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Article de méthode

Le séquençage de l'usine mur hétéroxylanes Utilisation enzymatique, chimique (méthylation) et physiques (spectrométrie de masse, résonance magnétique nucléaire) Techniques

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DOI :

10.3791/53748

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24 mars 2016

 ,  , 
1ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls, School of BioSciences, University of Melbourne

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit les techniques spécifiques utilisées pour la caractérisation structurale de l’extrémité réductrice (RE) et de la (les) séquence(s) glycosylique(s) de la région interne des hétéroxylanes en marquant l’ER avec 2 aminobenzamides avant l’hydrolyse enzymatique (endoxylanase), puis en analysant les oligosaccharides résultants à l’aide de la spectrométrie de masse (MS) et de la résonance magnétique nucléaire (RMN).

Résumé

Ce protocole décrit les techniques particulières utilisées pour la caractérisation de l'extrémité réductrice (RE) et la séquence de glycosyle région interne (s) du hétéroxylanes. Les parois cellulaires endosperme de blé de-amidonnés ont été isolés comme un résidu insoluble dans l' alcool (AIR) 1 et séquentiellement l' extrait avec de l' eau (W-sol Fr) et de KOH 1 M contenant 1% de NaBH4 (KOH-sol Fr) tel que décrit par Ratnayake et al. , (2014) 2. Deux approches différentes (voir le résumé dans la figure 1) sont adoptées. Dans la première, W AX-sol intactes sont traitées avec 2AB pour marquer le résidu initial de sucre dans la chaîne du squelette RE et ensuite traités avec une endoxylanase pour produire un mélange de 2AB marqué RE et la région interne oligosaccharides réducteurs, respectivement. Dans une deuxième approche, le Fr KOH-sol est hydrolyse avec endoxylanase d'abord générer un mélange d'oligosaccharides qui sont ensuite marquées avec 2AB. Les ((dé) marqués) oligosaccharides libérés par voie enzymatique à la foisW- et Frs KOH-sol sont ensuite méthylé et l'analyse structurale détaillée des deux oligosaccharides natifs et méthylés est réalisée en utilisant une combinaison de MALDI-TOF-MS, une RP-HPLC-ESI-QTOF-MS et ESI-MS n. Endoxylanase digéré KOH-sol AX sont également caractérisés par résonance magnétique nucléaire (RMN), qui fournit également des informations sur la configuration anomérique. Ces techniques peuvent être appliquées à d'autres classes de polysaccharides à l'aide des endo-hydrolases appropriées.

Introduction

Hétéroxylanes sont une famille de polysaccharides qui sont des polysaccharides non cellulosiques prédominantes des parois primaires des graminées et les parois secondaires de tous les angiospermes 3-6. Les backbones xylane diffèrent dans leurs types et les modèles de substitution avec glycosyl (acide glucuronique (GlcA), arabinose (Araf)) et non-glycosyl (O-acétyle, l' acide férulique) des résidus en fonction de type de tissu, le stade de développement et les espèces 7.

Les murs du blé (Triticum aestivum L.) endosperme se composent principalement de arabinoxylanes (AXS) (70%) et (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucanes (20%) avec des quantités mineures de cellulose et heteromannans (2% chacun) 8. Le squelette de xylane peut être diversement non substitué et essentiellement mono-substitué (principalement O-2 positions et, dans une moindre mesure, O-3 positions) et disubstitués (O 2 et O 3 positions) avec des α-L-Ara résidus f 9. L'extrémité réductrice (RE) des hétéroxylanes de dicotylédones (par exemple, Arabidopsis thaliana) 10 et gymnospermes (par exemple, Epicéa (Picea abies)) 11 contient une séquence tétrasaccharide glycosyle caractéristique; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A (1 → 4) -D-Xyl p. Pour comprendre la biosynthèse et de la fonction (biologique et industriel) hétéroxylane, il est important pour séquencer complètement le squelette de xylane pour comprendre les types et les modèles de substitution, ainsi que la séquence de l'extrémité réductrice (RE).

