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DOI :

10.3791/53738

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8 mars 2016

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1Biology Department, Boston College, 2Division of Biology, Kansas State University, 3Discovery Research, Biogen

Dans cet article

Résumé

interférence ARN (ARNi) est un outil extrêmement précieux pour découvrir la fonction des gènes. Cependant, la capacité de cibler des gènes à l’aide de l’ARNi au cours des stades préadultes est limitée chez le principal vecteur du paludisme humain, Anopheles gambiae. Nous décrivons un protocole ARNi pour réduire la fonction des gènes par injection directe pendant le développement de la nymphe.

Résumé

interférence ARN (ARNi), phénomène naturel chez les organismes eucaryotes, est un outil extrêmement précieux qui peut être utilisé en laboratoire pour des études génomiques fonctionnelles. La capacité d’intrus des gènes individuels de manière sélective via cette technique de génétique inverse a permis à de nombreux chercheurs de découvrir rapidement les rôles biologiques de nombreux gènes dans de nombreux organismes, en évaluant les phénotypes de perte de fonction. Chez le principal vecteur du paludisme humain, Anopheles gambiae, la méthode prédominante utilisée pour réduire la fonction des gènes ciblés consiste à injecter un double brin (ARNdb) dans l’hémocèle du moustique adulte. Bien que cette méthode ait été couronnée de succès, l’inactivation des gènes chez les adultes exclut l’évaluation fonctionnelle des gènes qui sont exprimés et qui jouent potentiellement un rôle au cours des stades pré-adultes, ainsi que des gènes qui sont exprimés dans un nombre limité de cellules chez les moustiques adultes. Nous décrivons une méthode d’injection d’ARNdb inhibiteur de la protéase sérine 2 (SRPN2) au stade précoce de la nymphe et validons l’inactivation de la protéine SRPN2 en observant une diminution des niveaux de protéines cibles et la formation de pseudo-tumeurs mélanotiques chez les moustiques adultes inactivés de SRPN2. Ce phénotype évident a été décrit précédemment pour l’inactivation de la fonction SRPN2 au stade adulte, et nous avons récapitulé ce phénotype adulte par l’inactivation de SRPN2 initiée pendant le développement de la nymphe. Lorsqu’elle est utilisée en conjonction avec une solution d’ARNdb marquée à un colorant, cette technique permet de visualiser facilement par simple microscopie optique la qualité de l’injection et la distribution de l’ARNdb dans l’hémocèle.

Introduction

Le paludisme est une maladie infectieuse transmise par les moustiques qui touche plusieurs millions de personnes chaque année. L'Organisation mondiale de la santé (OMS), en 2013 il y avait environ 584.000 décès dus au paludisme, dont 78 pour cent se sont produits chez les enfants de moins de cinq ans 1. Les agents pathogènes qui causent le paludisme humain sont des parasites apicomplexes du genre Plasmodium et sont transmis entre leurs hôtes humains par les moustiques anophèles femelles. La transmission se produit lorsque le moustique prend un repas de sang d'une personne qui est infectée, puis dépôts de parasites infectieux dans un individu non infecté dans un repas de sang ultérieur. Dans le genre Anopheles, Anopheles gambiae est l'espèce avec la plus grande capacité vectorielle et est vecteur du paludisme le plus important en Afrique sub-saharienne 1-3.

Actuellement, lutte contre les moustiques vecteur par le déploiement d'insecticides continue à be la principale méthode utilisée pour réduire le fardeau du paludisme humain. Bien que l'utilisation d'insecticides depuis les années 1960 a prouvé être un très grand succès, la montée de la résistance aux insecticides a entraîné un besoin pour le développement de nouveaux insecticides et des stratégies de lutte contre les vecteurs de remplacement 4-7. En 2010, un total de 49 de 63 pays qui relèvent de l'OMS a indiqué l'apparition de la résistance aux insecticides chez les vecteurs du paludisme 1. En outre, l'outil IR Mapper, qui utilise la littérature examinée par des pairs pour évaluer les données de résistance dans les régions afrotropicaux, rapporte qu'entre 2001 et 2012 il y avait 46% et 27% d' augmentation de la résistance aux pyréthrinoïdes et dichlorodiphényltrichloroéthane (DDT), respectivement 7.

