Myéloïde cellule d&#39;isolement de la peau de souris et Vidange ganglion Après intradermique immunisation avec Live Atténuée<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoïtes

Résumé

Nous décrivons ici un protocole permettant d’isoler les cellules myéloïdes de la peau de souris et de drainer les ganglions lymphatiques après injection intradermique de sporozoïtes de Plasmodium. La cytométrie en flux des cellules collectées fournit un test fiable pour caractériser la réponse inflammatoire de la peau et des ganglions lymphatiques drainants au parasite.

Résumé

L' infection du paludisme commence lorsque le stade sporozoïte de Plasmodium est inoculé dans la peau d'un hôte mammifère par une piqûre de moustique. Le parasite très mobiles non seulement atteint le foie pour envahir les hépatocytes et de transformer en une forme globulaire-infectieux. Il migre aussi dans la peau et les ganglions lymphatiques drainant le site proximal par injection, où il peut être reconnu et dégradé par des résidents et / ou des cellules myéloïdes recrutés. Imagerie intravitale a rapporté le recrutement précoce de leucocytes positifs fluorescent brillamment Lys-GFP dans la peau et les interactions entre les sporozoïtes et CD11c ⁺ cellules du ganglion lymphatique de drainage. Nous présentons ici une procédure efficace pour récupérer, identifier et dénombrer les sous-ensembles de cellules myéloïdes qui sont recrutés sur la peau de souris et de drainage des ganglions lymphatiques après l'injection intradermique de immunisant doses de sporozoïtes dans un modèle murin. La caractérisation phénotypique utilisant flux multi-paramétrique fournit cytométrieun test fiable pour évaluer les changements cellulaires dynamiques précoces en réponse inflammatoire à l' infection par Plasmodium.

Introduction

Le paludisme est l'une des maladies infectieuses les plus meurtrières dans le monde, tuant plus d'un demi-million de personnes par an. L' infection par Plasmodium, l'agent causal de la maladie, débute par une phase de pré-érythrocytaire (PE). Au cours de cette phase, les sporozoïtes injectés dans la peau de l' hôte par un moustique anophèle femelle atteignent le foie via la circulation sanguine et de se différencier hépatocytes à l' intérieur dans les formes parasitaires qui infectent les globules rouges et causent les symptômes de la maladie.

Les étapes de PE de Plasmodium représentent une cible privilégiée pour la vaccination anti-malaria. En effet, les vaccins vivants atténués contre ces étapes, comme le rayonnement atténué sporozoïtes (RAS), les parasites génétiquement arrêtés (BPA) ou chimioprophylaxie et sporozoïtes (CPS) ont démontré leur capacité à protéger à la fois les rongeurs et les hôtes humains ^1-9. Dans le modèle de rongeur, la plupart des études de vaccination sont effectuées en utilisant une immunisation par voie intraveineuse, Qui est l'étalon-or en termes d'efficacité de protection. Cependant, la description d'un étage de la peau et l'importance du ganglion peau associée drainage (DLN) pour induire une protection a changé notre perception de la phase de PE et a souligné l'importance de l'injection par voie intradermique. Imagerie intravitale de P. berghei sporozoïtes injectés dans la peau de rongeurs ont montré que seulement environ 25% de l'inoculum atteint le foie via la circulation sanguine. Le reste ~ 75% distribue entre la dLn proximale (~ 15%) et la peau (~ 50%) ^10,11, où une petite proportion peut transformer et rester en vie pendant des semaines à l' intérieur des cellules de la peau ^12,13. En outre, des études ultérieures ont décrit que la mise en place d' une immunité protectrice efficace après la vaccination intradermique se déroule principalement dans la peau-DLN, où les cellules T CD8 ⁺ spécifiques du parasite sont activés, et que de façon marginale dans la rate ou du foie-DLNS ^14,15.

Tandis quela plupart des études se sont concentrées sur la caractérisation des cellules effectrices impliquées dans la mise en place de la réponse immunitaire protectrice, on sait beaucoup moins sur le sort des parasites vivants atténués injectés dans la peau, en particulier leurs interactions avec le système immunitaire inné. En particulier, la caractérisation des cellules présentant des antigènes impliqués dans l' antigène du parasite absorption, le traitement et la présentation aux cellules T CD8 ⁺ est d' une importance cruciale, sachant que l' acquisition de l' antigène PE peut se produire aussi bien dans la peau et les compartiments DLN. Des études antérieures d'imagerie intravitale décrit un afflux précoce de cellules positives fluorescentes vives Lys-GFP dans la peau suite à une piqûre de moustique infectieux ¹⁶ tout début des interactions entre les sporozoïtes et les cellules dendritiques ont été observées dans le dLn ^10,17. Plus récemment, il a été rapporté que les sporozoïtes inoculés dans la peau par les moustiques augmente la motilité des deux lymphocytes T de régulation et dendritiques dans la peausouris, tandis qu'un certain nombre de diminution des cellules présentatrices d'antigène a été observée dans le dLn ^18.