Des techniques spécifiques utilisées pour la caractérisation structurale de l'extrémité réductrice (RE) et la séquence de glycosyle région interne (s) de hétéroxylanes sont décrits dans ce manuscrit. Les techniques reposent sur fluorophore de marquage (avec 2 aminobenzamide (2AB)) de l'extrémité réductrice (RE) de la chaîne hétéroxylane avant l'enzymatique (endoxylanase) hydrolyse. Cette approche, en particulier pour le séquençage de RE, étaitd' abord rapporté par le laboratoire York 10,12-13 , mais est maintenant étendu pour inclure la région de séquençage interne et est une combinaison de techniques établies qui est également adaptable à tous les hétéroxylanes indépendamment de leur source d'isolement. Cette approche peut également être appliquée à d'autres classes de polysaccharides en utilisant (le cas échéant) les endo-hydrolases appropriées.

Dans la présente étude, endosperme de blé parois de-amidonné cellulaires ont été isolés comme un résidu insoluble dans l' alcool (AIR) et séquentiellement extrait avec de l' eau (W-sol Fr) et KOH 1 M contenant 1% de NaBH4 (KOH-sol Fr) comme décrit dans Ratnayake et al. (2014) 2. Les oligosaccharides libérés à la fois W- et Frs KOH-sol sont alors méthylé et l'analyse structurale détaillée des deux oligosaccharides natifs et méthylés est réalisée en utilisant une combinaison de MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-couplé à HPLC avec le une séparation chromatographique en ligne en utilisant une RP colonne C-18et ESI-MS n. Endoxylanase digéré KOH-sol AX a également été caractérisée par résonance magnétique nucléaire (RMN).

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Protocole

1. L'étiquetage de la fin Réduire (RE) de sucre résidus de W-sol avec 2 AX-aminobenzamide (2AB)

  1. Incuber W-sol AX avec 2AB (0,2 M) en présence de 1 M de NaBH3CN (de cyanoborohydrure de sodium) (pH 5,5) pendant 2 heures à 65 ° C pour convertir les terminaisons réductrices des chaînes de polysaccharide du squelette de leurs dérivés fluorescents.
    ATTENTION: L'étape suivante doit être effectuée dans la hotte comme NaBH 3 CN libère le gaz de cyanure toxique quand il est en contact avec l' eau.
    1. Peser NaBH3CN (62,8 mg) et dissoudre dans de l' eau (1 ml) dans un tube de microcentrifugation (1,5 ml) pour préparer une solution 1 M de NaBH3CN. Dissoudre le réactif 2AB (27,2 mg) dans 1 M de solution de NaBH3CN (1 ml) par chauffage à 65   ° C et on ajuste le pH du mélange réactionnel (0,2 M 2AB, 1 M de NaBH3CN) à un pH de 5,5 avec de l' acide acétique à 10%.
    2. Ajouter 200 ul de mélange réactionnel (0,2 M 2AB, 1 M de NaBH3CN) à W-sol AX (1 mg) dans un tube de verre avec un bouchon et mélanger à l'aide d'un mélangeur à vortex. Incuber pendant 2 heures à 65   ° C dans une hotte. Refroidir la suspension à température ambiante et ajouter 4 vol. d'éthanol absolu.
    3. Placer la suspension dans un stockage à froid (4 ° C) O / N pour précipiter les polysaccharides.
    4. Centrifugeuse (1500 x g, 10 min, température ambiante) pour éliminer le surnageant. Laver le culot abondamment avec de l'éthanol absolu (4x), l'acétone (1x) et de méthanol (1x), centrifuger entre chaque lavage. Aspirateur sec à 40 ° CO / N.
      Remarque: lavage étendue supprime également 2AB résiduel.

2. Génération de Xylo-oligosaccharides de 2 AB labelisée W-sol AX

  1. Dissolve 2AB étiquetée W-sol AX (1 mg) dans 500 ul de tampon d'acétate de sodium (100 mM, pH 5) dans un microtube (1,5 ml). Ajouter 4 unités de endoxylanase (GH 11, [M1]) et incuber à 37   ° C pendant 16 heures.
  2. Détruisez l'activité enzymatique en chauffant les mixt de réactionure pendant 10 minutes dans un bain d'eau bouillante. Refroidir la suspension à la température ambiante et transfert à tube de verre avec un bouchon. Ajouter 4 vol. d'éthanol absolu et placer la suspension dans un stockage froid (4 ° C) O / N pour précipiter des polysaccharides non digérés.
  3. Centrifugeuse (1500 x g, 10 min, RT) pour séparer les polysaccharides non digérés (à granulés) et endoxylanase généré xylo-oligosaccharides (surnageant). Décanter le surnageant dans un tube de verre propre et le placer dans un bain d'eau chaude (40 ° C).
  4. S'évaporer l'éthanol sous un courant d'azote gazeux à un volume de point final (~ 500 ul). Congeler le surnageant à -80 ° C pendant 4 heures et sécher le surnageant congelé dans un lyophilisateur pour récupérer xylo-oligosaccharides.

