Article de méthode

Extraction Metrics pour les systèmes de racines en trois dimensions: Volume et surface Analyse de In-sol X-ray tomodensitométrie données

DOI :

10.3791/53788

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26 avril 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Molecular Sciences Laboratory

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une méthodologie pour obtenir des informations de structure de la racine visuelle et quantitative à partir des données de tomographie à rayons X calculée acquises dans le sol est présenté.

Résumé

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Les racines des plantes jouent un rôle essentiel dans les interactions plante-sol-microbe qui se produisent dans la rhizosphère, ainsi que des processus avec des implications importantes pour le changement climatique et la gestion des cultures. information de taille quantitative sur les racines dans leur environnement natif est inestimable pour l'étude de la croissance des racines et des processus environnementaux impliquant des plantes. X-ray tomodensitométrie (XCT) a été démontré être un outil efficace pour la numérisation et l' analyse in situ racine. Nous avons cherché à développer un outil de costless et efficace qui se rapproche de la surface et le volume de la racine quelle que soit sa forme à partir de données en trois dimensions (3D) tomographie. La structure de la racine d'un dropseed Prairie (heterolepis Sporobolus) spécimen a été imagé en utilisant XCT. La racine a été reconstruit, et la structure de la racine primaire a été extrait à partir des données en utilisant une combinaison de logiciel sous licence et open-source. Un maillage polygonal isosurface a ensuite été créé pour faciliter l'analyse. Nous avons développé til standalone l' application imeshJ, générée en MATLAB 1, pour calculer le volume de la racine et de la surface de la maille. Les sorties des imeshJ sont de surface (en mm 2) et le volume (en mm 3). Le processus, en utilisant une combinaison unique d'outils d'imagerie à l'analyse quantitative de la racine, est décrite. Une combinaison de XCT et des logiciels open-source avérée être une combinaison puissante pour noninvasively échantillons de racines de plantes, l'image données du segment racine, et extraire des informations quantitatives à partir des données 3D. Cette méthodologie de traitement de données 3D devrait être applicable à d'autres systèmes matériels / d'échantillons où il existe une connectivité entre les composants de la même atténuation des rayons X et des difficultés surgissent avec la segmentation.