Nous avons cherché à identifier et quantifier plus précisément les sous - ensembles de leucocytes recrutés dans la peau et dLn correspondants, ainsi que ceux qui interagissent avec le parasite après l' injection intradermique de doses immunisantes de RAS ^19. Dans ce contexte, nous avons isolé les cellules myéloïdes (CD45 ⁺ CD11b ⁺⁾ des deux tissus et caractérisé par des sous - populations d'intérêt flux paramétrique multiples = cytométrie. Conformément à la réponse immunitaire décrite dans le stade précoce de Leishmania major infection de la peau ^20, la réponse de l' hôte principal de sporozoïtes injection se compose d'un recrutement successif de polynucléaires neutrophiles (CD45 ⁺ CD11b ⁺ Ly6G ⁺ Ly6C ^int) , suivie par les monocytes inflammatoires (CD45 ⁺ CD11b ⁺ Ly6G ^- Ly6C ⁺⁾ qui sont identifiés sur la base de differentil'expression al des marqueurs de surface et Ly6G Ly6C.

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les cellules myéloïdes de la peau de la souris et dLn après injection intradermique de doses immunisantes de RAS extraits de glandes infectées salivaires du moustique. injections intradermiques reproductibles et le traitement des tissus sont des étapes importantes pour quantifier les changements phénotypiques de l'infiltration population de cellules dans les tissus infectés. L'approche détaillée ci - dessous fournit un test fiable pour évaluer la peau et la réponse inflammatoire dLn à Plasmodium parasite et peut être étendu à divers systèmes expérimentaux.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de l'Institut Pasteur et par le Comité local d'éthique sur l'expérimentation animale (comité éthique IDF-Paris 1, Paris, France; numéro de contrat: 2.012 à 0.015) et réalisées en conformité avec les directives et règlements applicables.

1. Matériaux et réactifs

1. Utilisez femelle moustiques Anopheles stephensi (souche Sda500) qui se nourrissent de souris infectées 3-5 jours après la levée et à l' arrière , comme décrit précédemment ^21.
2. Utiliser des parasites Plasmodium berghei ANKA clone exprimant le gène de la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle de l'constitutive protéine de choc thermique 70 (HSP70) , le promoteur. Cela donne une vive fluorescence au cours du cycle de vie du parasite ^22.
3. Utiliser des souris femelles C57BL / 6JRj (7 semaines d'âge).
   REMARQUE: Tous les réactifs utilisés dans le protocole décrit sont répertoriés dans le T able des matériaux / équipement.

_title "> 2. Radiation atténué sporozoïtes Isolement de Mosquito glandes salivaires

1. Entre 18-25 jours après le repas infectieux dans le sang, la collecte et à froid , anesthésier les moustiques dans un tube de 15 ml sur de la glace ²¹ comme décrit précédemment. les transférer avec précaution sur une boîte de Pétri en inversant le tube. Maintenir les insectes sur la glace et d'exposer les moustiques à une dose de 12 krad d'irradiation x γ- ou.
2. Isoler sporozoïtes atténués de irradiées glandes salivaires du moustique comme décrit précédemment ^21. Collecter des glandes salivaires infectées dans un petit volume (environ 15 pi) de phosphate solution saline tamponnée 1x Dulbecco (DPBS) sur la glace et en douceur les écraser pour libérer les sporozoïtes.
   NOTE: L'injection d'une suspension de parasite très concentré dans un petit volume étant critique, il est donc essentiel de récolter un nombre suffisant de glandes salivaires à partir d'un nombre élevé de moustiques présélectionnés bien infectés, comme en témoigne leur expression robuste devert-fluorescence.
3. Filtrer la suspension de sporozoïtes à travers un tamis de 35 um de la cellule bouchon adapté à un tube de faible adhérence 1,5 ml de microcentrifugation afin d'éliminer les débris et les amas de moustiques.
4. Compter le nombre total de sporozoïtes isolés comme décrit précédemment ²¹ et ajuster la concentration de parasites suspension de froid 1x DPBS pour obtenir 83.000 sporozoïtes / ul. Stocker les parasites sur la glace tout en continuant les prochaines étapes.
5. Collecter le nombre équivalent de glandes salivaires de moustiques non infectés qui seront utilisés comme témoin négatif et traiter l'échantillon comme décrit dans les étapes 2.2 et 2.3. Diluer l'échantillon, comme indiqué ci-dessus pour obtenir une concentration similaire d'extraits de glandes salivaires dans la suspension.
   NOTE: Les sporozoïtes peuvent être stockés sur la glace pendant un maximum de 2 heures. Cependant, de préférence ils sont injectés à l'intérieur d'une heure après l'écrasement des glandes salivaires.