L' interférence ARN (ARNi) a été identifié au début des années 1990, une technique qui pourrait être utilisée pour inactiver les gènes de la plante Pétunia 8,9 et dans le champignon Neurospora crassa 9,10. Peu de temps après,en 1998, l' ARNi a été documentée dans Caenorhabditis elegans comme un moyen de réduire l' expression des gènes dans un modèle animal par introduction d'ARN antisens ou double brin (ARNdb) par injection d' alimentation ou de méthodes 9,11. Depuis sa découverte, l'ARNi a révolutionné la poursuite de la génomique fonctionnelle en permettant aux chercheurs d'utiliser la génétique inverse pour étudier rapidement les rôles fonctionnels des gènes d'intérêt par l'intermédiaire d'un mécanisme de silençage génique post-transcriptionnelle très sélectif. Dans certains organismes, tels que Drosophila melanogaster, l'utilisation d'organismes transgéniques qui expriment des constructions d'ARN interférents a été largement efficace pour knock - down de gènes (KD). Bien que l'utilisation de transgènes dans An. gambiae pour l' ARNi a été utilisé et peut se révéler utile pour les écrans à grande échelle, la génération de souches de moustiques transgéniques est à la fois la main - d'œuvre et de temps, prenant généralement deux à trois mois pour aller de l'identification d'un gène d'intérêt pour les generatisur d'un stock transgénique approprié 12. Actuellement, la principale méthode de KD de gène dans An. gambiae est par injection dans l'hémolymphe, au cours du stade adulte, de l' ARN double brin spécifique pour un gène donné 12,13. Ce processus prend habituellement environ un mois pour aller de l' identification d'un gène d'intérêt à l' évaluation du KD génique, ce qui prouve à être beaucoup plus rapide que les méthodes transgéniques 12. Méthodes de larves au stade ARNi ont été établis récemment dans An. ARNdb à base de microalgues gambiae et Aedes aegypti via nanoparticule alimentation 14-17 ou par administration orale de molécules 18, offrant des possibilités d'effectuer une analyse génomique fonctionnelle au cours des premières étapes du développement. En injection directe, l' alimentation, et les méthodes de livraison de nanoparticules, ARNdb est repris de manière autonome par la cellule cible et clivé par l'enzyme Dicer en 21-25 nucléotides de long "interférent ARNs" (siRNA) 19,20. Ces siRNA sont alors IncorporATED dans le silence complexe (RISC) induite par l' ARN, à partir de laquelle un brin sera supprimé, ce qui permet le complexe RISC ARN lié à se lier à et cliver l'ARNm cible et ainsi réduire son niveau et inhiber sa traduction 19,20.

De nombreuses caractéristiques intrinsèques de la biologie des moustiques base modulent la capacité vectorielle, y compris la préférence de l' hôte (par exemple, olfaction, gustation), l' accouplement, la reproduction et l' immunité. Étant donné l'importance de ces processus biologiques, il est probable que leur modulation au niveau génétique ou pharmacologique offrira de nouvelles possibilités de lutte contre les vecteurs, y compris le contournement de la résistance aux insecticides, et de fournir de nouveaux outils pour des approches plus largement intégrées à la gestion des vecteurs. L'utilisation de la génomique fonctionnelle pour évaluer les rôles des gènes sous-jacents de ces caractéristiques biologiques intrinsèques permettra d'identifier de nouvelles cibles et de fournir de nouvelles perspectives sur la façon dont nous pouvons effectivement créer une nouvelle stratég de contrôle, plus efficaces. Nous décrivons le développement et l' utilisation d'une méthode d'injection rapide pour initier ARNi pendant la phase de chrysalide d'An. gambiae. On observe que l' injection de stade de chrysalide d'un déclencheur ARNi permet l' observation des phénotypes obtenus chez les adultes à un stade précoce, à savoir, plus tôt après la levée que ce qui serait observé si le gène knockdown ont été lancés chez les adultes en post-levée. Cette méthode permet gène knockdown commençant pendant l'intervalle de développement pupal et se prolongeant dans les stades adultes, tels que knockdown génétique initiée au cours du développement des pupes peut persister et affecter les types de cellules hémolymphe accessible début adultes, ainsi que les types de cellules qui sont plus hémolymphe accessibles pendant la métamorphose que chez l'adulte, comme les neurones sensoriels adultes présents dans phanères après l'émergence.

