Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

Résumé

Pour étudier les vitesses d’écoulement et la directionnalité de l’actine filamenteuse au niveau de la synapse immunologique des lymphocytes T, l’imagerie à super-résolution des cellules vivantes est combinée à la fluorescence par réflexion interne totale et quantifiée par spectroscopie de corrélation d’images spatio-temporelles.

Résumé

Filamenteuse-actine joue un rôle crucial dans la majorité des processus cellulaires, y compris la motilité et, dans les cellules immunitaires, la formation d'une interaction cellule-cellule clé connue sous le nom de la synapse immunologique. F-actine est également supposé jouer un rôle dans la régulation des distributions moléculaires à la membrane des cellules, y compris la dynamique de vésicules sous-membraneuse et le regroupement des protéines. Bien que les techniques de microscope optique standard permettent observations généralisées et limitée par la diffraction à faire, de nombreux événements cellulaires et moléculaires, y compris le regroupement et le flux moléculaire se produisent dans les populations à longueur des échelles bien en dessous du pouvoir de résolution de la microscopie optique standard. En combinant totale fluorescence par réflexion interne à la résolution d'imagerie procédé illumination structurée ultra microscopie, l'écoulement moléculaire à deux dimensions de la F-actine à la synapse immunitaire des cellules T a été notée. Spatio-temporelle spectroscopie de corrélation d'images (STICS) a ensuite été appliqué, ce qui génère resul quantifiablets sous la forme d'histogrammes de vitesse et des cartes vectorielles représentant directionnalité de l'écoulement et de l'ampleur. Ce protocole décrit la combinaison de l'imagerie et STICS techniques de super-résolution pour générer des vecteurs d'écoulement au niveau de détail sous-diffraction. Cette technique a été utilisée pour confirmer un flux d'actine qui est symétrique centripète rétrograde et tout au long de la périphérie des cellules T lors de la formation de la synapse.

Introduction

Le but de l'expérience est à l'image et de caractériser le flux moléculaire de filamentous- (F-) actine dans les cellules vivantes T, au-delà de la limite de diffraction afin d'établir le sens d'écoulement et de l'ampleur au cours synapse immunologique (IS) de la formation. Cette technique sera réalisée à l'aide d'un microscope à éclairage structurée (SIM) en mode fluorescence totale de réflexion interne (TIRF), l'imagerie de cellules T Jurkat qui font synapse artificielle sur l'activation des lamelles revêtues d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3. Les formes se situe entre un lymphocyte T et sa cible; une cellule présentatrice d'antigène (APC) à l'récepteur des cellules T (TCR) ^1,2 d'activation. Comme cela est la première étape pour déterminer si le système immunitaire adaptatif génère une réponse immunitaire à une infection, les conséquences de la réactivité aux stimuli incorrecte peut provoquer un certain nombre de maladies. L'importance de l'interaction des cellules T-APC est bien documentée, cependant, le rôle (s) de l'adulte est après si TCR initialeinternalisation gnal sont pas encore pleinement compris.

Comme le cytosquelette est pensé pour aider deux processus liés à l'activation du TCR (le mouvement des molécules à la membrane plasmique et le contrôle des molécules dépendant du cytosquelette d'actine ^3,4 signalisation), de comprendre comment le cytosquelette réorganise spatialement et temporellement feront bien comprendre les étapes de la réorganisation moléculaire pendant la formation de la synapse. Le flux rétrograde de F-actine est pensé pour corral grappes TCR vers le centre de la synapse immunologique, cette translocation est considéré comme vital pour la cessation du signal et le recyclage; aidant l'équilibre délicat de l'activation des cellules T ^5.

Bien que la microscopie à fluorescence standard est un outil flexible qui continue de donner un aperçu sur de nombreux événements biologiques y compris les interactions cellule-cellule, elle est limitée par la capacité du système pour résoudre avec précision de multiples fluorophores résidant plus près que la Diffrlimite d'action (≈200 nm) de l'autre. Comme de nombreux événements moléculaires dans les cellules impliquent des populations denses de molécules et présentent réarrangement dynamique soit en repos ou lors de la stimulation spécifique, la microscopie optique conventionnelle ne fournit pas une image complète.

