Article de méthode

Immunocoloration phospho-épitopes dans ciliées organes de Mont entiers embryons de poissons zèbres

DOI :

10.3791/53747

⸱

19 février 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

Dans cet article

Résumé

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Techniques sont décrites à immunocoloration phospho-épitopes dans embryons de poisson zèbre entiers et ensuite procéder à deux couleurs confocal fluorescent localisation dans des structures cellulaires aussi petites que les cils primaires. Les techniques de fixation et d'imagerie peuvent définir l'emplacement et de la cinétique de l'apparition ou de l'activation de protéines spécifiques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prolifération rapide des cellules, l'expression tissu-spécifique des gènes et de l'émergence de réseaux de signalisation caractérisent le développement embryonnaire précoce de tous les vertébrés. La cinétique et l'emplacement des signaux - même à l'intérieur des cellules individuelles - dans l'embryon en développement complète l'identification des gènes du développement importants. immunocoloration techniques sont décrites qui ont été montré pour définir les cinétiques de signaux intracellulaires et des animaux entiers dans des structures aussi petites que les cils primaires. Les techniques de fixation, d'imagerie et de traitement des images en utilisant un laser à balayage composé microscope confocal peut être complété en aussi peu que 36 heures.

Le poisson zèbre (Danio rerio) est un organisme souhaitable pour les enquêteurs qui cherchent à mener des études dans une espèce de vertébré qui est abordable et pertinente à la maladie humaine. KO ou passes rabattues génétiques doivent être confirmées par la perte du produit protéique réelle. Cette confirmation de la perte de protéinespeut être réalisée en utilisant les techniques décrites ici. Des indices dans les voies de signalisation peuvent également être déchiffrés en utilisant des anticorps qui sont réactifs avec des protéines qui ont été modifiées après la traduction par phosphorylation. La préservation et l'optimisation de l'état phosphorylée d'un épitope est donc essentiel de cette détermination et est accompli par ce protocole.

Cette étude décrit les techniques pour fixer des embryons au cours des premières 72 heures de développement et de co-localiser une variété d'épitopes pertinents avec cils dans des vésicules (KV) de l'Kupffer, le rein et l'oreille interne. Ces techniques sont simples, ne nécessitent pas de dissection et peut être complété en une période relativement courte de temps. Projection des piles d'images confocale en une seule image est un moyen utile de présenter ces données.

Introduction

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Les techniques décrites ici sont le résultat d’études qui ont cherché à définir des cibles en aval des signaux Ca2+ lors d’événements qui se produisent au cours du développement précoce, y compris la fécondation, la gastrulation, la somitogenèse et la formation du tronc, de l’œil, du cerveau et des organes. 1-3 Les découvertes initiales de la signalisation embryonnaire Ca2+ dépendaient de l’utilisation d’indicateurs Ca2+ naturels et modifiés, tels que l’aequorin4 et le fura-2. 5 Même avec la technologie actuelle, la détection d’élévations transitoires de Ca2+ nécessite des outils analytiques encombrants et ne révèle pas les cibles de ces signaux Ca2+.

Ce laboratoire étudie les signaux Ca2+ qui agissent par l’intermédiaire de la protéine kinase (multifonctionnelle) dépendante de Ca2+/calmoduline connue sous le nom de CaMK-II, une enzyme enrichie dans le système nerveux central et identifiée à l’origine comme un régulateur de la potentialisation à long terme. 6 Le CaMK-II n’est pas spécifique au cerveau, il est largement exprimé et hautement conservé tout au long de la vie et des corps d’espèces dans tout le règne animal, y compris les invertébrés. Le 7,8 CaMK-II a la capacité unique de maintenir sa propre activité même après que les niveaux de Ca2+ aient diminué en raison de sa capacité à s’autophosphoryler à Thr287. Dans cet état autophosphorylé, CaMK-II reste actif de manière indépendante du Ca2+/CaM, jusqu’à ce qu’il soit déphosphorylé. 6 Ainsi, la localisation du CaMK-II phosphorylé (Thr287) permet d’identifier les cellules dans lesquelles des élévations naturelles et pertinentes de Ca2+ se sont produites.