Protocole

1. Synthèse et préparation ARNdb

  1. Identifier une région knockdown 200-800 pb (pour générer l'ARNdb correspondant) dans le gène d'intérêt qui est supposé avoir aucun effet identifiable hors-cible (par exemple, aucune homologie de séquence ≥18 pb au sein d' un autre gène) et un contrôle négatif (par exemple , une séquence hétérologue qui ne soit pas présent dans le génome d'insectes cibles, tels que le gène lacZ d' Escherichia coli (GenBank Gene ID: 945006). en variante, utiliser un contrôle positif (par exemple, ce qui donne un phénotype aisément observé, par exemple 21,22 SRPN2 GenBank Gène ID. 1270169) la séquence de ciblage SRPN2 ARNdb est défini dans Michel et al (2005) 21..
    Remarque: E-ARNi est une ressource bioinformatique open-source qui est utile pour l'identification de ces régions et pour le processus de conception des amorces oligonucléotidiques 23.
  2. Effectuer sl' amplification tandard PCR ( par exemple, réalisée avec l' ADN polymerase Taq en utilisant 30-35 cycles) en utilisant un ADN génomique ou d' ADNc matrice pour obtenir ARNdb modèle de synthèse flanqué d'une séquence de promoteur T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') et procéder à la préparation d' ARNdb et nettoyer à l' aide d' un kit commercial in vitro de transcription selon les instructions du fabricant. Utilisez SRPN2 PCR Les conditions d'amplification et de l' information primaire tel que présenté dans An et al. (2011) 22.
  3. Quantifier l' ARN purifié des rendements amplicon par spectroscopie d'absorbance ultraviolette à longueur d'onde de 260 nm et d' ajuster à la concentration souhaitée (par exemple, 3 pg / pl) dans de l' eau sans RNase.
    1. Pour le dépannage de faibles concentrations d'ARN, de réduire le volume de liquide en faisant tourner les échantillons dans une centrifugeuse sous vide à température ambiante ou par lyophilisation des échantillons et de reconstituer en plus petits volumes d'eau. Le temps nécessaire pour l'échantillon variera en fonction lyophilisationsur les volumes initiaux de l'échantillon et les concentrations d'ARNdb.
  4. Vérifier la qualité et la longueur de l'ARNdb sur un gel d'agarose à 2% préparée avec 1 x TBE ou TAE tampon et coloré avec du bromure d'éthidium (EtBr), ainsi que l'ADN de matrice utilisée pour la réaction de transcription. L'ARNdb migre plus lentement que l'ADN matrice. La qualité et la longueur peuvent être évalués en vous assurant qu'il n'y a pas de produits non spécifiques ARNdb et en comparant les produits avec un marqueur d'ADN standard, respectivement.
    Note: EtBr est un mutagène puissant et doit être traitée en conséquence.
    Note: A une concentration ARNdb de 3 pg / pl, 0,5 pi de l'échantillon est plus que suffisant pour la visualisation sur le gel d'agarose EtBr-teinté.
  5. Stocker ARNdb à -20 ° C jusqu'à leur utilisation. Plusieurs cycles de gel / dégel peut entraîner une dégradation, de sorte aliquotes doivent être préparés pour les gros volumes de ARNdb.

2. Préparer Fast Green FCF Dye (FGD) Tubes

  1. Diluer rapide colorant vert FCFà partir de la solution mère (≥85% de teneur en colorant) à 0,1% (v / v) (solution de travail) dans l'eau sans RNase.
  2. Introduire à la pipette 1 pi de colorant dans le fond d'un tube de 1,5 ml.
  3. Placer les tubes dans un bloc thermique 65 ° C pendant environ 3 heures pour évaporer le liquide, puis placer les tubes à la température ambiante pendant au moins 30 minutes, refroidir avant de l'utiliser. Ce colorant solide sec se reconstituer en solution de resuspension ARNdb.

3. Aiguilles Pull d'injection

  1. Tirez des aiguilles de verre borosilicate à l'aide d'un extracteur d'aiguille chauffée à un diamètre de 10-30 pm de la pointe. Pull paramètres correspondent à: réglage de chauffe pas. 1 = 100, réglage Chauffage non. 2 = 70.
  2. Pour éviter d'endommager la pointe fine de l'aiguille, placez toutes les aiguilles tirées horizontalement dans une boîte de Pétri sur une bande de moulage mastic.
    Remarque: Des informations supplémentaires pour l'aiguille capillaire tirant des méthodes peut être trouvé plus en détail dans la recherche et de référence Réactif Malaria Resource Center MManuel R4 24.

4. Préparer la station d'injection

  1. Collecter les matériaux requis: aiguilles microcapillaires en verre tiré à pointe fine, microinjecteur, papier filtre mince et papier filtre épais, des boîtes de Pétri, pipettes de transfert, pinceau et disséquant microscope optique.
  2. Préparer le microinjecteur comme indiqué dans le manuel d'microinjecteur, et régler le volume d'injection à volume désiré par impulsion (par exemple, un maximum de 69 nl par impulsion).
  3. Sur une plate - forme qui est facile à manœuvrer sous un microscope (par exemple, le côté plat d'un porte-tube de styromousse), empiler les deux feuilles de papier filtre avec le papier filtre mince sur le dessus, et le fixer avec du ruban adhésif sur les bords.
  4. Resuspendre 10 pi de chaque solution ARNdb dans des tubes de colorant de couleur séparées, et la place sur la glace.

