Le séquençage de l'usine mur hétéroxylanes Utilisation enzymatique, chimique (méthylation) et physiques (spectrométrie de masse, résonance magnétique nucléaire) Techniques

Résumé

Ce protocole décrit les techniques spécifiques utilisées pour la caractérisation structurale de l’extrémité réductrice (RE) et de la (les) séquence(s) glycosylique(s) de la région interne des hétéroxylanes en marquant l’ER avec 2 aminobenzamides avant l’hydrolyse enzymatique (endoxylanase), puis en analysant les oligosaccharides résultants à l’aide de la spectrométrie de masse (MS) et de la résonance magnétique nucléaire (RMN).

Résumé

Ce protocole décrit les techniques particulières utilisées pour la caractérisation de l'extrémité réductrice (RE) et la séquence de glycosyle région interne (s) du hétéroxylanes. Les parois cellulaires endosperme de blé de-amidonnés ont été isolés comme un résidu insoluble dans l' alcool (AIR) ¹ et séquentiellement l' extrait avec de l' eau (W-sol Fr) et de KOH 1 M contenant 1% de _NaBH4 (KOH-sol Fr) tel que décrit par Ratnayake et al. , (2014) ^2. Deux approches différentes (voir le résumé dans la figure 1) sont adoptées. Dans la première, W AX-sol intactes sont traitées avec 2AB pour marquer le résidu initial de sucre dans la chaîne du squelette RE et ensuite traités avec une endoxylanase pour produire un mélange de 2AB marqué RE et la région interne oligosaccharides réducteurs, respectivement. Dans une deuxième approche, le Fr KOH-sol est hydrolyse avec endoxylanase d'abord générer un mélange d'oligosaccharides qui sont ensuite marquées avec 2AB. Les ((dé) marqués) oligosaccharides libérés par voie enzymatique à la foisW- et Frs KOH-sol sont ensuite méthylé et l'analyse structurale détaillée des deux oligosaccharides natifs et méthylés est réalisée en utilisant une combinaison de MALDI-TOF-MS, une RP-HPLC-ESI-QTOF-MS et ESI-MS ^n. Endoxylanase digéré KOH-sol AX sont également caractérisés par résonance magnétique nucléaire (RMN), qui fournit également des informations sur la configuration anomérique. Ces techniques peuvent être appliquées à d'autres classes de polysaccharides à l'aide des endo-hydrolases appropriées.

Introduction

Hétéroxylanes sont une famille de polysaccharides qui sont des polysaccharides non cellulosiques prédominantes des parois primaires des graminées et les parois secondaires de tous les angiospermes ^3-6. Les backbones xylane diffèrent dans leurs types et les modèles de substitution avec glycosyl (acide glucuronique (GlcA), arabinose (Araf)) et non-glycosyl (O-acétyle, l' acide férulique) des résidus en fonction de type de tissu, le stade de développement et les espèces ^7.

Les murs du blé (Triticum aestivum L.) endosperme se composent principalement de arabinoxylanes (AXS) (70%) et (1 → 3) (1 → 4) -β-D-gluc....

Protocole

1. L'étiquetage de la fin Réduire (RE) de sucre résidus de W-sol avec 2 AX-aminobenzamide (2AB)

1. Incuber W-sol AX avec 2AB (0,2 M) en présence de 1 M de _NaBH3CN (de cyanoborohydrure de sodium) (pH 5,5) pendant 2 heures à 65 ° C pour convertir les terminaisons réductrices des chaînes de polysaccharide du squelette de leurs dérivés fluorescents.
   ATTENTION: L'étape suivante doit être effectuée dans la hotte comme NaBH ₃ CN libère le gaz de cyanure toxique quand il est en contact avec l' eau.
   1. Peser _NaBH3CN (62,8 mg) et dissoudre dans de l' eau (1 ml) dans un tube de microcentrifugation (1,5 ml) po....

Résultats

La digestion endoxylanase de 2AB marqué W-sol AX génère un mélange d'oligosaccharides RE 2AB marqué et une série d'oligosaccharides non marqué (sans étiquette 2AB) dérivées des régions internes de la chaîne de xylane (figure 1, à partir Ratnayake et al. ^2). Une série de méthodes chromatographiques est ensuite utilisé pour fractionner le mélange complexe d'isomères. Enfin, les techniques MS sont utilisés pour identifier les structures isomè.......

Discussion

La plupart des ossatures paroi cellulaire des polysaccharides de la phase de matrice ont apparemment au hasard substitué (à la fois glycosyle et des résidus non glycosylés) , qui sont très variables en fonction de l'espèce végétale, le stade de développement et le type de tissu ^3. Comme polysaccharides sont des produits de gènes secondaires leur séquence est pas modèle dérivé et il n'y a donc pas d'approche analytique unique, comme il en existe pour les acides nucléiques et les protéines, pour leu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2 aminobenzamide (2AB)	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	A89804
borohydrure de sodium (NaBH4)	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	247677	Dangereux, manipuler avec précaution
cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN)	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	156159	Dangereux, manipuler avec précaution
endo-1,4-&beta ;-Xylanase M1 (de Trichoderma viride) (120101a)	Megazyme (www.megazyme.com)	E-XYTR1
Oxyde de deutérium (D2O)	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	151882
Lyophilisateur (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus column  ;	Agilent  ;		(2.1&fois ; 100 millimètres ; 1,8 et micro ; m taille de la bille)  ;
MicroFlex MALDI-TOF MS  ;   ; (Modèle - MicroFlex LR)	(Bruker Daltonics, Allemagne)
(ESI) -(QTOF) MS  ;   ; (Modèle # 6520)	(Agilent, Palo Alto, Californie )
ESI-MSn   ;- piège-ionique  ; (Modèle # 1100 HCT)	(Agilent, Palo Alto, Californie).
Bruker Avance III 600 MHz -NMR	Bruker Daltonics, Allemagne
Topspin (version 3.0)-Biospin- logiciel  ;	Bruker  ;
GC-MS (Modèle # 7890B)	Agilent  ;