Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Ex vivo l'imagerie en direct de métastases pulmonaires et leur microenvironnement

12.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/53741

⸱

3 février 2016

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, University of California, 2Hubrecht Institute-Royal Dutch Academy of Science and University Medical Center Utrecht, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode relativement simple pour ex vivo l'imagerie en direct de la tumeur interactions cellule-stroma dans les métastases du poumon, en utilisant journalistes fluorescentes chez la souris. Utilisation à disque rotatif microscopie confocale, cette technique permet de visualiser les cellules vivantes pendant au moins 4 heures et peut être adapté à l'étude d'autres maladies pulmonaires inflammatoires.

Résumé

Métastases est une cause majeure de morbidité et de mortalité liée au cancer. Métastase est un processus en plusieurs étapes et en raison de sa complexité, les processus cellulaires et moléculaires exacts qui régissent la dissémination métastatique et la croissance sont toujours insaisissable. imagerie en temps réel permet de visualiser les interactions dynamiques et spatiales des cellules et leur microenvironnement. des métastases de tumeurs solides couramment dans les poumons. Cependant, la localisation anatomique des poumons constitue un défi pour l'imagerie intravitale. Ce protocole fournit une méthode relativement simple et rapide pour les ex vivo imagerie en temps réel des interactions dynamiques entre les cellules tumorales et leur stroma environnant dans les métastases pulmonaires. En utilisant cette méthode, la motilité des cellules cancéreuses ainsi que les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales dans leur microenvironnement peuvent être visualisés en temps réel pendant plusieurs heures. En utilisant des souris transgéniques reporter fluorescentes, une lignée de cellules fluorescentes, injectable marqué par fluorescencemolécules et / ou des anticorps, de multiples composants du microenvironnement du poumon peuvent être visualisées, par exemple les vaisseaux sanguins et des cellules immunitaires. À l'image des différents types de cellules, un disque rotatif de microscope confocal qui permet l'imagerie en continu à long terme avec, quatre couleurs rapide acquisition d'images a été utilisé. les films en accéléré compilées à partir d'images collectées sur plusieurs positions et plans focaux montrent les interactions entre métastatique en direct et les cellules immunitaires pendant au moins 4 heures. Cette technique peut être en outre utilisé pour tester la chimiothérapie ou la thérapie ciblée. En outre, cette méthode pourrait être adaptée à l'étude d'autres pathologies liées pulmonaires qui peuvent influer sur le microenvironnement du poumon.

Introduction

L’aspect le plus mortel du cancer est les métastases, qui représentent plus de 90 % de la morbidité et de la mortalité liées au cancer1. Les métastases sont un processus en plusieurs étapes et, en raison de sa complexité, les mécanismes cellulaires et moléculaires exacts qui régissent la dissémination et la croissance métastatiques sont encore insaisissables. Pour métastaser, les cellules tumorales de la tumeur primaire doivent se détacher de leurs cellules voisines et de la membrane basale, traverser la matrice extracellulaire, entrer dans les vaisseaux sanguins ou lymphatiques, extravaser au site secondaire et, enfin, survivre et établir des tumeurs secondaires. En plus des propriétés des cellules tumorales, la contribution du microenvironnement, qui comprend le stroma adjacent ainsi que les homologues normaux des cellules cancéreuses, est cruciale pour l’ensemencement et l’établissement des lésions métastatiques2.

Les méthodes traditionnelles d’étude de l’ensemencement et de la croissance métastatiques examinent les états statiques, comme les tissus sont excisés et sectionnés pour l’histologie. Ces données ne génèrent qu’un instantané de ce processus hautement dynamique. Bien que certaines informations utiles puissent être obtenues à partir de ces études, le processus compliqué par lequel les cellules tumorales et stromales interagissent lors de la formation métastatique ne peut pas être évalué de manière adéquate par ces méthodes. De plus, il n’est pas possible d’obtenir des informations sur les schémas de migration des cellules tumorales ou stromales, qui sont importants pour l’établissement d’une colonie sur le site distant. Afin d’étudier efficacement le processus métastatique, il est essentiel de visualiser les différentes interactions entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement de manière continue et en temps réel.