L'utilisation de l'imagerie super-résolution a permis aux chercheurs de contourner la limite de diffraction en utilisant une variété de techniques. Seule molécule localisation microscopie (SMLM) tels que PALM et STORM ^6,7 a la capacité de résoudre l'emplacement de molécules jusqu'à une précision de l'ordre de 20 nm, cependant, ces techniques reposent sur ​​des temps d'acquisition longues, construire une image sur plusieurs cadres . En général, cela nécessite des échantillons à être fixes ou pour les structures à faible mobilité présentent fluorophores si simples ne sont pas interprété comme de multiples points. Alors que l'épuisement de l'émission stimulée (STED) imagerie permet de super-résolution par le biais très sélectif confocale excitation ^8, le balayage nécessaireapproche peut être lente sur des champs entiers de cellules de vue. STED démontre également phototoxicité important pour des résolutions plus élevées en raison de l'augmentation de la puissance du faisceau d'épuisement.

Structuré microscopie éclairage (SIM ⁹⁾ offre une alternative à ces méthodes, capables de doubler la résolution d'un microscope à fluorescence standard et est plus compatible avec l'imagerie des cellules vivantes que les techniques de SMLM actuelles. Il utilise des puissances inférieures laser, sur un système à grand champ pour les champs de cellules entières de vue; Fournir davantage des vitesses d'acquisition, et est compatible avec l'étiquetage fluorophore standard. La nature à grand champ de la carte SIM permet également l'utilisation de la fluorescence totale de réflexion interne (TIRF) pour l'excitation hautement sélectif, avec des profondeurs de pénétration dans la dimension axiale de <100 nm.

Spectroscopie de corrélation d'images (ICS) est une méthode de corrélation des fluctuations d'intensité de fluorescence. Une évolution de ICS; Im spatio-temporelleâge spectroscopie de corrélation (STICS ¹⁰⁾ corrèle signaux fluorescents intracellulaires dans le temps et l'espace. En corrélant intensités de pixels entourant les pixels de retard dans des trames par l'intermédiaire d'une fonction de corrélation, l'information est acquise en ce qui concerne les vitesses d'écoulement et de directivité. Pour assurer objets statiques ne pas interférer avec l'analyse STICS, un filtre d'objet immobile est mis en œuvre, qui travaille en soustrayant une moyenne mobile des intensités des pixels.

La technique présentée ici est considérée comme étant la première démonstration de la spectroscopie de corrélation d'image étant appliqué à des données de microscopie super-résolution pour quantifier le flux moléculaire dans ¹¹ des cellules vivantes. Cette méthode améliore l'imagerie par diffraction limitée des flux F-actine via une analyse STICS ¹² et conviendrait chercheurs qui souhaitent déterminer le flux moléculaire en deux dimensions dans les cellules vivantes, à partir de données acquises à des résolutions spatiales au-delà de la limite de diffraction de la lumière.

Protocole

Remarque: Les étapes 1 et 2 ont lieu avant le jour de l'imagerie; assurer tous les médias et les suppléments pour être utilisés avant ou le jour de l'imagerie sont équilibrées. L'équilibrage est réalisé par le réchauffement des médias et des suppléments à 37 ° C dans un incubateur réglé à 5% de CO _2. Toutes les étapes des travaux de culture cellulaire et lamelle placage se déroulent dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire.

