L'isolement, la caractérisation et de l'examen fonctionnel du Réseau de cellules gingivale immunitaire

Résumé

Nous avons établi une technique pour l'isolement, la caractérisation phénotypique et l'analyse fonctionnelle des cellules immunitaires de gencive murin.

Résumé

Les réseaux de cellules immunitaires dans les tissus jouent un rôle essentiel dans la médiation de l’immunité locale et le maintien de l’homéostasie tissulaire, mais on sait peu de choses sur les populations de cellules immunitaires résidentes dans la muqueuse buccale et la gencive. Nous avons mis au point une technique d’isolement et d’étude des cellules immunitaires des tissus gingivaux murins, une zone d’exposition microbienne constante et un site vulnérable à une maladie inflammatoire courante, la parodontite. Notre protocole permet une caractérisation phénotypique détaillée des populations de cellules immunitaires résidant dans la gencive, même à l’état d’équilibre. Notre procédure produit également suffisamment de cellules à haute viabilité pour être utilisées dans des études fonctionnelles, telles que l’évaluation de la sécrétion de cytokines ex vivo. Cette combinaison de caractérisation phénotypique et fonctionnelle du réseau de cellules immunitaires gingivales devrait aider à étudier les mécanismes impliqués dans l’immunité orale et l’homéostasie parodontale, mais fera également progresser notre compréhension des mécanismes impliqués dans l’immunopathologie locale.

Introduction

Tissus gingivaux entourent la dentition humaine et murine et sont constamment exposés à biofilm complexe de la dent ^1. Le réseau des cellules immunitaires de police la barrière gingivale est essentiel au maintien de l'intégrité des tissus, assurant l'homéostasie avec les microbes commensaux locales et, dans le même temps, fournir une immunité efficace contre une infection pathogène ^2. Pour atteindre l'homéostasie, le système immunitaire est soigneusement adaptée à l'environnement gingival création d'un réseau de cellules immunitaires très spécialisé, mais peu de détails sont connus des populations de cellules immunitaires gingivales et leur rôle dans le maintien du tissu immunité ^2.

Lorsque l'homéostasie immunitaire est perturbé à la gencive, soit par augmentation de la sensibilité et / ou la présence de communautés microbiennes dysbiotic, un état ​​inflammatoire hôte, la parodontite pose ^{3 4.} La parodontite est une maladie inflammatoire commune, conduisant à la perte de la dent sstructures bandages en. Sous ses formes graves, il est vu dans environ 10% de la population générale ^5. Disséquer les facteurs clés impliqués dans la parodontite susceptibilité et la progression est avéré difficile ^6. Cependant, les modèles animaux ont été extrêmement utiles pour comprendre les mécanismes de la parodontite initiation et la progression ^7. Les modèles peuvent être utilisés pour définir les populations de cellules principales et des médiateurs moléculaires qui sont essentiels pour le maintien de l'homéostasie immunitaire et le développement d'entraînement de la parodontite. Une telle perspicacité va transformer notre compréhension du contrôle spécifique de la gencive de l'homéostasie immunitaire et approfondir notre compréhension actuelle de la pathogenèse de la maladie.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales décrites dans ce protocole ont suivi les directives nécessaires et ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et l'utilisation Comité, NIDCR / NIH.

1. Préparez à l'avance

1. Préparer des milieux complètes: RPMI supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 10% de FBS.
2. Préparer des milieux de DNase: 50 ml de milieu RPMI supplémenté avec 7,5 pg de DNase (Ajouter frais, garder sur la glace en tout temps).
3. Préparer les médias collagénase-DNase: 5 ml de milieu DNase, plus de 3,2 mg / ml de collagénase de type IV (Ajouter frais, garder sur la glace en tout temps).
4. tampon FACS pré-cool: 0,5% de FBS dilué dans du PBS.
5. centrifugeuse pré-refroidir à 4 ° C.
6. Chaud agitateur incubateur à 37 ° C.