Le poumon est un site fréquent pour les métastases de tumeurs solides comme le cancer du sein, le cancer colorectal, le cancer du pancréas, le mélanome et le sarcome3. L’imagerie intravitale a déjà été utilisée pour étudier l’interaction cellule-cellule dans divers modèles de tumeurs primaires et métastatiques4,5. Des méthodes d’imagerie pulmonaire chez la souris, y compris l’imagerie intravitale, l’imagerie de coupe pulmonaire et un test de métastases pulmonaires ex vivo ont été publiées6–9. L’imagerie intravitale des poumons de souris utilise une fenêtre d’aspiration thoracique pour stabiliser les poumons6. Cette méthode est utilisée pour l’imagerie en accéléré de la microcirculation pulmonaire et des espaces alvéolaires. La position anatomique des poumons pose un défi à l’imagerie intravitale. Afin d’accéder aux poumons, la cavité thoracique doit être ouverte, ce qui entraîne une perte de pression négative et un affaissement des poumons. Cette méthode ne permet de visualiser qu’une petite partie des poumons et est techniquement exigeante ; Une complication inutile dans les études qui examinent des processus indépendants du flux sanguin. De plus, cette méthode nécessite également de bloquer les mouvements causés par la respiration. Cela se fait soit en collectant des images entre les respirations, soit lors d’analyses post-acquisition d’images10. L’imagerie alternative ex vivo en coupe pulmonaire offre stabilité et profondeur, et prépare également le parenchyme pulmonaire à l’immunocoloration7. Cependant, le long processus de sectionnement entraîne un délai important entre le moment du sacrifice de l’animal et le début de la séance d’imagerie. De plus, le processus de section d’un poumon de souris provoque une quantité considérable de mort cellulaire8, interférant ainsi avec la qualité et la quantité d’échantillons d’imagerie et modifiant peut-être inutilement les interactions tumeur-stroma. Afin de faire techniquement le lien entre les méthodes d’imagerie intravitale et d’imagerie de section pulmonaire, tout en exploitant les avantages des deux techniques, une méthode relativement rapide et facile d’imagerie pulmonaire ex vivo a été développée. Cette méthode a été réalisée par imagerie de lobes pulmonaires entiers non sectionnés. Grâce à cette méthode, la motilité des cellules cancéreuses ainsi que les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales dans leur microenvironnement peuvent être visualisées en temps réel pendant plusieurs heures.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les procédures décrites doivent être effectuées conformément aux directives et règlements pour l'utilisation d'animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable de l'institutionnel soins locale Animal Use Commission (IACUC).

1. Génération de métastases pulmonaires pour imagerie ex vivo en direct (transgénique ou veine de la queue Injection)

NOTE: métastases pulmonaires peuvent être générés en utilisant des modèles de souris transgéniques, soit par voie intraveineuse (iv) l'injection des cellules cancéreuses.

  1. Générer des métastases pulmonaires pour l'imagerie en traversant un modèle murin de tumeur par génie génétique dans une souris rapporteur transgénique, par exemple, traverser le modèle murin de cancer du sein, un antigène de souris par le virus de la tumeur mammaire terminale longue milieu répétées polyome T (MMTV-PyMT) 11 dans ACTB-ECFP souris modèle 12.
    NOTE: Le modèle ACTB-ECFP exprime renforcée protéine fluorescente cyan (ECFP) sous la β-acten promoteur de telle sorte que toutes les cellules fluorescentes dans le canal PCP bleu. Cependant, les cellules cancéreuses sont de loin le plus important et apparaissent comme une masse de cellules positives ECFP au microscope. Le modèle de souris MMTV-PyMT développe une maladie progressive, dans lequel la croissance de la tumeur mammaire est associée à la diffusion des cellules cancéreuses de la périphérie, en particulier dans les poumons. Chez les souris MMTV-PyMT sur le FVB / N fond, micrométastases peuvent être observées autour 10-11 semaines d'âge. En général, ces progrès à macrométastases à environ 14 semaines de 13 ans.
    OU
  2. Générer des métastases expérimentales en utilisant des cellules primaires ou des lignées cellulaires syngéniques. Utiliser dans les cellules tumorales in vitro primaire manipulé ou des lignées cellulaires (par ex., La transduction), suivie par 14 injection intraveineuse.
    1. En bref, dans ce protocole, injecter une protéine fluorescente verte (GFP) exprimant (de +) lignée cellulaire MMTV-PyMT dans des souris fluorescentes rapporteurs (ACTB-ECFP) ou des souris de type sauvage. Alors,visualiser ces cellules appelées cellules VO-PyMT 15 en utilisant le canal de la GFP vert.
      NOTE: La ligne d'origine cellulaire VO-PyMT a été dérivée à la Vanderbilt Orthopédie à Nashville, TN. VO signifie Vanderbilt Orthopédie.
    2. Après l'injection de 10 6 cellules (dans 200 ul), d'observer immédiatement et jusqu'à l'extravasation des cellules cancéreuses à quelques heures après l'injection; observer micrométastases entre 1-3 semaines après l'injection et de détecter macrométastases 3 semaines après l'injection 15.
      NOTE: Moins de cellules peuvent être injectées à prolonger la durée de l'injection à la croissance métastatique.