5. Collecter pupes pour injection

  1. Remplir un petit 60 mm x 15 mm boîte de Pétri avec 10 ml d'eau déminéralisée, et recueillir ~ 50 pupes pâle (During les 24 premières heures après la nymphose) à partir d'un bac insectarium en utilisant un transfert jetable en plastique pipette.
  2. Retirez tout pupes qui ont moyenne à cuticule sombre bronzage.
    Remarque: Une fois la cuticule commence à bronzer, il devient plus difficile de pénétrer la cuticule, et les résultats d'injection de la létalité beaucoup plus élevé.

6. ARNdb Injection

  1. Sous le microscope de dissection, rompre l'extrémité distale de l'aiguille d'injection avec une paire de pinces fines.
  2. Préparer l'aiguille d'injection par l'aiguille remblayer avec de l'huile minérale (à l'aide d'une seringue avec une aiguille de calibre 30 3 pouces), et expulsant l'excédent d'huile avec le micro-injecteur.
  3. remplir avant l'aiguille d'injection avec une quantité maximale de ARNdb, et éjecter une impulsion sous le microscope pour assurer la distribution du liquide. Dans le cas où aucun liquide est repris et / ou expulsé, vérifiez l'extrémité distale de l'aiguille pour tout blocage et veiller à ce que l'aiguille est fermement fixé dans le microinjector.
  4. Choisissez 1-3 pupes, et placez-les sur le papier filtre.
  5. En utilisant le pinceau, placez le pupes sur le papier filtre avec cuticule dorsale accessible, et utiliser le pinceau pour pousser sur du papier filtre et d'absorber de l'eau en excès.
  6. Stabiliser la chrysalide avec la pointe du pinceau, et insérer l'aiguille dans la cuticule dorsale entre le thorax et l'abdomen à un angle d'environ 30 ° par rapport à la surface dorsale de la chrysalide. L'injection doit être dirigée vers l'extrémité postérieure de la pupe et l'aiguille doit être déplacé dans une direction antérieure à postérieure.
  7. Injecter deux impulsions (69 nl par impulsion) de 3 pg / solution ul ARNdb dans l'hémolymphe, et vérifier la distribution de la couleur dans tout le corps. Si aucune couleur est identifiée, déplacer la position de l'aiguille d'injection légèrement pour dégager l'extrémité de l'obstruction et répéter la livraison liquide.
  8. Utilisez le pinceau mouillé pour déplacer doucement chrysalide de l'aiguille dans l'eau pour la culture. Til Pupa devrait coller au pinceau au contact de la lumière.

7. Conditions post-injection

  1. Placez boîte de Pétri avec pupes injecté dans une cage de moustiques avec le flux d' air approprié (par exemple, maille cage ou un récipient avec couvercle de maille). conditions d'élevage pupes doivent rester constamment à 27 ± 3 ° C la température, 75 ± 5% d'humidité et être sous un cycle de lumière: obscurité de 16: 8 h.
  2. Préparer un 10% (p / v) de solution de glucose, et placer une boule de coton en solution saturée sur la cage en filet de moustique pour l'alimentation des adultes.

8. Évaluer Knockdown

  1. Au point de temps (s) souhaitée, évaluer les phénotypes chez les insectes ARNdb injectés expérimentaux, par rapport aux témoins.
    1. Évaluer les insectes dsSRPN2 et dsLacZ quotidiennement par refroidissement bas adultes pendant environ 2-3 min à -20 ° C, en les transférant à une plaque froide à 2 ° C et identifier toute formation pseudo-tumorale par l' utilisation d'un microscope à dissection à 15Xgrossissement avec éclairage en fond clair. Après l'évaluation, retourner les adultes aux conditions insectarium (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% d'humidité).
      Remarque: Les ARNdb expérimentaux et de contrôle utilisés dans ce protocole sont dsSRPN2 et dsLacZ, respectivement. Il y a beaucoup d'options appropriées pour les contrôles; cependant, il est suggéré qu'un contrôle positif dont le phénotype et / ou l' expression est facilement visualisées (par exemple, en disséquant la microscopie) et / ou quantifiée [par exemple, quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR), Western blot] doit être utilisé lors de l' apprentissage de cette technique. protéine SRPN2 et la transcription quantification par Western blot et qRT-PCR, respectivement, sont décrits dans Michel et al. (2005) 21.