Un anticorps dirigé contre le CaMK-II de mammifère autophosphorylé (P-Thr287) a été bien caractérisé et a été initialement utilisé pour localiser le CaMK-II activé dans le tissu cérébral. 9 Le poisson-zèbre (Danio rerio) possède sept gènes CaMK-II10,11 dont les produits protéiques contiennent une séquence de MHRQE[pT287]VECLK dans cette région. 10,11 Cette séquence est très similaire à l’antigène phosphopeptide utilisé pour créer cet anticorps polyclonal de lapin (MHRQE[pT]VDCLK ; Upstate/Millipore) et il n’était donc pas totalement surprenant que cet anticorps ait réagi de manière croisée avec le poisson zèbre CaMK-II. Ce laboratoire a montré que cet anticorps réagit avec le poisson zèbre CaMK-II proportionnellement à l’autophosphorylation et à l’activité indépendante du Ca2+/CaM. 12 Il a également été démontré que d’autres anticorps Pan-Specific CaMK-II réagissent de manière croisée avec le CaMK-II du poisson-zèbre. 13

Cet anticorps a été utilisé pour démontrer que le poisson zèbre CaMK-II est préférentiellement activé dans les cellules situées d’un côté de la vésicule de Kupffer (KV) du poisson zèbre, l’organe cilié nécessaire à l’établissement de l’asymétrie gauche/droite. 12 Cet anticorps a été utilisé pour démontrer que CaMK-II est activé transitoirement dans quatre cellules adjacentes du côté gauche du KV au cours de la même phase de développement que celle où le positionnement de l’organe est déterminé. 12 En plus de la vésicule de Kupffer (KV), l’autophosphorylation (P-T287) était également localisée dans des sites intracellulaires spécifiques dans d’autres tissus ciliés, notamment le rein, les neuromastes et l’oreille interne. 12,13 Dans le rein du poisson-zèbre, le P-T287-CaMK-II est enrichi le long du bord apical des cellules canalaires ciliées et à l’intérieur des cils cloacaux où il influence leur assemblage. 13 Enfin, dans l’oreille interne en développement, le P-T287-CaMK-II est intensément concentré à la base des cils et influence la différenciation cellulaire par la voie du signal Delta-Notch. 14 En résumé, la détection de CaMK-II activé a permis d’identifier des sites de libération intracellulaire de Ca2+ et d’éclairer de nouvelles voies de signalisation potentielles.

Ces découvertes dépendaient entièrement du développement d’une méthode sensible et précise pour localiser le CaMK-II activé (P-T 287-autophosphorylé). Les méthodes de fixation et d’immunocoloration du poisson-zèbre KV, des reins et de l’oreille interne sont décrites. Les limites de cette technique sont également décrites. Ces techniques devraient être utiles à tout chercheur qui cherche à obtenir des images à haute résolution dans deux canaux fluorescents non seulement de phospho-épitopes, mais de n’importe quel épitope, au cours du développement précoce des vertébrés.

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Protocole

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Les procédures de poisson zèbre dans ce protocole ont été approuvés par la Commission institutionnelle animal soin et l'utilisation (IACUC) à l'Université Virginia Commonwealth.

1. Préparation des réactifs

  1. 4% PFA / PBS. Peser 8 g de paraformaldehyde (PFA) dans la hotte. Alors qu'il était encore dans la hotte, dissoudre le PFA sec ~ 80 ml ​​de H 2 O distillée sous agitation et chauffage à 50 ° C. Tout en remuant, ajouter 3 - 10 gouttes de 1N NaOH frais jusqu'à ce que PFA est complètement dissous et une solution précise. Retirer du feu et ajouter 100 ml 2x tampon phosphate salin (PBS). Porter le volume à 200 ml d'eau distillée H 2 O. Refroidir à température ambiante et de confirmer pH de 7,4 avant utilisation. A conserver dans l'obscurité à 4 ° C, mais utiliser dans la semaine.
  2. Utiliser 100% de méthanol sans suppléments. Utiliser 95% d'éthanol sans suppléments.
  3. Préparer tamponnée au phosphate Tween (PBT). Compléter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1% de Tween-20. Ajouter 0.5 ml d'une Tween-20 solution stock de 20% à 100 ml de PBS 1X. Stocker à température ambiante.
  4. Préparer tamponnée au phosphate Triton-X (PbTx). Supplément PBS avec 0,1% de Triton X-100. Ajouter 0,5 ml d'un 20% de Triton X-100 actions pour 100 ml de PBS. Stocker à température ambiante.
  5. Préparer 10% NGS / PbTx. Normales blocs de sérum de chèvre (NGS) sites de liaison non spécifiques. NGS Stocker à -20 ° C. Pour l'utiliser, ajouter 1 ml à 9 ml PbTx.
  6. Préparer glycerol à 50% / PBS. Mélanger des parties égales de fond 2x PBS et 100% de glycérol. Stocker à température ambiante.