Introduction

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Roots, dans le cadre de la rhizosphère 2-5, représentent une partie «invisible» de la biologie végétale depuis le sol, il est difficile aux racines d'image non-invasive 6, 7. Cependant, l' étude de la croissance des racines et de l' interaction au sein de l'environnement du sol est essentielle à la compréhension la croissance des racines / plante et cycle des éléments nutritifs, qui à son tour affecte forestation, la sécurité alimentaire, et le climat. X-ray tomodensitométrie (XCT) est avérée être un outil précieux pour l' imagerie non invasive des échantillons de racines des plantes dans leur environnement local 8. Afin de mesurer le développement des racines et des changements dimensionnels dans des conditions différentes, et être en mesure de comparer les données provenant de différents ensembles de données / spécimens, il faut extraire des informations quantitatives à partir des données de tomographie. Segmentation des données profondes de celle du sol environnant, qui est, l'isolement de l'image de la racine de tout le reste autour de lui (y compris, par exemple, une plante voisine) est une étape cruciale avant Accutaux analyse de la taille peut être fait. Cependant, une approche simple seuillage est souvent impossible pour les données fondamentales. Les défis associés aux racines des plantes d'imagerie dans le sol comprennent des variations dans les propriétés d'atténuation des rayons X du matériau de la racine, et le chevauchement des valeurs d'atténuation entre les racines et le sol causée par l'eau et des matières organiques. Ces questions ont été superbement adressée récemment par Mairhofer et al. dans leur outil de suivi visuel RooTrak 7, 9. La prochaine étape après une segmentation réussie est la détermination précise du volume racine et de la surface. Le volume peut être estimée en comptant le nombre de voxels et en multipliant par la taille de cubed des voxels comme indiqué avant le 7. Pour une détermination plus précise de la racine de surface et de volume, l'isosurface du système racinaire segmentée peut être représenté par un maillage de triangles, en utilisant un algorithme connu sous le nom confinants cubes 10. L'open-source ImageJ 11 peut être utilisé pour rapprocher thvolume racine e basé sur l'algorithme Marching Cubes. Au meilleur de notre connaissance, seul un nombre limité de logiciels open-source dédié au calcul des données de volume / surface tomographique de spécimens de racines dans la gamme de centimètres et plus est actuellement disponible 12. Un logiciel open-source , nous avons examiné 13 met l' accent sur ​​la croissance des racines et vise à caractéristiques cellulaires permettant l' analyse quantitative du volume à une résolution unicellulaire. Certains logiciels open-source dédié aux systèmes de racines entières 14 est excellent pour les systèmes racinaires tubulaire de petit diamètre sur la base du rapprochement que leur forme est en fait tubulaire. Toutefois, certains travaux avec des images 2D et sont incapables de gérer 3D empile 14. En outre, l'approximation de la forme tubulaire peut ne pas être valide lorsque le système racinaire présentant des surfaces rugueuses et les formes non uniformes, tels que ceux des arbres, sont étudiés. Une autre approche 15 utilise deux dimensions (2D) de rotation des séquences d'images de contournement innovante ee besoin d'un scanner CT coûteux. Il mesure, les dossiers, et affiche root longueurs du système. Le logiciel que nous avons testé à partir de ceux qui ne sont disponibles dans le commerce 16-18; on ne semble pas être capable de gérer l' image 3D empilements 16, le second est un outil de la surface foliaire et la mesure de la longueur de la racine 17, tandis que la troisième est basée sur l' analyse des couleurs 18. Sur la base de cette enquête, nous suggérons qu'une option costless qui se rapproche de la surface et le volume de la racine quelle que soit sa forme à partir des données de tomographie 3D est souhaitable.

Construire sur la libre disposition RooTrak et ImageJ, nous avons développé un programme, nommé imeshJ (voir le fichier de code supplémentaire) qui traite un maillage isosurface (fichier de stéréolithographie de surface) généré à partir des données de racine segmentés, et calcule la zone de volume et de surface de la racine par faire des calculs géométriques simples sur les données maille d'index de triangle. Nous rapportons ici une méthode qui combine l'utilisation de l'imagerie XCT,reconstruction et visualisation de données (logiciel CT Pro 3D et VG Studio), la segmentation de la racine de l'échantillon du sol dans les données 3D (open-source ImageJ logiciel et RooTrak), et l'extraction de l'information de surface et de volume à partir d'un maillage triangulaire (ImageJ et le code informatique imeshJ).

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Protocole

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Attention: Le fonctionnement d'un scanner de tomographie à rayons X nécessite à la fois la formation de rayonnement général, et de la formation en matière de sécurité de rayonnement spécifique à l'instrument. Toutes les procédures pertinentes au laboratoire de l'expérimentateur correspondants doivent être suivies.

1. Racine Imaging

Remarque: Cette étape décrit l'imagerie d'une herbe spécimen tenue dans son sol d'origine dans un pot en plastique tubulaire (un tube en plastique avec un diamètre de 40 mm, une hauteur de 210 mm et une épaisseur de paroi d'environ 2 mm).