Résultats

Injection nymphose pour KD génique donne des résultats optimaux lorsque l' injection est réalisée au cours de la pupe précoce, lorsque les niveaux de bronzage cuticules sont faibles (figure 1A, à gauche, et 1B). Augmentation de la tannerie et le durcissement de la cuticule, généralement après 24 heures, entraîne une augmentation de la mort pupe après l' injection (figure 1A, centre et droite). Le taux de développement des pupes peut varier en fonction des conditions insectarium et la densité des animaux 24,25; par conséquent, il est préférable d'évaluer la pigmentation visuellement.

Au cours du processus d'injection, l'aiguille capillaire est insérée dans la cuticule dorsale selon un angle d'environ 30 ° dans la direction antérieure à postérieure (Figure 2A). Une fois que l'aiguille est insérée et l'ARNdb + 0,01% (p / v) FGD est distribué, la distribution du colorant est évidente dans l'hémolymphe (Figure 2B).

Évaluation de l' émergence des adultes pour pupes injecté avec 0,01% (p / v) DGC a révélé un taux moyen de 70% émergence, contre 96,7% émergence de contrôle non injecté (figure 3A). À noter, l' émergence partielle de la coque de nymphose a été observée pour un grand nombre de moustiques non-survivants (figure 3B). Animaux Injecté présentent pas de retard dans le temps d'émergence (figure 4A) ou d' impact biaisé sur l' autre sexe (figure 4B). Évaluation supplémentaire de survie des adultes effectuée jusqu'à 10 jours post-levée révèle aucun impact évident sur ​​la survie des adultes en post-levée (figure 4C).

La validation de la qualité KD a été évaluée par la pseudo-tumeur mélanique (cluster de tissu à pigment foncé) de phénotype associé à 21,22 SRPN2 knockdown comme témoin positif pour le knock - down et absence de phénotypes associés à l' injection dsLacZ comme témoin négatif. Les moustiques adultes qui ont émergé ont été marqués au jour 8 post-injection (jour 6-7 post-levée). Pseudo-tumeurs mélaniques (figure 5A et 5B) ont été observées à travers la cuticule de 93,5% par rapport à la dsSRPN2 0% des moustiques dsLacZ adultes (figure 6A). Clusters de tissu sombre mélanisée ont été identifiés lors de la dissection des taches pigmentaires (Figure 5C). Les pseudo-tumeurs étaient visibles sur la cuticule des adultes dès le jour 3 post-levée et étaient également présents dans un sous - ensemble de dsSRPN2 hémolymphe et les tissus de l' intestin (données non montrées). A 5 post-injection (stade adulte précoce), a diminué de manière significative les niveaux SRPN2 dans dsSRPN2, mais pas dsLacZ ou isolats de protéines non-injecté hémolymphe a été observée (figure 6B).

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Figure 1: la mise en scène du développement pour l' injection ARNdb pupe précoce injection pupe des résultats ARNdb dans la survie optimale et la progression dans l' étape adulte.. Les faibles niveaux de cuticule pigmentation (A, à gauche, et B) peuvent être observées dans la première 0-24 h nymphose suivante. Bronzage de la cuticule précédente injection pupe (A, centre et droite) résultats modérée à faible taux de survie.

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Figure 2:. Poste d'injection et la distribution des ARNdb (A) Capillaire aiguille d'injection marqué par un colorant de ARNdb marqué par un colorant dans la cuticule dorsale selon un angle d'environ 30 °, dans la direction avant vers l' arrière. (B) Le colorant est visiblement distribué dans l'hémolymphe chrysalide. ARNdb volume d'injection de 138 nl, marqué avec F 0,01%GD (p / v).

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Figure 3:. Émergence des adultes post-injection (A) , 70% de chrysalides injecté avec 0,01% GFD (p / v) de sortie avec succès (n = 60) comparé à 96,7% des témoins non injecté (n = 60). Trois répliques ont été réalisées biologiques. (B) émergence partielle de la coque de nymphose a été observée pour un grand nombre de moustiques non-survivants. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM).

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Figure 4: Taux d'émergence, l' évaluation du sexe et la survie des adultes (A) fois d'émergence comparables ont été observés suite à l' injection de pupe avec 0,01% FGD (24 h = 80% et 48 h = 20%), par rapport à pupes non-injecté (24. hr = 83% et 48 h = 17%). (B ) mâle et femelle adulte environ égale émergence a été observée pour 0,01% FGD pupes injecté (femelle = 48% et mâle = 52%) et pupes non-injecté (femelle = 52% et mâle = 48%). (C) Analyse de survie révèle que l' injection avec 0,01% FGD n'a aucune incidence sur la survie des adultes, évalué jusqu'à 10 jours post-levée. Les résultats représentent les données provenant de trois expériences indépendantes avec 0,01% FGD injectés (n = 60) et (n = 60) chrysalides non injecté (nombre égal de mâles et femelles). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM).