1. transfection des cellules

1. Transfecter les cellules T à imager 24 h avant l'expérience avec un plasmide codant pour une fusion pour construire fluorescent F-actine étiquetage de la GFP et de l'imagerie. Remarque: Les cellules doivent être séparées de 24 heures avant la transfection (48 heures avant l'imagerie) pour assurer cellules sont à une santé optimale et dans leur phase de croissance logarithmique.
   1. Placez 5 ml de supplément RPMI (RPMI 1640 plus 10% de FBS et 1% Pen-Strep (facultatif)) dans un seul puits d'une plaque à 6 puits dans l'incubateur pour équilibrer.
   2. Pastille 2 x 10 ⁷ cellules T culterée à 37 ° C 5% de CO ₂ en supplément RPMI en utilisant un tube de centrifugation à 327 g pendant 5 min et laver dans un volume égal de milieu d'électroporation préchauffé. Remarque: moyen électroporation est un milieu de sérum réduit contenant des tampons et des suppléments (voir consommables).
   3. Après re-granulation à 327 xg pendant 5 min, remettre les cellules dans 500 ul de milieu d'électroporation et ajouter lentement à une cuvette, ajouter 5 pg du plasmide dans la PCR note dH _{2 O} pour le marquage F-actine.
   4. Tapoter doucement la cuvette sur l'espace de travail de la hotte pour assurer l'élimination de toutes les bulles d'air dans les médias, ce qui peut provoquer un arc de l'électricité et de distribuer les cellules uniformément dans les médias.
   5. Allumez l'appareil d'électroporation et de régler la tension de 300 V et la capacité à 290 Ω. Échantillon électroporer utilisant une décroissance exponentielle pendant 20 msec. Note: L'optimisation peut être exigée pour différentes cellules et les différentes constructions plasmidiques.
   6. Une fois que le protocole de transfection estcomplets, des cellules de stocker sur la glace pendant 1 min avant de poursuivre.
   7. Soigneusement transférer les cellules de la cuvette à la plaque de 6 puits contenant 5 ml de supplément RPMI équilibrée de l'étape 1.1.1.
   8. Incuber les cellules O / N à 37 ° C + 5% CO _2.

2. lamelles de manteaux et Supplément d'imagerie pré-chaud

1. Des lamelles de Coat avec des anticorps pour induire la stimulation des cellules T.
   1. Manteau chaque chambre d'une lamelle de 8 puits avec 1 pg / ml αCD3 et αCD28 dans 200 pi de PBS.
   2. Conserver à 4 ° CO / N. Alternativement, des lamelles de Coat 2 h avant à l'imagerie et de garder dans un incubateur à 37 ° C pour réduire la dérive pendant le processus d'imagerie en minimisant les changements de température à la lamelle.
2. Créer un échantillon de test de lamelle avec 0,1 um sous-diffraction microsphères fluorescentes.
   1. Vortex solution stock de perles pour éviter les grumeaux.
   2. Sur une nouvelle, propre lamelle de ee même type que ceux utilisés à l'étape 2.1.1, une pipette 5 pi microsphère fluorescente solution stock sur la surface (selon les instructions du fabricant).
   3. Répandre la solution de microsphères sur la lamelle avec la pointe de la pipette.
   4. Laisser sécher, puis appliquer 200 pi de milieu de montage tels que PBS.
      Remarque: le milieu de montage doit correspondre à celui utilisé pour les échantillons de cellules d'imagerie.
3. Equilibrer HBSS (+ 20 mM de HEPES, ci-après dénommé «HBSS supplément ') dans un tube de centrifugation en plaçant dans un incubateur à une pré-O chaud / N à 37 ° C + 5% CO _2.
   Remarque: l'ajout de HEPES est de tamponner CO _2, si vous utilisez une chambre d'incubation _avec le CO 2 entrée sauter cette supplémentation.