2. Isolement, Dissection, et Cell Isolation de gingivaux Blocks

1. Euthanasier les souris en les exposant à de CO ₂ dans une chambre appropriée, conformément aux lignes directrices de l'ARAC.
2. Ouvrez la cavité thoracique et abdominale pour exposer le coeur et les organes internes. À perfuser, faire une incision dans la veine cave inférieure et perfuser 3 ml de PBS par l'intermédiaire du ventricule gauche en utilisant une seringue de 3 ml avec une aiguille 27 G.
3. Immobiliser le corps et la tête de la souris sur un bloc avec le ventre vers le haut.
4. Couper chaque commissure de la lèvre vers le cou avec des ciseaux, la séparation de la peau qui recouvre la mandibule et le cou région, exposant les tissus sous-jacents et les muscles. Disséquer la lèvre inférieure pour découvrir la mandibule.
5. Couper entre les incisives inférieures pour séparer les deux côtés de la mandibule et immobiliser chaque côté pour accéder à la cavité buccale.
6. Visualiser et disséquer le palais loin de la cavité nasale.
7. Disséquer zones en utilisant une lame 10 et inclure des zones molaires maxillaires et mandibulaires avec entourant gencive (figure 1). Faire des incisions verticales juste en avant de la première molaire et en arrière de la troisième molaire et une incision horizontale aula frontière de la gencive (en col blanc des tissus entourant les dents).
8. Placez le maxillaire et mandibulaire blocs dans un tube conique de 50 ml avec 5 ml collagénase / DNase (garder sur la glace).
9. Incuber dans un incubateur secoueur à 37 ° C pendant 1 h et pendant les 5 dernières minutes de l'incubation ajouter 50 pi de 0,5 M d'EDTA.
10. Ajouter 5 ml de milieu de DNase froid au tube de 50 ml avec des tissus et agiter doucement pour mélanger.
11. Transférer les 4 blocs de tissus sur une boîte de Pétri et couvrir avec 500 pi de DNase médias. Retirer la gencive de chaque bloc de tissu, en utilisant une lame de scalpel et montrant la lame dans les zones interdentaires et gingivales.
12. Transférer les tissus et les médias de la boîte de Pétri, ainsi que les médias de DNase précédents utilisés lors de la dissection, dans un nouveau tube de 50 ml à travers le tamis de la cellule (70 pm de taille). Laver avec les médias de DNase (3-5 ml) tous les instruments utilisés et filtre.
13. En utilisant le piston d'une seringue stérile de 3 ml, écraser le tissu contre le tamis,filtration avec des milieux de DNase froide (30 à 35 ml).
14. Laver le tamis cellulaire avec les médias de DNase froid.
15. Centrifuger à 4 ° C, 314 g pendant 6 min.
16. Jeter le surnageant, remettre en suspension dans 1 ml de milieu complet.
17. Compter les cellules (la quantité attendue doit être comprise entre 8 x 10 ^{5 à 1,2} x 10 ⁶ cellules avec une viabilité> 80%) en utilisant un compteur de cellules automatisé.

3. Stimulation et FACS coloration des cellules gingivales

1. Stimuler la suspension de cellules individuelles avec du PMA (50 ng / ml) et de l'ionomycine (2,5 pg / ml) en présence de 1 pl / ml de brefeldine A.
2. Incuber pendant 3,5 h à 37 ° C et 5% de CO _2.
3. Isoler et laver avec du PBS et centrifuger à 4 ° C; 314 g pendant 6 min.
4. Colorer les cellules en utilisant un colorant de viabilité en suivant les instructions du fabricant.
5. Teinture pour les marqueurs extracellulaires (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ ou de fourmisibodies de choix) selon les instructions du fabricant.
6. Laver les cellules avec du tampon FACS froid et centrifugation à 4 ° C, 314 g pendant 5 min.
7. vortexer doucement pour perturber le culot cellulaire.
8. Fixer les cellules avec 2% de paraformaldehyde pendant 20 minutes à température ambiante.
9. Laver les cellules avec du tampon FACS à froid, centrifuger à 4 ° C, 314 g pendant 5 min et les taches de cytokines intracellulaires.
   1. Remplir les tubes FACS avec une solution froide de 0,5% de saponine dilué dans du tampon pour FACS et centrifugation à 4 ° C, 314 g pendant 5 min.
   2. Ajouter 300 ul de solution de saponine à 0,5% dans les tubes FACS, incuber pendant 15 min à l'obscurité à 4 ° C puis centrifuger à 4 ° C, 314 g pendant 5 min.
   3. Colorer les cellules de marqueurs intracellulaires (IL-17A et IFNy ou des cytokines de choix) selon les instructions du fabricant. Laver les cellules avec une solution de saponine à 0,5% et centrifugation à 4 ° C, 314 g pendant 5 min.
   4. Laver ensuite avec FACSun tampon et centrifugation à 4 ° C, 314 g pendant 5 min.
   5. Remettre en suspension les cellules dans 300 ul de tampon FACS.
10. Analyser les résultats sur un cytomètre de flux.