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Figure 5: Pseudo-tumeur contrôle positif phénotype reflète knockdown succès pseudo-tumeurs ont été observées sur le (A) abdominale et (B) cuticule thoracique dsSRPN2 -injected, mais pas dsLacZ moustiques adultes -injected au jour 8 après l'injection..(C) plus fort grossissement (400X) Imagerie (a) de la cuticule et la dissection des taches pigmentées (b) révèle des amas de cellules sombrement mélanisés.

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Figure 6: Quantification de la formation de pseudo-tumorale et une diminution des taux de protéines SRPN2 (A) injections de pupe conduisent à la formation de pseudo-tumorale chez 93,5% des adultes dsSRPN2 (n = 21) par rapport à 0% des témoins dsLacZ (n = 19). . Résultats obtenus jour 8 post-injection. (B) Western blot ( à gauche) montre une diminution SRPN2 niveaux dsSRPN2, mais pas dsLacZ ou isolats non-injecté protéines hémolymphe (jour 5 post-injection). Sur la base des résultats de trois expériences indépendantes. Anti-SRPN2 21 et anti-SRPN3 dilutions 26 d'anticorps utilisés étaient 1: 1000 et 1: 2000, respectivement. Goat anti-rabbit IgG-HRP (produit sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) a été utilisé à 1: 5000. Tous les niveaux de protéines ont été quantifiées ( à droite) par l' intensité de la bande (ImageJ Software, NIH, Bethesda, MD), normalisée à SRPN3, et statistiquement comparés par test t non apparié. P <0,05: *, P ≥0.05: ns (non significatif). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM).

Discussion

Les méthodes actuelles pour induire non transgénique ARNi dans les moustiques impliquent l' injection directe d'ARNdb dans le hémocèle adulte 12,13 ou l' alimentation des larves d'ARNi trigger revêtues de nanoparticules 14-17 ou molécules ARNdb à base de microalgues-18. Cibler le moustique adulte, tout en étant extrêmement précieux, peut exclure un grand nombre de gènes qui fonctionnent pendant les périodes de développement antérieures. Knockdown initié par l'alimentation des larves peut donner des phénotypes incohérentes pendant le stade adulte en raison, en partie, au potentiel de la protéine variable de persistance à travers le stade de pupe. Par conséquent, l'introduction d'une méthode supplémentaire qui vise spécifiquement à initier l'ARNi au cours du développement des pupes fournira un moyen d'évaluer plus en détail les fonctions des gènes au cours des stades de développement pré-adultes, ainsi que des capacités améliorées pour évaluer la fonction des gènes au cours des stades adultes. Comme approche gène knockdown basée sur l'injection ou l'expression ARNdb, la persistance d'un gène knockdownne peut pas être prédit. Par conséquent, les niveaux de transcription ou de protéines doivent être évalués pour le gène d'intérêt pendant les périodes de développement d'intérêt. Bien que nous observons une poursuite de la diminution des taux de protéines au jour 5 post-injection pour SRPN2 chez les animaux SRPN2 ARNdb injectés, des facteurs tels que le renouvellement des protéines et la demi-vie peut varier pour différentes cibles. Il est essentiel d'assurer, ainsi, que le ARNdb à utiliser pour l'injection est bien concentré et apparaît intact sur un gel d'agarose. Nous recommandons expérimentateurs réévaluer ces facteurs si les résultats knockdown ne sont pas suffisantes, et peut-être besoin d'être testés de façon empirique pour les cibles de gènes spécifiques des concentrations respectives de ARNdb.

Nous décrivons une méthode pour l'initiation de l' interférence ARN lors de l'étape de pupe d'An. développement gambiae. Cette méthode repose sur l'introduction par micro-injection d'ARN double brin directement dans le hémocèle de chrysalides précoce et permet l'évaluation de la qualité de l'injection par lautiliser du colorant marqué ARNdb. La capacité de visualiser la qualité de l'injection constitue une amélioration essentielle pour assurer knockdown succès et constitue un aspect de knockdown de gènes à base d'injection qui n'a pas été pris en compte dans les protocoles basés sur ARNdb les plus signalés précédemment, mettant l'accent sur le stade adulte. En ciblant la pupe au début de cette période de développement, les gènes qui pourraient jouer un rôle dans cet intervalle critique du développement, ou au cours des premiers stades de la vie adulte peut être évaluée de façon fonctionnelle. En outre, cette méthode peut permettre la livraison ARNdb aux cellules, et l'établissement de l'interférence ARN dans les cellules qui sont accessibles pendant la métamorphose, mais moins accessible chez les moustiques adultes complètement formés.