2. Fixation Embryo

  1. . (. Par exemple, β-actine: CAAX-GFP) Elevage Obtenir de type sauvage (AB et WIK) ou transgéniques embryons par des accouplements naturels. Si vous le souhaitez, d'injecter des embryons avec des constructions ou morpholinos, comme décrit. 15,16
  2. Lever embryons. Recueillir les embryons et incuber à 28,5 ° C en présence de 0,003% 1-phényl-2-thiourée (PTU) pour bloquer la pigmentation tel que décrit. 17 p>
  3. Fix. Lorsque les embryons ont atteint le stade de développement souhaité, 18,   anesthésier les embryons en utilisant MESAB, éliminer l'eau du système autant que possible et d'ajouter frais 4% PFA / PBS pendant 3-4 heures à température ambiante. NOTE: À certains moments de moins de 20 heures après la fécondation (HPF), fixer avant dechorionation. Parfois, après 20 HPF, dechorionate avant la fixation à l'aide de deux paires de pince fine point sous un microscope de dissection.
  4. Modification de solutions. Transfert d'embryons en utilisant une pipette de grand calibre, comme décrit. 17 Changer les solutions dans 1,5 ml plafonnés microtubes, simplement en permettant aux embryons de régler par gravité, sans centrifugation.
  5. Post-fixateur Après 3 -. 4 heures, retirer PFA / PBS, remplacer par 100% de méthanol et conserver à -20 ° C pendant au moins 48 heures. NOTE: Pour maximal immunoréactivité P-CaMK-II, limiter la durée totale de stockage de méthanol pour une semaine.
"> 3. Immunocoloration Whole embryons

  1. Placez un minimum de 10 embryons pour chaque condition expérimentale en coiffé tube de 1,5 ml, et de les étiqueter.
  2. Autoriser les embryons de se déposer. Enlever et jeter le methanol et réhydrater avec des lavages progressifs contenant 0,5 ml de concentrations décroissantes d'éthanol, comme indiqué dans l'étape suivante. Chaque étape est un lavage de 5 min à bascule.
  3. Progressivement réhydrater avec ces 5 solutions: 66% éthanol / 33% PbTx, 33% éthanol / 66% PbTx, 100% PbTx, 100% PbTx (ce qui est la première répétition de PbTx), 100% PbTx (ce qui est la seconde répétition de PbTx).
  4. Retirer dernier lavage PbTx. Ajouter 0,5 ml 10% NGS / PbTx. Incuber pendant au moins 1 heure à température ambiante avec doux balancement puis enlever et jeter la solution.
  5. Préparer une solution d'anticorps primaire par dilution dans 10% de NGS / PbTx. Si co-immunologique, utilisez anticorps d'affinité plus élevée en premier. Pour cette étude, l'incubation avec l'anticorps monoclonal de la tubuline de souris anti-acétyle dilué à 1: 500. pour example, s'il y a des 10 échantillons, le regroupement de 6 pi de la solution d'anticorps boursier avec 3 ml de 10% NGS / PbTx puis distribuer 0,3 ml de ce dans chaque tube.
  6. Ajouter 0,2 - 0,5 ml de l'anticorps primaire dilué dans chaque tube pour immerger les embryons. Incuber avec doux balancement O / N à température ambiante.
  7. Dans la matinée, enlever et jeter la solution d'anticorps. Ajouter 0,5 ml de 2% NGS / PbTx pour laver anticorps primaire excès. Agitez doucement pendant 5 min. Retirez et jetez solution. Répéter deux fois.
  8. Dim plafonniers et diluer l'anticorps secondaire fluorescent conjugué appropriée dans 10% NGS / PbTx sorte que chaque état contient au moins 0,5 ml. Avec l'anticorps primaire tubuline souris anti-acétyle, utilisez la chèvre de colorant vert fluorescent IgG anti-souris à une dilution de 1: 500.
  9. Incuber anticorps secondaire pendant 4 heures avec doux balancement à la température ambiante dans l'obscurité. A partir de maintenant, traiter les échantillons sous les lumières tamisées et incuber dans un récipient sombre ou en l'enveloppant dans du papier aluminium.
  10. A la fin de l'incubation, retirer et jeter la solution d'anticorps secondaire. Ajouter 0,5 ml de 2% NGS / PbTx à laver. Agitez doucement pendant 5 min. Retirez et jetez solution. Répéter deux fois.
  11. Si co-immunologique, obtenir la deuxième anticorps primaire d'une espèce différente que le premier anticorps primaire. Dans ces études, suivre l'anticorps de lapin anti-phospho CaMK-II par le colorant conjugué anticorps de chèvre anti-lapin anticorps secondaire fluorescent rouge-IgG.
  12. Diluer de lapin anti-phospho-CaMK II anticorps 1:20. Pour chaque tube d'embryons, de suspendre dans 0,3 ml 10% NGS / PbTx, puis ajouter 15 pi de la solution d'anticorps de stock.
  13. Veiller à ce que les embryons sont immergés et lumières sont tamisées. Incuber avec douceur O bascule / N à la température ambiante dans l'obscurité.
  14. Dans la matinée, sous les lumières tamisées, enlever et jeter la solution d'anticorps. Ajouter 0,5 ml de 2% NGS / PbTx. Agitez doucement pendant 5 min. Retirez et jetez solution. Répéter deux fois.
  15. Gardez plafonniers sombre et assez de la fluorescence Conju appropriée diluerun anticorps secondaire fermée de sorte que chaque état contient au moins 0,5 ml. Dans cette étude, on dilue le colorant conjugué de chèvre anti-anticorps de lapin IgG rouge fluorescent secondaire (canal rouge) 1: 500 dans 10% de NGS / PbTx.
  16. Incuber deuxième anticorps secondaire pendant 4 heures avec doux balancement à la température ambiante dans l'obscurité.
  17. A la fin de cette incubation et sous les lumières tamisées, enlever et jeter la solution d'anticorps secondaire. Ajouter 0,5 ml PbTx. Agitez doucement pendant 5 min. Retirez et jetez solution. Répéter deux fois. Magasin à PbTx ou soit 50% de glycérol / PBS en fonction de la procédure d'imagerie.