3. Génération de Xylo-oligosaccharides de KOH-sol AX et d'étiquetage de 2AB

  1. Traiter KOH-sol avec endoxylanase AX (GH 11, [M1]) pour générer xylo-oligosaccharides comme décrit ci-dessus (sections 2.1-2.4).
  2. Traiter endoxeylanase généré xylo-oligosaccharides à partir de KOH-sol avec AX mélange réactionnel 2AB (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) tel que décrit ci - dessus (sections 1.1.1-1.1.2).
  3. Décanter le surnageant dans un tube de verre propre et le placer dans un bain d'eau chaude (40 ° C). S'évaporer l'éthanol sous un courant d'azote gazeux à un volume de point final (~ 500 ul). Congeler le surnageant à -80 ° C pendant 4 heures et sécher le surnageant congelé dans un lyophilisateur pour récupérer xylo-oligosaccharides.

4. MALDI-TOF-MS:

  1. Préparation de la solution-matrice MALDI
    1. Ajouter une petite boule de 2, l'acide 5-dihydroxbenzoic (DHB) à 50% d'acétonitrile (500 ml) contenant de l'acide formique à 0,1% dans un tube (solution MALDI-matrice). Mélanger à l'aide d'un vortex, si elle se dissout rapidement, ajouter une autre petite boule de DHB. Note: la concentration idéale de solution MALDI-matrice est de 10 ug / ul -1.
  2. Préparation de la plaque cible MALDI-
    1. Déposer le aqueonous oligosaccharides échantillons (natif) (5-10 ug) (W-sol et / ou KOH-sol) sur une plaque MALDI-cible. Ajouter la solution MALDI-matrice 0,3 ul en utilisant une pointe séparée et mélanger par pipetage de haut en bas. Laisser le mélange sécher à température ambiante.
      Remarque: les échantillons correctement séchées devraient consister en des cristaux en forme d'aiguilles longues pointant vers le centre de la tache. Si le dépôt est collante et / ou smeary l'échantillon peut être soit trop concentré ou sont constitués de sels, de tels dépôts ne sont pas susceptibles de produire de bons spectres et l'échantillon doivent être purifiés davantage.
    2. Introduire la plaque cible dans la source MS et fonctionner en (+ ive) le mode d'ions positifs. Régler la tension d'accélération à 19,0 kV à la source d'ions 1 et 16,3 kV à la source d'ions 2. Ajuster la puissance du laser à une valeur supérieure à 70%. Sélectionnez l'endroit de l'échantillon sur la plaque MALDI-cible et cliquez sur Démarrer pour commencer tirs laser.
      Note: Tous les domaines de la cible ne donneront pas les signaux. Un endroit particulier ne donnera un signal pour quelques coups de laser dues soit àl'appauvrissement du mélange ou de caractéristiques du cristal échantillon / matrice.
      1. Déplacer le laser à différentes zones de la cible lors de l'acquisition et de la moyenne d'environ 200 spectres aléatoires pour obtenir le signal à bruit satisfaisant.