3. Microscope Set-up

1. Tournez sur la scène haut-incubateur du microscope et le lieu suffisamment d'eau distillée FRBR-SIM dans le réservoir du microscope pour couvrir entièrement la base de l'élément de chauffage. Permettre à l'eau à l'equilibrate à 37 ° C. Ajouter le collier de chauffage à l'objectif, également mis à 37 ° C.
   Remarque: En raison de la sensibilité du set-up, ces étapes sont effectuées la nuit avant de sorte que les composants optiques sont à une température stable avant l'imagerie.
2. Placez la FRBR 488 bloc réseau compatible dans le trajet de la lumière du microscope et de fixer en place.
   1. Changez le mode de canal et le câble de fibre à la position «unique» sur la scène de lit et d'un microscope laser respectivement à engager le chemin optique correcte pour le mode FRBR-SIM. Remarque: Sauter cette étape va conduire à une erreur (figure 1A) dans la fenêtre du logiciel.
3. Mettez tous les microscopes et d'ordinateurs composants et ouvrez le logiciel de commande d'acquisition.
   1. Ouvrez le panneau de OC, Ti Pad, N-SIM Pad et ND Acquisition fenêtres (figure 1B). Dans le "Panneau de OC 'sélectionnez l'option' FRBR 488 '(figure 2B, flèche jaune).
   2. Dans la fenêtre N-SIM Pad, sélectionnez la FRBR-SIM »et les paramètres« en mouvement »(figure 2C, flèches jaunes). Sélectionnez le bouton Paramètres (Figure 1C, boîte jaune) et sélectionnez «FRBR 488 (100x pour la FRBR 488nm) 'dans le menu déroulant, frappé« Appliquer »et« OK ».
   3. Définissez les paramètres de la caméra dans les «Paramètres de DU897 'à: Frame Rate 50 ms, lecture en mode, EM gain de 3 MHz à 14-bit, et EM Gain multiplicateur 300 avec un gain de conversion de 1 (figure 1C, la boîte verte).
      Remarque: voir des résultats représentatifs pour des considérations de taux de trame.
   4. Calibrer l'éclairage du microscope pour la FRBR-SIM, en sélectionnant l'objectif 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF, sur le «N-SIM Pad 'tourner la puissance du laser 488 nm à 10%.
      Remarque: La taille des pixels des images brutes est de 60 nm, avec un champ de vision de 512 x 512 pixels.
   5. Nettoyez l'objectif en utilisant des tissus de verre pour enlever la poussière et l'huile.
4. Trouver le plan focal de la FRBR-SIM.
   1. Commencez avec l'objectif dans le plan z le plus bas possible. Placer une goutte d'huile de lentilles de l'objectif et ajouter l'échantillon de microsphères fluorescentes provenant de l'étape 2.2 de la platine du microscope.
   2. Sélectionnez la fonction Parfait Focus System (PFS) situé sur le corps du microscope.
   3. Lentement, déplacez l'objectif à travers le plan z jusqu'à ce que le bouton PFS cesse de clignoter pour confirmer le plan focal a été atteint.
   4. Passez à la vue «Live» sur le logiciel de contrôle et de l'image des microsphères pour les derniers ajustements effectués à l'aide de la roue de micro-manipulateur PFS.
5. Observez l'éclairage uniforme sans émission de fluorescence out-of-focus-dessus de la 75 nm onde évanescente.
   Remarque: Confirmation illumination structurée est remplie par l'observation d'un motif d'éclairage fluctuant à partir de l'échantillon de microsphères fluorescentes.
6. Mesurer l'échantillon de microsphères fluorescentes et de quantifier la résolut d'imagerie amélioréeion en observant la largeur à mi-hauteur (FWHM) du profil d'intensité.
   1. Ouvrez le logiciel Analyser (de v4.20.01), avec le module NIS-A N-SIM Analyse installé et sélectionnez "Applications" -> «Afficher la fenêtre N-SIM".
   2. Avec l'éclairage par contraste de modulation (IMC) et la suppression du bruit à haute résolution (HRNS) mis à 1 pour les ensembles de données de la FRBR-SIM (figure 2), reconstruire l'image de l'échantillon de microsphères pour générer une image reconstruite de 1024 x 1024 pixels avec une taille de pixel de 30 nm.
   3. Utilisation de l'outil de profil de ligne d'une largeur de 1 pixel (figure 3A, boîte jaune), tracer une ligne à travers le centre d'une seule microsphère.
   4. Sélectionnez le bouton FWHM (figure 3B, boîte jaune) et cliquez à l'maxima d'intensité de la distribution gaussienne, suivi par ses minima d'intensité.
   5. Confirmation de la FWHM de la microsphère est comprise dans l'intervalle de 100 nm (Figure 3C). Remarque: la résolution achlorsque l'imagerie d'échantillons biologiques ieved varieront en fonction du signal de bruit à partir de l'efficacité de marquage et la fluorescence de fond.