Une récente analyse des microréseaux par Harker et al. (2012) a identifié 560 An. transcriptions gambiae qui ont été régulés à la hausse ou à la baisse réglementés par au moins 4 fois au cours des stades de développement distincts, allant de l'embryon à l' adulte. Parmi les 560 transcrits identifiés, un ensemble de 309 a été régulée à la hausse au cours du développement des pupes 27. Ces résultats suggèrent qu'il existe de nombreuses exigences pour l'expression différentielle des gènes au cours du développement des moustiques, y compris celles qui se produisent pendant la phase de chrysalide, un intervalle pendant lequel l'organisme subit la métamorphose. Chez de nombreuses espèces d' insectes, y compris un. gambiae, les gènes impliqués dans les processus tels que le développement (ie, la cuticule nymphale et des protéines de liaison à la chitine) 27-31 et la réponse immunitaire ( par exemple, des protéines de type récepteur Toll) 27,32-34 sont fortement exprimés lors de la phase de chrysalide. Une fois qu'un adulte entièrement formé est apparue, on a poursuivi l' expression génique en réponse à des changements environnementaux et physiologiques 35. Notamment, au cours du développement précoce des adultes, il y a une augmentation de l'expression des gènes du développement ( par exemple, la cuticule des adultes et des protéines sarcoplasmiques) 36, ainsi que d' autres gènes clés (c. , La protéine du sperme spécifique et cytochrome P450 enzymes du métabolisme) 27,36.

Le contrôle positif utilisé dans le développement de ce protocole, SRPN2, est un An. inhibiteur de sérine protéase gambiae (serpine). SRPN2 joue un rôle important dans la régulation négative de mélanisation insecte, une réponse immunitaire innée à large spectre chez les insectes 21,22. Knockdown de SRPN2 chez les moustiques adultes des résultats dans la formation de pseudo-tumeur 21,22, un phénotype qui est facilement observable par l' utilisation de la microscopie optique. Étant donné que ce phénotype distinct peut être facilement marqué chez les insectes vivants, nous avons utilisé pour les injections SRPN2 pupes initiales ARNi de scène. En outre, SRPN2 est exprimé à tous les stades de développement 37, fournissant ainsi une bonne cible pour l' injection et l' évaluation de la fonction ARNi stade de pupe au début des adultes. Nous démontrons que la méthode que nous avons développé est capable d'induire des adultes similaires pseud mélanique la formation o-tumorale à la suite d'injections effectuées ARNdb pendant la pupe de développement. Dans l' élaboration de ce protocole, nous avons observé que l' injection au cours du développement des pupes précoce (c. -à- les 24 premières heures après la mue des larves-pupe) est essentielle pour obtenir l' émergence optimale des adultes. Dans le cas où une mauvaise levée est obtenue après l'injection, nous vous recommandons de larves mise en scène avec une plus grande précision, pour obtenir des pupes avec moins vaste durcissement de la cuticule et d'assurer l'injection de stade de pupe précoce est atteint. De plus, en minimisant les dommages aux résultats de la cuticule des taux d'émergence optimaux et en augmentant le grossissement lors de l'injection peut aider à assurer que seule la zone prévue de l'animal est percé. Si l'aiguille doit percer à travers la cuticule ventrale, mise en commun de liquide marqué par un colorant sera évident à l'extérieur de la pupe ou va saturer le papier filtre. Il est fortement recommandé de jeter tout pupes qui ont plus d'une ponction cuticule.

jove_content "> Avec les expériences étendues de nombreux laboratoires avec la performance des injections de moustiques adultes, les approches de microinjection identifiées précédemment peut être adapté avec des modifications de protocole simples pour une utilisation dans des expériences de RNAi pupes. Dans l'ensemble, l'objectif de cette méthode est de fournir aux chercheurs la capacité de étendre la période durant laquelle inverse des analyses génétiques peuvent être réalisées, ce qui permet des recherches plus poussées qui appuiera l'élaboration de stratégies de contrôle des vecteurs nouveaux. Fait intéressant, des expériences dans d' autres espèces, telles que Rhodnius prolixus et Spodoptera frugiperda, révèlent que le gène des effets de silence ont tendance à être beaucoup plus lorsqu'ils sont lancés pendant la pré-adulte stades 38,39. au cours de toutes les étapes de développement, gène ARNi à médiation knockdown est soumise à des considérations relatives à la rapidité et la persistance de silençage génique, et la stabilité des protéines codées par des gènes ciblés. la cible idéale ARNi gènes ont tendance à être ceux qui codent un protein ou d' ARN qui a une demi-vie courte et taux de rotation élevé 11,40.