4. imagerie confocale et traitement

  1. Mont embryons pour l'imagerie. Placez 1 - 5 embryons sur une lame de verre. Créer une chambre entre la lamelle et la lame principale en utilisant des fragments de lamelle de chaque côté de la chambre. Typiquement, quatre n ° 1 des lamelles sont utilisés pour fabriquer ces espacement des piles sans étanchéité.
    NOTE: Aucune milieu de montage est nécessaire.
  2. Utiliser une immersion dans l'huile 100Xobjectif d'apporter seul embryon au point en utilisant la lumière transmise. Éteins la lumière. Allumez microscope confocal. Veiller à ce que les lasers appropriés (vert et / ou rouge) sont allumés et à distance accent complice est engagé.
  3. Allumez le programme confocal. Dans la "barre de Acquire", sélectionnez l'objet propre. Dans la barre "XY de base", définir la taille de l'image à 1024 en cliquant sur le bouton 1024.
  4. Dans le "Laser et Detector" bar, cliquez sur la case 488 rouge et le 568 boîte verte pour activer le laser et le détecteur pour chaque canal. Set sténopé à moyen et à régler le gain dans la barre "Gain" de chaque canal à visualiser.
  5. Dans la barre «acquérir Paramètres", cliquez sur "Live" pour commencer l'acquisition d'images. Dans la barre "Paramètres d'affichage", décochez la case "force intégrale Zoom" du centre dans la fenêtre "Live".
  6. Dans la barre "Acquérir Paramètres", sous l'onglet "Z", l'étape à travers les couches de l'image. Après avoir sélectionné le numbre de sections optiques à intégrer dans l'image, passer à un certain moment dans le «centre» du plan z.
  7. Sous l'onglet "Z", cliquez sur la petite boîte rouge "de référence". Ce sera zéro la RFA au point choisi comme le «centre». Dans la case "Taille de l'étape", sélectionnez l'épaisseur des couches (entre 0,25 um et 2,0 um est idéal). Faites attention à la case «Taille du fichier» et essayer de limiter à 1 Go.
    NOTE: En général, jusqu'à 40 sections optiques de 0,5 à 1,0 um sont obtenues, mais le nombre de sections peut être déterminé de manière empirique.
  8. Pour trouver l'extrême haut de l'image, cliquez sur le cercle à côté de "Top" et se déplacer à travers les couches z. Maintenant, cliquez sur le cercle à côté de "Bas", l'ordinateur prendra l'image sur la couche en tant que centre. se déplacer à nouveau à travers les couches de trouver l'extrême bas de l'image.
  9. Cliquez sur "Live" à nouveau dans les «acquérir Paramètres" boîte pour arrêter le laseracquisition. Dans ce panneau, cliquez sur les cases rouges marqués moyenne et Z-stack. Ces boîtes devient vert.
  10. Dans la zone «acquérir Paramètres", cliquez sur "Single" d'acquérir la totalité des séries d'images. Vous pouvez suivre les progrès qui scrute dans les deux canaux et à travers toute la z-stack.
  11. Pour enregistrer, cliquez sur la fenêtre du volume et cliquez sur "enregistrer sous" et nommez le fichier. Enregistrer comme ".ids" fichier. Au volume rendre le fichier alors que le z-stack est toujours ouverte, sélectionnez les données menu déroulant et cliquez sur «volume render". Enregistrez le fichier rendu sous forme de fichier TIFF. Ceci est l'image projetée qui sont présentées dans cette publication.

