentamicine 50 mg/ml	Qualité biologique	120-098-661EA
Pen Strep	Gibco (par Life technologies)	15140-122
L-Glutamine	Gibco (par Life technologies)	25030-081
0,5 M EDTA pH 8,0	Qualité biologique	351-027-721EA
Tubes de 50 ml	Corning	352070	Polypropylène, stérile
70 &mu ; M Cell Strainers	Corning	352350
Boîtes de Pétri	Corning	351029
Stérile 5 ml Tubes FACS	Corning	352052	Stérile
BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	Contient de la brefeldine A solution
Phorbol 12-Myristate 13-Acétate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Ionomycine Sel de calcium	Sigma-Aldrich	13909
Saponine de l’écorce de quillaja	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Fixable Aqua Kit de teinture à cellules mortes	Life Technologies	L34957
Anti-souris CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Anti-souris CD4 eFluor 450	eBioscience	48-0042-82
Anti-souris TCR beta APC eFluor 780	eBioscience	47-5961-82
Anti-souris gamma delta TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
Anti-souris IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
Anti-souris IFN-&gamma ; PE	eBioscience	11-5931-82
Anti-souris NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
Anti-souris CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
Anti-souris CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
Anti-souris CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
Anti-souris CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
Anti-souris CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
Anti-souris TCR bêta FITC	eBioscience	11-5961-82
Anti-souris Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
Anti-souris Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104