2. L'étiquetage des composants d'intérêt dans le métastatique Microenvironnement (transgénique et / ou injectables)

NOTE: L'étiquetage peut être réalisé par les souris transgéniques et / ou de divers produits injectables. Assurez-vous d'utiliser différentes couleurs fluorescentes pour l'étiquetage des différents types de cellules.

  1. Les composants Label du microenvironnement métastatique utilisant des souris transgéniques. Traverser le modèle de tumeur de souris a été mentionné précédemment (par ex., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) dans un modèle de souris transgénique dans lequel les cellules stromales d'intérêt sont marquées par une protéine fluorescente qui ne ECFP, par ex., C-fms-EGFP 4,16.
    NOTE: En plus de la visualisation de cellules cancéreuses dans le canal PCP, ce qui permet la visualisation de cellules myéloïdes dans le canal 4 de la GFP.
    ET / OU
  2. Étiqueter les différents composants de la micro-métastatique injectables en utilisant des souris transgéniques de rapporteur fluorescent (ou non fluorescent) souris de type sauvage.
    NOTE: Plusieurs composés peuvent être injectés pour marquer diverses composantes du micro-métastatique, par exemple, un anticorps Gr-1 AF647 conjugué est utilisé ici pour identifier les neutrophiles et les monocytes 13 et des différents dextranes de poids moléculaire sont utilisésétiqueter les capillaires pulmonaires. Pour la préparation de ces produits injectables voir l'étape 4.

3. Préparation du matériel avant la dissection

  1. 2% d'agarose
    1. Peser 0,2 g d'agarose et ajouter 10 ml 1 x PBS. Chauffer la solution pour dissoudre la gélose. Agarose se solidifie à température ambiante, afin de maintenir dans un bain-marie à 37 ° jusqu'à l'utilisation de l'inflation.
  2. CO 2 et du contrôleur de température
    1. Vérifiez ddH 2 O dans la chambre d'humidification. Remplir en cas de besoin. Insérez la plaque de configuration dans le support de plaque de palier de température (chambre climatique). Allumez le contrôleur CO 2 et régler CO 2 à 5%. Assurez-vous que le débit d'air est fixé à 0,4 Nl / min.
    2. Ouvrez l'air et de CO 2 soupapes. Mettez le régulateur de température. Assurez-vous que la température de la chambre climatique et le couvercle sont fixés à 37 ° C.
    3. Relâcher la pression de l'air sur le CO 2 mètres. Vérifiez CO 2 de plus en plus, equilibration peut prendre jusqu'à 30 minutes.
  3. disque filage microscope confocal
    NOTE: Détails du microscope set-up ont été décrits précédemment 4,17.
    1. Allumer les lasers (le laser argon pour 488 nm excitation et à l'état solide 405 nm, 561 nm et 640 nm lasers). Allumer le microscope, la caméra, l'unité de commande de disque en rotation, l'AOTF, l'unité de commande de laser et le dispositif de commande de la caméra.
    2. Ouvrez le volet de microscope, tourner sur l'ordinateur exécutant le microscope et ouvrir le logiciel.
  4. Préparation des outils et de la plate-forme de dissection.
    1. Allumez le stérilisateur à billes chaude et laisser atteindre 250 ° C. Nettoyer 2 paires de ciseaux chirurgicaux et des pinces avec de l'eau et du savon. Stériliser les instruments pendant au moins 30 secondes. Laissez les outils se rafraîchir. Utilisez un couvercle de polystyrène comme plate-forme de dissection. Couvrir avec un morceau de laboratoire suintant.