4. Analyse de cytométrie en flux

1. Visualiser les cellules à analyser sur l'avant (FSC) et de diffusion latérale (SCC) et la porte d'exclure les débris.
2. Sélectionnez les cellules individuelles avec zone de diffusion vers l'avant (FSC-A) par rapport à la hauteur (FSC-H) paramètres.
3. Cellules de grille qui sont en direct (comme indiqué par la viabilité coloration) et positif pour le marqueur CD45 ⁺ hématopoïétiques pour une analyse ultérieure (figure 2A et 2C).
4. Poursuivre l'analyse de marqueurs spécifiques comme le montre la Figure 2 et la Figure 3.

Résultats

Pour illustrer l'application du protocole, nous montrons des résultats représentatifs examinant le réseau des cellules immunitaires dans la gencive de souris avec et sans la parodontite (WT vs LFA ^{- / -,} Figure 2A - C). FACS représentatifs parcelles montrent cellules CD45 ⁺ hématopoïétiques vivantes dans la gencive (figure 2A, 2C). L'isolement et le traitement des cellules immunitaires avec ce proto...

Discussion

La technique actuelle obtient avec succès un grand nombre de cellules immunitaires (à partir d'une seule souris) adapté, non seulement pour la caractérisation phénotypique, mais aussi pour des études fonctionnelles ex vivo. Un autre groupe avait déjà publié un protocole pour isoler et caractériser les cellules immunitaires gingivales murin et introduit la valeur de l'utilisation de la cytométrie de flux multicolore dans l'étude de la parodontite chez des modèles animaux ^9. À la suite de d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ciseaux fins	Outils scientifiques	fins 14058-11
Manche de scalpel #3	Outils scientifiques fins	10003-12
Lames de scalpel #10	Outils scientifiques fins	10010-00	Pince à
échardes	stériles Integra Miltex	6-304
Aiguilles à biseau régulier  ;	BD Medical	305109	27 G, longueur 12,7 mm
Seringues	Monoject Covidien	8881513934	Embout Luer-lock, 3 ml
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-049	Sans Calcium et Magnésium
RPMI 1640	Lonza	12-167F	Sans L-glutamine
DNase I du pancréas bovin	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Colgénase de type IV	Gibco (par Life technologies)	17104-019
Sérum de veau fœtal	Gemini Bio-products	100-106
Gentamicine 50 mg/ml	Qualité biologique	120-098-661EA
Pen Strep	Gibco (par Life technologies)	15140-122
L-Glutamine	Gibco (par Life technologies)	25030-081
0,5 M EDTA pH 8,0	Qualité biologique	351-027-721EA
Tubes de 50 ml	Corning	352070	Polypropylène, stérile
70 &mu ; M Cell Strainers	Corning	352350
Boîtes de Pétri	Corning	351029
Stérile 5 ml Tubes FACS	Corning	352052	Stérile
BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	Contient de la brefeldine A solution
Phorbol 12-Myristate 13-Acétate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Ionomycine Sel de calcium	Sigma-Aldrich	13909
Saponine de l’écorce de quillaja	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Fixable Aqua Kit de teinture à cellules mortes	Life Technologies	L34957
Anti-souris CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Anti-souris CD4 eFluor 450	eBioscience	48-0042-82
Anti-souris TCR beta APC eFluor 780	eBioscience	47-5961-82
Anti-souris gamma delta TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
Anti-souris IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
Anti-souris IFN-&gamma ; PE	eBioscience	11-5931-82
Anti-souris NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
Anti-souris CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
Anti-souris CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
Anti-souris CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
Anti-souris CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
Anti-souris CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
Anti-souris TCR bêta FITC	eBioscience	11-5961-82
Anti-souris Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
Anti-souris Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104