4. Préparation de l'échantillon pour l'imagerie

1. Préparation lamelle.
   1. Récupérer lamelle αCD revêtu de l'étape 2.1 de réfrigérateur ou incubateur et retirer PBS contenant αCD3 et αCD28 de chaque puits.
   2. Ajouter 200 ul de HBSS supplément préchauffé provenant de l'étape 2.3 dans chaque puits de la lamelle. Laver et retirer les pour assurer un minimum de αCD3 et αCD28 est laissé en solution. Ajouter 200 ul d'un autre supplément de la HBSS pour les puits de lamelle.
   3. Nettoyez le dessous de la lamelle avec le tissu de lentille pour enlever l'huile et les particules.
2. Position lamelle sur la platine du microscope et de trouver le plan focal de la FRBR de la lamelle en utilisant le plan z PFS que l'on trouve dans l'étape 3.4.
3. La préparation des cellules.
   1. Introduire à la pipette 200 pi de la con de médiascontenant des cellules transfectées de l'étape 1.1.8 dans un tube de micro-centrifugeuse.
   2. Cellules de culot dans une micro-centrifugeuse à 268 g pendant 20 sec et retirer les supports de cellules.
   3. Resuspendre les cellules dans 200 pi préchauffé supplément HBSS de l'étape 2.3.

5. Les cellules d'imagerie

1. Prendre supplément HBSS contenant des cellules au microscope et la pipette 200 ul doucement dans l'un des puits.
2. Tout en restant dans le plan focal de la FRBR à la lamelle (en mode PFS), utiliser le microscope oculaire et l'éclairage à épifluorescence pour suivre cellules fluorescentes approchant la lamelle.
3. Une fois que les cellules se posent sur la lamelle, passer en mode 'Live' dans la N-SIM Pad pour amener l'image sur le moniteur et vérifier les cellules sont en discussion sur l'écran de l'ordinateur.
4. Pour un temps record des cours, ouvrir la fenêtre ND Acquisition et sélectionnez l'onglet 'Time', cliquez sur 'Ajouter' et réglez «Interval» pas de retard, 'Durée'à 10 min, 'boucles' est mis à 1.
   Remarque: La durée peut être modifiée en fonction du procédé d'intérêt; le logiciel STICS peut extraire des résultats quantitatifs avec piles d'images de ≈ 10 cadres lorsqu'il a été capturé avec 'No Delay'.
5. Avec les réglages d'acquisition identique à l'échantillon de perles, commencer l'enregistrement des données en sélectionnant "Exécuter maintenant" dans la fenêtre ND Acquisition.

6. Reconstruction SIM Images

1. Après l'imagerie est terminée, ouvrez le logiciel Analyser (de v4.20.01), avec le module NIS-A N-SIM Analyse installé et sélectionnez "Applications" -> «Afficher la fenêtre N-SIM".
2. Avec l'éclairage par contraste de modulation (IMC) et la suppression du bruit à haute résolution (HRNS) mis à 1 pour les ensembles de données de la FRBR-SIM (Figure 2), de reconstruire un (ou en utilisant l'outil de lots multiples) de fichier SIM première pour produire une image reconstruite SIM.
3. Confirmez le fichier reconstruit a une taille de pixel de 30 nm, indiqué dans lel'image barre d'état.
   Remarque: La taille du pixel ne modifie pas l'analyse des STICS mais il doit être au moins 2x plus petit en dimension à la résolution spatiale de la PSF afin d'assurer la corrélation spatiale entre les pixels.
4. Exporter les données sous fichiers .tiff, prêt pour l'analyse STICS.

7. Analyse STICS

1. Télécharger et extraire le STIC (C) s package logiciel Matlab (Wiseman de laboratoire; disponibles comme information supplémentaire). Le stics_vectormapping.m de script est le noyau d'une seule analyse des STICS canaux et les 30 premières lignes de code sont utilisés pour définir les paramètres d'entrée tel que défini à la section 2.1 du manuel. Ouvrez ce script et de définir les paramètres d'entrée pour la FRBR-SIM analyse des données. Il est suggéré d'ajouter aussi le dossier de S STIC (C) avec des sous-dossiers à la machine chemin Matlab locale, comme détaillé dans l'annexe du manuel.
   1. Définir les paramètres d'entrée pour l'analyse des données en modifiant les lignes correspondantes du code
   2. Pour effectuer analyse des données FRBR-SIM pour générer une carte vectorielle, définissez les paramètres temporels à sous-région temporelle dans la ligne 31 le nombre maximal de trames et le décalage temporel dans la ligne 32 à 1. Pour obtenir une série chronologique de cartes vectorielles varier ces paramètres .
   3. Pour le filtre d'élimination Immobile, régler le paramètre «filtrage» (ligne 23) à «Moyenne mobile» et régler le paramètre 'MoveAverage' (ligne 24) à 21.
      Remarque: Ce paramètre a été montré à travailler pour de grands signaux de fluorescence mouvement lent et, comme il est basé sur la soustraction cadres de série de la trame en cours d'analyse.
   4. Changer lignes 33-38 pour définir le nom des fichiers et les titres des cartes vectorielles de sortie de sortie, ainsi que le chemin du répertoire de sortie et définissent dans quel format les carte vectorielle images doivent être enregistrées.