4. Préparation des injections

NOTE: En fonction de la demi-vie et la réponse préférée, injection marqué par fluorescence des anticorps et / ou des molécules fluorescentes, soit immédiatement avant le sacrifice animal ou un couple d'heures à quelques jours avant.

  1. Pour neutrophiles l'image Gr1-positifs et les monocytes, préparer une seringue avec 7 ul d'actions AF647 conjugué Gr-1 anticorps (1 mg / ml) dans 100 pi de PBS stérile sous le capot. Placez une aiguille 27 G ½ sur la seringue.
  2. À l'image des capillaires pulmonaires, préparer une deuxième et une troisième seringue avec 100 ul de 70 kD rhodamine-dextrane conjugué (4 mg / ml) ou de dextran 10 kD AF647-conjugué (4 mg / ml). Placez une aiguille 27 G ½ sur les seringues.
  3. Injecter l'AF647 conjugué solution d'anticorps iv 5 heures avant l'excision des poumons.
  4. Injecter une ou deux solutions de dextran iv immédiatement avant l'excision des poumons.

5. Préparation des poumons pour imagerie ex vivo en direct

NOTE: Essayez de travailler comme stérile et minutieuse que possible pour éviter des difficultés inutiles des cellules immunitaires dans les poumons.

  1. Injecter la souris par voie intrapéritonéale (ip) d'une dose mortelle d'un anesthésique permise par le protocole approuvé par le IACUC animale, par exemple., 1 ml d'Avertin à 2,5%. Attendez que la souris pour arrêter de respirer et être complètement non-réponse à des stimuli nocifs (patte arrière de pincement).
    NOTE: La dislocation cervicale et le dioxyde de carbone de l'euthanasie doit être évitée car elle peut affecter négativement la viabilité des cellules du poumon.
  2. Immobiliser la souris sur une planche de dissection et stériliser la souris avec 70% d'éthanol.
  3. Utilisez des ciseaux chirurgicaux d'abord faire une incision transversale épigastrique à travers la peau, suivie par une incision similaire à travers le péritoine. Tenez la carte de dissection dans une position verticale et couper l'aorte descendante, de sorte que les piscines de sang dans l'abdomen et non pas dans la cavité thoracique.
  4. Spincer une petite ouverture dans la membrane pour libérer le vide. Couper le long du 10e et 12e côte pour exciser le diaphragme et d'obtenir un accès visuel aux poumons.
  5. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la peau jusqu'à la trachée sur la cage thoracique, mais laisser la cage thoracique intacte. Séparer la peau de la cage thoracique. Exposer la trachée en retirant le tissu conjonctif environnant, en faisant attention à ne pas endommager la trachée elle-même (figure 1A).
  6. Couper une petite ouverture d'environ 1 mm de diamètre dans la trachée parallèlement exposé aux anneaux cartilagineux, au plus près du larynx que possible (figure 1B). Veillez à ne pas couper complètement à travers la trachée.
  7. Prenez une aiguille 20 G et insérer délicatement l'aiguille 4-5 mm dans la trachée sans force contre (figure 1D). L'extrémité de l'aiguille doit être visible à travers la trachée (figure 1C). Utiliser une pince pour stabiliser l'aiguille dans la trachée. Alternativement, une suture peut être lié around la trachée pour maintenir l'aiguille en place.
    NOTE: En insérant trop profonde, la carène peut être traumatisé ou seulement un côté des poumons pourrait être gonflé.
  8. Remplir une seringue avec 400 ul de 37 ° C 2% d'agarose à faible température de fusion (pris directement à partir d'un bain à température constante). Assurez-vous que le conseil de dissection est debout et instiller lentement l'agarose chaud à travers l'aiguille dans les poumons, utilisez ~ 400 pi pour gonfler les poumons.
    NOTE: Suivre les poumons de gonflage à l'intérieur de la cage thoracique. Ne pas trop gonfler le poumon comme il se rompt.
  9. Une fois que les poumons sont gonflés, le remplissage ~ ⅔ de la cage thoracique, détacher la seringue et maintenir l'aiguille à l'intérieur de la trachée pour empêcher toute fuite d'agarose.
  10. Verser environ 50 ml de 20 ° C PBS sur les poumons gonflés pour permettre la gélose dans les poumons de fixer et de se solidifier. Retirer lentement l'aiguille et fermer la trachée avec une pince pour éviter toute non-solidifié agarose de fuir.
  11. Exposer les poumons en effectuant une sternotomie et exciser ensuite les poumons. Pour excision des poumons, tenir à la trachée tout en coupant à travers la trachée complètement. Tirez doucement sur ​​la trachée jusqu'à, couper le tissu conjonctif et de l'œsophage, tout en tirant les poumons de la cavité de la poitrine jusqu'à ce que les poumons est séparée de la souris (figure 1E).
  12. Plonger les poumons à chaud RPMI-1640 pour laver le sang excessive et séparer délicatement les lobes en utilisant ciseaux et des pinces pour couper la tige principale des bronches des lobes à hile (figure 1F).
  13. Placer les lobes avec la surface plate afin de maximiser la surface d'imagerie, dans un puits d'une plaque de formation d'image à 24 puits (figure 1G). Ajouter 100 ul de 37 ° C le milieu RPMI-1640 au-dessus des lobes. Placer plusieurs lames de microscope de couverture circulaire 15 mm au-dessus des lobes pour l'empêcher de flotter.
  14. Verser chaud PBS dans les puits environnants pour empêcher les médias RPMI-1640 de évaporateurcolla-. Insérer la plaque à 24 puits dans la chambre climatique équilibrée et maintenir les lobes pulmonaires à 37 ° C avec de l'air et 5% de CO 2. Insérez la chambre climatique sur la scène du microscope confocal.
    NOTE: D'autres mélanges de gaz (par exemple, 5% O 2, 5% de CO 2 en N 2 d'examiner le comportement des cellules dans des conditions d'hypoxie / oxygène plus faible) pourrait également être envisagée.