  1. Placez plante en pot sur l'échantillon manipulateur de l'instrument à une distance souhaitée pour cible grossissement. Pour une installation dans un support de 2 pouces de diamètre, l'échantillon à distance de la source devrait être d'environ 3 pouces (7 cm).
  2. Réglez les paramètres d'analyse de rayons X pour obtenir une couleur optimale (niveau de gris) de contraste de l'image de détecteur. Remarque: Ces paramètres sont disponibles dans le logiciel de contrôle de l'instrument utilisé.
    1. Définir les paramètres d'alimentation X-ray; 85 kV et 190 uA ont été utilisés dans cet examenple.
    2. Réglez le temps d'exposition. Ici, un temps de 1 seconde d'exposition relativement longue est utilisée pour un meilleur rapport signal-sur-bruit.
    3. Définir le nombre de projections et images par projection; 4 images par projection pour un total de 3,142 projections est suggéré pour les bonnes données statistiques.
    4. Exécuter une correction d'ombrage en utilisant les conditions de mesure définies ci-dessus en sélectionnant l'onglet "correction Shading", et en cliquant sur "Créer".
      Remarque: La correction d'ombrage compense la variation de la réponse des pixels de l'appareil de formation d'image lorsqu'il est éclairé par un ensemble constant de flux de rayons X. Le processus prend des images en blanc (avec l'échantillon retiré du trajet du faisceau) avec le faisceau de rayons X sous tension, et avec le faisceau éteint. Cette correction est appliquée à toutes les images collectées.
    5. Sélectionnez l'option "Minimiser artefacts cycliques" (également appelé mode "navette"); l'échantillon est mis en rotation par pas angulaires, tandis que les images en projection sont acquises. Cela conduit à datune acquisition à un rythme plus lent, mais aide à éliminer les artefacts d'anneau.
    6. Démarrez le scan en cliquant sur le bouton "Acquire" sous l'onglet Acquisition (avec les paramètres décrits ci-dessus, la collecte d'image prendra environ 4 heures).

Reconstruction 2. Données

Remarque: Cette section décrit la reconstruction de données de volume 3D à partir des images brutes (radiographies du scanner).

  1. Charger les données brutes dans le programme.
  2. Comparez la première et la dernière image (ils devraient être à peu près identique à la dernière image est prise après une rotation de l'échantillon 360 o) pour vous assurer que l'échantillon n'a pas bougé ou les paramètres de numérisation n'a pas changé lors de l' acquisition de données.
  3. Calculer le centre de rotation (COR) en sélectionnant l'onglet "Centre de rotation", et en cliquant sur "Démarrer"; options d'utilisation "Automatique" COR trouver avec "Haute Qualité" précision, et "double" (supérieure et inférieure) tranche sélection pour le calcul COR.
  4. Sélectionnez le volume de l'échantillon à reconstruire: sélectionnez l'onglet "Volume", et modifier les fenêtres de sélection du volume à l'aide des vignettes.
  5. Effectuer la reconstruction pour créer le fichier de volume contenant des données 3D en cliquant sur "Démarrer".

3. Traitement des données / Segmentation

Remarque: Cette section décrit les mesures à prendre pour préparer les données reconstruites pour un traitement ultérieur dans le RooTrak du programme pour suivre les racines comme ils se ramifient à travers le sol, et d'isoler les racines de tout matériau environnant pour produire une pile d'images binaires de tout le racine elle-même.

  1. Traitement des données de volume dans ImageJ pour préparer un RooTrak l'image traitable pile:
    1. Chargez le fichier de volume dans ImageJ.
    2. Optimiser le contraste d'image entre les racines et le sol en ajustant les paramètres de luminosité et de contraste (Cliquez sur l'image / Réglage / Luminosité / Contraste). Lorsque la région d'intérêt dans l'image est visible et canifestement distinguables, les paramètres sont considérés comme optimisés.
    3. Enregistrer sous une pile d'images en jpeg, bmp, ou png.
  2. Traitement en RooTrak pour segmenter la racine:
    1. Charger l'image pile dans RooTrak (aller à onglet "Outils", puis appuyez sur "Tracker").
    2. points de semences Situé à l'intérieur root: cliquez sur plusieurs points à l'intérieur de chacune des sections de racines pertinentes visibles dans la vue tranche supérieure des données de volume.
    3. Régler les paramètres tracker "Lissage" et "similarité" à 0,3 et 0,8, respectivement.
    4. Exécutez la fonction de suivi. Cela suivra la racine de l'image tranche supérieure tout le chemin à la tranche inférieure.
    5. Après avoir visionné les données de volume, sélectionnez le nombre de tranches en fonction du volume de données utilisable; dans ce cas, le suivi a été arrêté à 200 tranches, ce qui équivaut à une profondeur de 6,2 mm, où les frontières sont devenues des racines mal définies (l'image de la racine suivi a commencé à se fondre dans celle du sol).
      Noter lal'image pile produite sera enregistrée automatiquement à l'endroit où le répertoire de sortie a été créé.