5. ESI-QTOF-MS

  1. Analyser les oligosaccharides endoxylanase généré (natif) à l'aide de nano-HPLC couplée à une ionisation par électronébulisation (ESI) Temps quadripolaire de vol (QTOF) SM instrument avec une séparation chromatographique en ligne en utilisant une RP colonne C-18 (75 pm x 150 mm, 3,5 um perle Taille).
    1. Transférer le oligosaccharides aqueux mélange endoxylanase généré dans un flacon et le placer dans l'échantillonneur automatique HPLC. Programmer le gradient d'élution de 5-80% avec les phases mobiles 0,1% (v / v) d'acide formique dans de l'eau et 0,1% (v / v) d'acide formique dans de l'acétonitrile, respectivement, sur 60 min.
    2. Réglez le taux à 0,2 ul / min. Réglez le mode ions positifs dans la plage de balayagede 300-1,600 m / z et une vitesse de balayage de 0,5 scans / seconde en utilisant les conditions de source ESI comme suit: gaz de rideau 10, GS1 4, température de la source 100 ° C, l' ion tension de pulvérisation 2.300 V, et de-regroupement potentiel 50 V. Exécutez le programme LC chromatographique et oligosaccharides éluées. Le chromatogramme ionique total résultant (TIC) est enregistré automatiquement par le logiciel.
    3. Ouvrez le TIC enregistré et sélectionnez extrait chromatogramme. Tapez les masses attendues (par exemple, 271, 403, 535, 667, 799 et 931 m / z) à la ligne de commande. chromatogramme scan en cliquant sur Entrée. Traiter les analyses d'ions sélectionnées des données chromatographiques ESI-QTOF MS en utilisant un logiciel selon les instructions du fabricant 14.

6. ESI-MS n

  1. Insérer 1 à 2 pi de oligosaccharide per-O-méthylé (méthylé comme décrit par Pettolino et al. 1) échantillon dans 50% d' acétonitrile dans une pointe de nanospray à l' aide d' une seringue. Réduirela pointe nano-spray à l'aide d'un coupe-verre pour tenir dans le porte-nano-spray discret attaché à la MS.
  2. Réglez la masse en fonction de la plage attendue de masse (200-1,500 m / z) et du gaz de rideau à 10, la tension ionspray à 1,900 V et polarité positive.
  3. Appuyez sur le bouton pour ouvrir la fenêtre acquérir pertinente, entrez le nom du fichier de données pour obtenir un balayage ionique total (ESI-MS 1). Ensuite, appuyez sur la touche STOP.
  4. Modifier le type de balayage d'ions produit à fragmenter un pic d'intérêt. Indiquer la masse d'intérêt (par exemple, 885 m / z) à fragmenter et d' ajuster la gamme de masse (200-900 m / z). Appuyez sur le bouton d' acquérir et d' ajuster l'énergie de collision (et / ou vers le bas dans l'onglet composé) pour obtenir la fragmentation complète de l' ion parent (885 m / z) et d' acquérir un balayage fragment d'ions (ESI-MS 2).
  5. Indiquer la masse du fragment ionique d'intérêt (par exemple, 711 m / z) et régler la plage de masse (200-720 m / z). Appuyez sur le bouton acquérir uned ajuster l'énergie de collision pour obtenir la fragmentation complète de précurseur ion (711 m / z) et d' acquérir un balayage fragment d'ions (ESI-MS 3).