figure-protocol-1
Figure 1. Le protocole de préparation des poumons pour l'imagerie en temps réel. (A) l'exposition de la trachée après la préparation de la souris. (B) Petit snip faite dans la trachée parallèlement exposé aux anneaux cartilagineux. (C) 20 aiguille G 5.4 mm insérée dans la trachée. (D) L'instillation de 400 ul de 2% à faible température de fusion d'agarose dans les poumons. (E) InflATED poumons séparés de la souris. (F) lobes séparés après inflation. (G) lobes placé dans un puits d'une plaque d'imagerie de 24 puits. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

6. Acquisition et analyse d'images

Remarque: Les images peuvent être acquises avec une variété de disque rotatif microscopie confocale pris en charge par les différents logiciels. Dans ce protocole, soit μManager avec un disque filer microscope confocal sur-mesure ou Zen avec un disque filer microscope confocal disponible dans le commerce est utilisé pour l'acquisition de l'image, tout en Imaris est utilisé pour l'édition et l'analyse vidéo.

  1. Acquérir des images à l'aide de μManager. Une étape détaillé par le protocole d'étape pour l'acquisition d'images en utilisant un logiciel μManager est décrit précédemment 18.
    OU
  2. acquérir des imagesen utilisant un logiciel d'analyse d'image tels que Zen (voir Figure S1).
    1. Cliquez sur l'onglet «Localiser», et choisissez objectif (10x ou 20x) dans le «Chemin de Lumière 'outil (Figure S1A, boîte rouge). Par la suite, cliquez sur "Eyes - DAPI 'à regarder le canal PCP à travers l'oculaire (Figure S1A, boîte bleue). Localiser l'échantillon manuellement à l'aide du microscope. Cliquez sur "Tout Off'after le tissu est centre du champ de vision.
    2. Cliquez sur l'onglet «Acquisition» pour régler tous les paramètres d'acquisition d'images.
    3. Dans l'outil «canaux», cliquez sur le bouton '+' (Figure S1B, boîte rouge). Un menu pop-up apparaît et la recherche pour le colorant (s) présent dans l'échantillon dans la «base de données Dye '(Figure S1B). Sélectionnez le colorant et cliquez sur "Ajouter".
      NOTE: Le programme sera mis tous les filtres à être optimisés. Un colorant peut être suppriméen le sélectionnant suivi en cliquant sur ​​le bouton de la corbeille (Figure S1B, boîte jaune).
    4. Dans le menu "Mode d'acquisition ', set' Binning» pour 5x5. Double-cliquez sur ECFP dans le menu des canaux pour le sélectionner. Abaisser la puissance du laser à 20% si l'échantillon ne sera pas blanchie lors de la configuration des paramètres d'acquisition d'images.
    5. Cochez la case 'Tuiles »dans la section« Experiment Manager' et l'outil de tuiles apparaît dans le groupe de l'outil «multidimensionnelle Acquisition» (Figure S1C). Cliquez sur le bouton 'Configuration avancée' pour voir l'image en direct de la caméra. Cliquez sur le bouton "Ajouter" dans la section "Positions de d'ajouter 4 à 6 positions à l'expérience. Pour supprimer une position, sélectionnez cette position et cliquez sur le bouton de la corbeille.
    6. Dans le groupe «Acquisition paramètre 'outil, ouvrir l'outil« Stratégie Focus », et sélectionnez« Absolute fixe position Z 'dans la liste déroulante.