Taille des pixels (pm)	0.03 pm	Ligne 19
Frame rate (sec)	1 seconde	Ligne 20
Temps de latence maximale (images)	20 images	Ligne 21
Taille de la sous-région (pixels)	8 pixels	Ligne 29
Espacement de la sous-région (pixels)	1 pixel	Ligne 30

2. Ouvrez les run1ChannelSTICS de script dans la fenêtre Editor Matlab. Chargez la série d'image en exécutant lignes 1-23 de ce script.
   Remarque: Ce script peut être utilisé pour charger et pré-processus série d'images, tracer les cartes vectorielles et des histogrammes de vitesse et de lancer un traitement par lots pour de nombreux fichiers. Si nécessaire, recadrer l'image pour une région d'intérêt en utilisant la ligne 24-26 de ce script.
   1. Exécuter les lignes 29-35 de run1ChannelSTICS pour commencer l'analyse STICS. Lorsque vous êtes invité, sélectionnez un polygone pour indiquer une région d'intérêt (ROI), si désiré. Assurez-vous que le retour sur investissement ne se chevauchent pas avec le bord de la cellule, comme des artefacts limites se produisent lorsque STICS analyse ces rerégions.
   2. Exécuter les lignes 38-52 pour afficher la carte de vecteur. Pour tracer l'histogramme vitesse de grandeur, lignes 53-72 exécuter.

Résultats

Paramètres de microscope

Après avoir atteint avec succès toutes les étapes le chercheur aura éclairage structuré accompli (SIM) Imagerie du flux F-actine dans une synapse des cellules T (vidéo 1), et quantifié ce flux moléculaire par spectroscopie corrélation d'images spatio-temporelle (Figure 4 ^11). Avant d'enregistrer des images, assurer l'éclairage de l'échantillon est uniforme à travers les neuf...

Discussion

Cette technique permettra aux chercheurs de l'image et de quantifier les détails précédemment insolubles dans les cellules exprimant la fluorescence. Dans nos résultats, nous montrons que la F-actine des flux d'une manière symétrique à partir de la périphérie de la cellule vers le centre de la cellule dans la cellule T est. Ces résultats sont cohérents avec les résultats antérieurs de la ligne 1D données de profil kymographe ^{13 et} étendent la capacité d'analyse de données 2D et de super-résolution...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Consommables :
Jurkat E6.1 cellules	APCC	ATTC TIB-152
RPMI	Life Technologies	21875-091
FBS	Sigma	F7524-500ML
Pénicilline-Strepromycine  ;	Life Technologies	15140-122
HBSS&	nbsp ; Life Technologies	14025-050
HEPES	Life Technologies	15630-056
#1.5 Lamelles Labtek 8 puits	NUNC, Labtek	155409
LifeAct GFP construct	Ibidi	60101
OptiMem	Life Technologies	51985-042
anti-CD3	Cambridge Bioscience	317315
anti-CD28	BD Bioscience / Insight Biotechnology	555725
PBS	Life Technologies	20012-019
Huile
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Équipement :
Gene Pulsar Xcell System	BioRad	165-2660
Cuvette (0,4cm)	BioRad	165-2088
Centrifugeuse (5810R)	Eppendorf  ;	5805 000.327
Centrifugeuse (Heraeus)	Biofuge pico	75003235
6 puits plaque	Corning	3516
Incubateur de scène	Tokai Hit	INUH-TIZSH
Microscope Nikon N-SIM	Nikon	Contacter l’entreprise
Nikon Logiciel d’analyse	Nikon	Contacter l’entreprise
Incubateur ( 190D)	LEEC	Contacter l’entreprise