7. H 1 Spectroscopie RMN

  1. Dissoudre mélange endoxylanase généré des oligosaccharides (forme KOH-sol, native) (~ 500 ug) dans D 2 O (1,0 ml, 99,9%) dans un tube à essai en plastique (15 ml). Congeler la suspension à -80 ° C pendant 4 heures et sécher la suspension congelée dans un lyophilisateur pour récupérer xylo-oligosaccharides.
  2. Répéter deux fois 7,1 pour échanger complètement le H 2 S avec D2O
  3. Dissoudre oligosaccharides séchés dans D 2 O (0,6 ml, 99,9%) et d' ajouter 0,5 ul d'acétone (5% en D 2 O) comme standard interne. Transférer les oligosaccharides deutérés dans le tube à échantillon RMN.
  4. Tenir la RMN tube contenant l'échantillon par le haut et insérer le tube d'échantillon dans un spinner plastique. Placez le spinner dans la jauge de profondeur de l'échantillon. Push ou retirer le tube d'échantillonnage pour régler la profondeur de l'échantillon pour faire en sorte que la ligne médiane de l'échantillon en haut et en bas des jauges de profondeur sont égales.
  5. Retirer la jauge de profondeur et insérer l'échantillon dans l'échantillonneur automatique relié à un spectromètre de RMN à 600 MHz équipé d'un cryo-sonde.
  6. Login et logiciels libres de contrôle du spectromètre. Entrez le nom du fichier de l'échantillon. Ouvrez un ensemble de données existant, puis utiliser la commande "edc" pour l'enregistrer sous un nouveau nom. Tapez le numéro de position de l'échantillon dans l'échantillonneur automatique et appuyez sur "ENTRER".
    Remarque: En appuyant sur le bouton "ENTRER" va baisser le tube d'échantillon doucement à l'intérieur de l'aimant où il sera placé dans la partie supérieure de la sonde.
  7. Réglez la température de l'échantillon souhaité en tapant "edte" à la ligne de commande. Attendre que la température de l'échantillon atteigne la valeur désirée avant de procéder à l'étape suivante. Entrez "verrouiller" à la ligne de commande et sélectionnez solvant approprié (D 2 O). Attendez que le & #34; verrouiller un message fini "apparaît au bas de la fenêtre.
  8. Tapez "ATMM" à la ligne de commande et cliquez sur "optimiser" en haut de la barre de menu ATMM. Choisissez commencer pour le réglage et l' appariement de la sonde pour le canal sélectionné (1 H dans ce cas).
  9. Tapez "topshim" à la ligne de commande pour le processus de calage dans lequel des ajustements mineurs sont apportés au champ magnétique jusqu'à ce que le champ magnétique uniforme est réalisé autour du sample.Acquire le signal en tapant "zg" à la ligne de commande et entrez.
  10. Analyser les spectres en utilisant le logiciel 15 selon les instructions du fabricant avec 1 H déplacement chimique référencée à un niveau interne de l' acétone à 2.225 ppm.

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Résultats

La digestion endoxylanase de 2AB marqué W-sol AX génère un mélange d'oligosaccharides RE 2AB marqué et une série d'oligosaccharides non marqué (sans étiquette 2AB) dérivées des régions internes de la chaîne de xylane (figure 1, à partir Ratnayake et al. 2). Une série de méthodes chromatographiques est ensuite utilisé pour fractionner le mélange complexe d'isomères. Enfin, les techniques MS sont utilisés pour identifier les structures isomè...

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Discussion

La plupart des ossatures paroi cellulaire des polysaccharides de la phase de matrice ont apparemment au hasard substitué (à la fois glycosyle et des résidus non glycosylés) , qui sont très variables en fonction de l'espèce végétale, le stade de développement et le type de tissu 3. Comme polysaccharides sont des produits de gènes secondaires leur séquence est pas modèle dérivé et il n'y a donc pas d'approche analytique unique, comme il en existe pour les acides nucléiques et les protéines, pour leu...

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Déclarations de divulgation

Nous n’avons rien à divulguer.

Remerciements

Ce projet a été soutenu par des fonds du programme phare de recherche collaborative de l’Organisation scientifique et de recherche du Commonwealth, fourni au Cluster des céréales à haute teneur en fibres par l’intermédiaire du Food Futures Flagship. L’AB tient également à souligner le soutien d’une subvention du Conseil australien de la recherche (ARC) au Centre d’excellence de l’ARC sur les parois cellulaires végétales (CE110001007).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2 aminobenzamide (2AB)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)A89804
borohydrure de sodium (NaBH4)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)247677Dangereux, manipuler avec précaution
cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)156159Dangereux, manipuler avec précaution
endo-1,4-&beta ;-Xylanase M1 (de Trichoderma viride) (120101a)Megazyme (www.megazyme.com)E-XYTR1
Oxyde de deutérium (D2O)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)151882
Lyophilisateur (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus column  ;Agilent  ;(2.1&fois ; 100 millimètres ; 1,8 et micro ; m taille de la bille)  ;
MicroFlex MALDI-TOF MS  ;   ; (Modèle - MicroFlex LR)(Bruker Daltonics, Allemagne)
(ESI) -(QTOF) MS  ;   ; (Modèle # 6520)(Agilent, Palo Alto, Californie )
ESI-MSn   ;- piège-ionique  ; (Modèle # 1100 HCT)(Agilent, Palo Alto, Californie).
Bruker Avance III 600 MHz -NMRBruker Daltonics, Allemagne
Topspin (version 3.0)-Biospin- logiciel  ;Bruker  ;
GC-MS (Modèle # 7890B)Agilent  ;

Références

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  18. Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
  19. Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).

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