    7. Cochez la case Z-Stack dans la section «Experiment Manager 'et l'outil Z-Stack apparaît dans le groupe de l'outil« multidimensionnelle Acquisition »(Figure S1D). Double-cliquez sur l'une des positions dans la section «positions» et appuyez sur 'Live'. Définir manuellement premier et définir dernière position du domaine de l'imagerie. Définir l'intervalle à 4 pm.
      NOTE: Le programme permettra de déterminer le nombre de tranches pour la gamme choisie et l'intervalle. Idéalement, 5-7 tranches sont pratiques pour permettre la visualisation suffisante et acquisition rapide des images.
    8. Cochez la case 'Time Series dans la section «Experiment Manager'. Set souhaité 'Durée' et les temps "intervalle" dans l'outil 'Time Series qui est apparu dans le groupe d'outils «multidimensionnelle Acquisition» (Figure S1E).
    9. Dans le '' acquisitionMode tion 'menu, mis' Binning »pour 2x2. Double-cliquez sur un fluorophore dans le menu des canaux pour le sélectionner et d'augmenter la puissance du laser à 100%. Appuyez sur 'Live' et régler le «temps d'exposition». Répétez cette opération pour chaque fluorophore.
    10. Cochez la case 'Activer Auto Save "boîte. Sélectionnez un dossier et tapez le nom du fichier. Toutes les images acquises seront automatiquement enregistrés dans ce dossier.
    11. Cliquez sur 'Début de l'expérience »dans la section« Experiment Manager' pour lancer l'acquisition d'images.
  3. Après l'acquisition de l'image, compiler les données brutes dans les logiciels Imaris. Convertir des images en .ims fichiers et des ajustements peuvent être faits. Une étape détaillé par le protocole de l'étape de conversion des fichiers, faire des ajustements et des films d'épargne utilisant Imaris est décrit précédemment 18.
  4. Lors de l'enregistrement du film, réglez le "Frame Rate" à 5 images par seconde (fps).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

En utilisant la microscopie confocale à disque tournant, les différents systèmes de modèles de souris et injectables, le micro-métastatique peut être visualisée et suivi dans le temps. Utilisation d'un MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP modèle de souris transgénique triple, différents composants cellulaires sont marquées par fluorescence (Figure 2A, Film 1). La structure typique du parenchyme pulmonaire peut être visualisé dans le canal PCP étant donné que to...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Ce manuscrit décrit une méthode détaillée pour ex vivo l'imagerie en direct de métastases du poumon chez des souris modèles de métastases. Ce protocole d'imagerie fournit une visualisation directe des interactions tumeur-stroma cellulaire et dynamiques spatiales dans le microenvironnement du poumon. Il est une méthode relativement simple et rapide qui permet l'imagerie fiable de métastases pulmonaires pendant au moins 4 heures. Films acquises à partir de ces expériences peuvent être utilisés pour su...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer. Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux protocoles approuvés par l’IACUC, UCSF.