Bien que les stratégies d' ARNi transgéniques peuvent également être utilisés pour répondre à des considérations relatives à la rapidité et à la persistance de l' ARNi au cours des stades pré-adultes, des techniques transgéniques présentent de nombreux inconvénients (par exemple, le temps nécessaire à la génération de lignées transgéniques, des délais expérimentaux pour des accouplements anti - moustiques pour générer des insectes avec l'expression ARNdb réglementé, et le maintien des stocks transgéniques). En revanche, notre protocole offre une méthode plus facile et plus rapide pour lancer knockdown de gènes au cours du développement des pupes et des types de cellules qui proviennent et sont accessibles durant la métamorphose, mais sont moins accessibles chez les adultes. L'utilisation de suspensions ARNdb marqués par un colorant permet d'évaluer facilement le succès de l'injection et la dispersion des matériaux introduits à l'intérieur de chrysalides. Nos données sur l'apparition de la formation de tumeurs chez l'adulte pupes injecté, par rapport aux animaux injectés à l'âge adulte, est compatible avec initiation de knockdown ARNi médiée pendant la phase de chrysalide. En utilisant notre ligne G3 de moustiques et dans nos conditions insectarium, on observe la formation mélanique pseudo-tumeur adulte dès 10 jours après l'injection des adultes injecté trois à cinq jours après la levée. En effectuant l' injection précoce pupe stade, nous observons la formation mélanique pseudo-tumeur visible dès cinq jours après l'injection ( par exemple, trois à quatre jours après la levée). Ces données impliquent que cette méthode permet l' initiation de knockdown de gènes au cours d' une période de développement précédemment sous-étudiés (ie, le développement des pupes). Notre procédé de marquage de colorant peut également se révéler utile pour le développement de nouveaux protocoles d'injection de larves, en raison de la nature translucide de la cuticule pendant tous les stades larvaires. Alors que le contrôle utilisé dans cette étude nécessite la progression vers le stade adulte pour afficher un phénotype knockdown, des expériences futures pour évaluer les phénotypes spécifiques au stade pupes après l'injection de pupes précoce fournirades informations précieuses concernant l'expansion de cette méthode dans les périodes de développement supplémentaires tels que le développement des pupes en retard. En résumé, cette méthode fournit un protocole de RNAi précieux pour l'initiation de stade de pupe de knockdown du gène ARNi médiée et développe les outils génomiques fonctionnels disponibles pour une utilisation au sein de la communauté de recherche insecte vecteur.

Déclarations de divulgation

Open Access pour cette vidéo-article est payé par Biogen.

Remerciements

Nous tenons à remercier la Dre Flaminia Catteruccia et son groupe de recherche (Harvard School of Public Health, Boston, MA) d’avoir fourni à notre laboratoire la colonie G3 utilisée dans cette recherche et pour l’ADN modèle LacZ. Nous remercions Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) pour son aide dans l’entretien de l’insectarium. Le département de biologie du Boston College a généreusement financé la recherche associée au développement de cette technique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit ARNi MEGAscriptAmbionAM1626
Injecteur Nanoject IIDrummond3-000-204
Pédale de commande Nanoject IIDrummond3-000-026
Capillaires en verre borosilicatéDrummond3-000-203-G/X
Extracteur de micropipettes en verreNarishignePB-7
Fast Green Colorant FCFSigmaF7258Peut être remplacé par un colorant alimentaire non toxique.
Pipettes de transfert en plastiqueThermo Scientific1371150¼ ; pouce coupé de la pointe pour créer une ouverture plus large.
Quoi faire » mince" papier filtre  ;GE Healthcare1001-090Il s’agit d’un diamètre de 9 cm de grade 1, mais qui peut être modifié en fonction de la taille du tampon d’injection.
Transfert Western " épais" papier filtreBioRad107-3931C’est le papier filtre généralement utilisé pour les Western blots.
Boîtes de Pétri (60 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875713A
Pinceau (taille 0)Michael' La10474940 et la marque dupinceau peuvent varier en fonction de la disponibilité et des préférences de l’utilisateur.
Microscope optique de dissection  ;----  ;-----Cela peut varier en fonction de la disponibilité et des préférences de l’utilisateur.
taille

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