4. Volume et analyse de surface

Remarque: Cette étape décrit la génération de maillage isosurface de la pile d'image créée par RooTrak.

  1. Convertir l'image pile de RooTrak dans un format d'image binaire dans ImageJ. Sélectionnez "Process", puis "binaire", puis "Faire binaire".
  2. Utilisez le plug-in ImageJ open-source, BoneJ, pour créer le maillage triangulaire; dans ImageJ sélectionnez "Plugins", puis "BoneJ", puis "Isosurface".
  3. Set "rééchantillonnage" et "Seuil" à 6 et 120, respectivement (réglages par défaut). Cochez la case "Afficher surface", et appuyez sur le bouton "OK".
  4. Sur la "visionneuse 3D", cliquez sur l'onglet Fichier, puis sur «surfaces à l'exportation", puis enregistrer sous "STL (binaire)".
  5. Ouvrez imeshJ, sélectionnez le fichier STL et entrez la taille de voxel en microns. Cliquez sur "CSurface alculez "pour acquérir échantillon root surface totale en mm 2. De même, cliquez sur" Calculer le volume "pour obtenir le volume total de l' échantillon de la racine en mm 3.

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Résultats

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L'échantillon constitué de deux tiges de l'herbe native Prairie dropseed (Sporobolus heterolepis) et le sol d' origine autour d' elle a été prise à partir d' un quartier résidentiel et placé dans un petit support en forme de tube montre la figure 1. La taille reconstruite de voxel de données a été d' environ 31 um x 31 um x 31 um. Le fichier de volume reconstruit a été utilisé pour créer une pile d'images à partir d' une orientation sélectionnée (vue de dessus) ...

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Discussion

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Une combinaison de rayons X calculé plusieurs programmes open-source prouvées de positons et d'être une combinaison puissante pour noninvasively échantillons de racines images de plantes, données du segment racine, et extraire de l'information quantitative (surface et volume) à partir des données 3D. Notre capacité à visualiser et mesurer des caractéristiques est toujours limitée par la résolution de numérisation, ainsi que par les limitations du logiciel RooTrak. Cependant, la résolution de numérisation était s...

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Déclarations de divulgation

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Nous n’avons rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été effectué dans le Laboratoire des sciences moléculaires environnementales, une installation scientifique nationale parrainée par le Bureau de la recherche biologique et environnementale du ministère de l’Énergie et située au Pacific Northwest National Laboratory.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
X-Tek/Metris XTH 320/225 kV  ;Nikon MetrologyScanner de tomographie à rayons X
Inspect XNikon MetrologyLogiciel de contrôle d’instruments
CT Pro 3DLogiciel de métrologie Nikon Metrology, version XT 2.2
VG Studio MAXVisual Graphics GmbHLogiciel de visualisation de volumes 3D, version 2.1.5
ImageJOpen-sourceLogiciel de traitement et d’analyse d’images, version 1.6
RooTrakLogiciel de segmentation racinaire open-source, version 0.3.1-b1 beta
imeshJEMSLMATLAB script développé par les auteurs
d’herbe de prairie Échantillonobtenu sur le sol dans une zone résidentielle
Échantillon

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  3. Farrar, J., Hawes, M., Jones, D., Lindow, S. How roots control the flux of carbon to the rhizosphere. Ecology. 84 (4), 827-837 (2003).
  4. Gregory, P. J. Roots rhizosphere and soil: the route to a better understanding of soil science? Eur. J. Soil Sci. 57 (1), 2-12 (2006).
  5. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., van der Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
  6. Gregory, P. J., Hutchison, D. J., Read, D. B., Jenneson, P. M., Gilboy, W. B., Morton, E. J. Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography. Plant and Soil. 255 (1), 351-359 (2003).
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