Remerciements

Nous remercions Nguyen H. Nguyen pour son aide technique et Audrey O’Neill pour son soutien avec le microscope confocal à disque rotatif Zeiss Cell Observer. Ce travail a été soutenu par une bourse postdoctorale du ministère de la Défense (W81XWH-11-01-0139) et le Weizmann Institute of Science-National Postdoctoral Award Program for Advancing Women in Science (à V.P.).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Souris MMTV-PyMT/FVB JacksonLaboratory2374Souris femelles
Souris ACTB-ECFP/FVBUCSF Werb labSouris femelles
c-fms-EGFP/FVBUCSF Werb labSouris femelles
FVBLaboratory Jackson Laboratory1800Souris femelles
GFP+ VO-PyMT cellulesUCSF Werb lab
70,000 kDa Dextran, conjugué à la rhodamineInvitrogenD1818Diluer à 4 mg/ml dans 1 x PBS et stocker à -20 °C. Utiliser 0,4 mg par animal.
10 000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjuguéInvitrogenD22914Diluer à  ; 4mg/ml dans 1 x PBS et stocker à -20  ; ° ;C. Utiliser 0,4 mg par animal.  ;
Anticorps anti-souris Gr-1 Alexa Fluor 647UCSF Noyau d’anticorps monoclonalStock 1mg/ml. Utiliser 7 ug par animal.
Anesthésie anesthésiqueapprouvée par l’IACUC, utilisée pour l’anesthésie et/ou l’euthanésie
1X PBSUCSF installation
PBS, USP stérile  ;Amresco INCK813-500MLQualité ultra pure pour l’injection intraveineuse
Plate-formeSera utilisée comme planche de dissection
Ciseaux fins tranchants  ;Fine Science Tools14060-11
ForcepsRoboz Surgical StoreRS-5135
Stérilisateur à billes chaudesFine Science Tools18000-45Allumer 30 minutes avant utilisation
AirUCSF
OxygèneUCSF
Dioxyde de carboneUCSF
Seringue de 1 mL sans aiguille  ;BD309659
27 G x 1/2 aiguille   ;BD305109pour injection intraveineuse
20 G x 1 aiguille, biseau court.   ;BD305178
Agarose à basse température de fusion  ;Lonza50111Pour faire 10 ml de solution, peser 0,2 g d’agarose, ajouter à 10 ml 1 x PBS et chauffer pour dissoudre. L’agarose se solidifie à température ambiante, alors maintenez-la à une température de 37 ° ; C jusqu’à ce qu’il soit utilisé pour le gonflage.
RPMI-1640 milieu sans rouge de phénolLife Technologies11835-030
Plaque d’imagerie 24 puits  ;E& K scientificEK-42892
Lames de protection en verre, 15 mm  ;Fisher Scientific22-031-144
Régulateur numérique de CO2 et de températureOkolabDGTCO2BXhttp://www.oko-lab.com
Chambre climatiqueOkolabhttp://www.oko-lab.com
Cell Observer microscope confocal à disque rotatifLogiciel Zeiss
Zen
Carl Zeiss IncZeiss Axiovert 200M
Caméra ICCDStanford PhotonicsXR-Mega-10EX S-30
Tête de balayage confocale à disque rotatifYokogawa CorporationCSU-10b
ImarisBitplane
mManagerVale lab, UCSFLogiciel open source
souris de culture cellulaire en polystyrène Microscope inversé Zeiss

Références

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  7. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live imaging of the lung. Cur Protoc Cytom. , (2012).
  8. Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung. J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).
  9. Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  10. Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity. Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).
  11. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
  12. Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  13. Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).
  14. Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Curr Protoc Immunol. , (2006).
  15. Halpern, J., Lynch, C. C., et al. The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction. Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).
  16. Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  17. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).
  18. Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy. J Vis Exp. (92), (2014).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer cell. 21 (4), (2012).
  20. Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice. J Vis Exp. (54), (2011).
  21. Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Wong, C. W., Song, C., et al. Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung. Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).
  23. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
  24. Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), (2014).
  25. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).
  26. Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28 (2), (2000).
  27. Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer. Immunotherapy. 4 (3), (2012).
  28. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).
  29. Kreisel, D., Nava, R. G., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Interactions stroma-tumeurmicroscopie confocale à disque rotatifsouris rapporteurs fluorescentesimagerie en accélérémotilité des cellules cancéreusesinteractions des cellules immunitairesinflation pulmonaire à l'agarosevisualisation du microenvironnement
Ex vivo l'imagerie en direct de métastases pulmonaires et leur microenvironnement
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.