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Résultats

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Conditions optimales pour la visualisation de phospho-épitopes

Des procédés décrivant l'immunolocalisation des epitopes protéiques dans embryons de poisson zèbre ont été relativement peu par rapport à celles de localisation d'ARNm par hybridation in situ. Fixateurs utilisés dans la localisation des épitopes des protéines dans les cellules ciliées des embryons de poisson zèbre ont inclus 4% PFA / PBS e...

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Discussion

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La méthode / méthanol PFA a été développé dans ce laboratoire avec l'objectif principal d'optimiser la immunolocalisation du -CaMK-II épitope phospho-T 287 au cours du développement du poisson zèbre. Cette méthode localisée succès P-CaMK-II lors de la formation de plusieurs organes ciliées dont le KV de poisson zèbre, 12 oreille interne 14 et les reins. 13 en particulier au stade de KV, cette technique était nécessaire. Le succès de cette méthode est probablement due à...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation subvention IOS-0817658.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-phényl-2-thiourée (PTU)SigmaP-7629Solution mère à 0,12 %. Diluer 1:40 dans l’eau du système
Alexa488 anti-souris IgGLife TechnologiesA11001Polyclonal de chèvre, utilisation à 1:500
Alexa488 anti-lapin IgGLife TechnologiesA11008Polyclonal de chèvre, utilisation à 1:500
Alexa488 phalloïdineLife TechnologiesA12379Se lie préférentiellement à l’actine F
Alexa568 anti-souris IgGLife TechnologiesA11004Polyclonal de chèvre, utilisation à 1:500
Alexa568 anti-lapin IgGLife TechnologiesA11011Polyclonal de chèvre, utilisation à 1:500
anti-acétylé α ;-tubulineSigmaT7451Souris monoclonale, utilisation à 1:500
anti-phospho-T287 CaMK-IIEMD Millipore06-881Polyclonal de lapin, utilisation à 1:20
anti-total CaMK-IIBD Biosciences611292Souris monoclonale, utilisation à 1:20
ÉthanolFisherS96857Qualité laboratoire, 95 % dénaturé
PincesOutils de sciences fines11252-20Dumont #5
Lamelles en verreVWR16004-330#1  ; épaisseur
Lames de microscope en verreFisher12-550-15Lames en verre standard
MéthanolFisherA411Conserver au congélateur
Tubes de microcentrifugationVWR20170-038Tubes bouchés, non stériles
Sérum de chèvre normalLife Technologies16210-064Tubes aliquote de 1 ml, conserver au congélateur
ParaformaldéhydeSigmaP-6148Qualité réactif, cristallin
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Qualité Biologique119-069-13110x solution mère ou fabriquée en laboratoire
Triton X-100SigmaBP-15110 % solution dans l’eau, stocker chez RT
Tween-20Life Technologies8511310 % solution dans l’eau, stocker chez RT
Compoundmicroscope NikonE-600Monture sur table sans vibration
C1 Plus deux lasers confocal à balayage NikonC1 PlusExécuté par le programme EZ-C1, mais les mises à niveau utilisent " Éléments"

Références

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Mots-clés

Microscopie confocaleFixation au PFA et au m thanolTubuline ac tyl ephospho CaMKIIV sicule de KupfferImagerie sur montage entierBalayage laser

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