3. L'injection de sporozoïtes dans le Dermal Layer de l'oreille

1. Anesthésier les animaux par injection intraperitoneale de kétamine (50 mg / kg) de mélange / xylazine (5 mg / kg). Attendez 5-8 min pour la souris d'être dans un état d'inconscience et d'appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée. Évaluer la profondeur de l'anesthésie en effectuant un pincement de l'orteil douce sur les deux pieds arrière.
   NOTE: La dose d'anesthésie dure moins de 20 minutes, de sorte que les prochaines étapes doit être fait rapidement.
2. Stabiliser le pavillon de l' oreille de la souris en fixant la face ventrale avec du ruban adhésif transparent précédemment placé sous un stéréomicroscope (figure 1A). Appuyez doucement sur l'oreille pour éviter d'endommager le système vasculaire.
3. Charger un / 35 aiguille de calibre biseautée 10 pi de seringue avec 0,6 pi de parasites remises en suspension ^10.
4. Fournir la suspension de sporozoïtes en 4 sites d'injection (0,15 ul par site) en insérant avec précaution l'aiguille sur la face dorsale de l'oreille (figure 1A), au- dessous de l'épiderme, avecle biseau vers le haut, en prenant soin d'éviter les vaisseaux sanguins. Laisser l'aiguille reste dans le derme pour quelques secondes pour empêcher le reflux de la solution injectée avant de le retirer. Observer une papule caractéristique à chaque site d'injection à la fin de la procédure (figure 1B et 1C).
5. Après l'injection, retirer délicatement l'oreille de la bande.
6. Injecter l'oreille controlatérale avec la même dose de parasites en suivant les étapes 3,2-3,4.
7. Injecter 2 autres souris avec soit 0,6 ul de 1 x DPBS ou 0,6 ul de 1 x DPBS + extrait de glandes salivaires des moustiques non infectées afin d'évaluer la réponse inflammatoire médiée par l'injection seule et le dépôt de matériau de moustiques dans le derme.
8. Assurer le suivi de la souris de l'anesthésie avant de le placer dans la cage.
   NOTE: Le dépôt des sporozoïtes appropriée dans la peau , peut être contrôlée par microscopie à fluorescence (figure 2A et 2B), La souris étant préparé comme décrit previsously ^23.

4. peau et Vidange ganglion

1. Préparer un milieu standard (SM) comme suit: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + 25 mM d'acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) complété avec 400 U / ml de collagénase et de 50 ug / ml de désoxyribonucléase (DNase) .
2. Préparer deux 6 puits à fond plat des plaques de culture de tissu sur la glace avec 4,5 ml SM + 70 pm tamis cellulaire par puits pour les échantillons DLN (planche A) et 4,5 ml SM par puits pour les échantillons de peau (planche B).
3. Au point de temps désiré après l'inoculation des sporozoïtes, anesthésier profondément la souris par injection intrapéritonéale de kétamine (125 mg / kg) / xylazine (12,5 mg / kg) mélange dislocation cervicale antérieure. Assurez-vous que la souris montre des signes de mort clinique et commencer la dissection immédiatement.
   NOTE: La cinétique de recrutement des cellules myéloïdes peuvent être examinées à différents moments après injection (soit 2 h, 4 h et 24 h comme décrit précédemment ^14).
4. Désinfecter l'oreille inoculé et la région du col correspondant avec 70% d'éthanol pour réduire la possibilité de contamination.
5. Avec des ciseaux et des pinces stériles, aseptiques disséquer le proximal auriculaire dLn sans recueillir la graisse environnante. Effectuer une première incision dans le sillon jugulo-carotidienne et enlever les poils du champ opératoire. Étirez l'incision avec 2 pinces pour exposer le DLN qui apparaît grisâtre par rapport au tissu environnant.
6. Pincez les tissus conjonctifs soigneusement sur le haut de la DLN avec une pince pour faciliter son retrait. Extraire le DLN en plaçant une pince au- dessous du tissu lymphoïde (figure 3A et 3B). Placez le dLn dans un puits contenant 4,5 ml SM + 70 um cellule crépine (planche A).
7. Récolter toute l' oreille inoculés avec des ciseaux et des pinces (figure 4A) tranchants stériles. Separmangé les dorsales et ventrales aspects de l'oreille par pincement et espaçant la coupe se termine par deux pinces (figure 4B - 4E). Placez-les dans un puits contenant 4,5 ml SM (planche B) en veillant à la fois les tissus sont complètement immergés dans le milieu.
   NOTE: Afin d'améliorer la fiabilité de l'expérience et augmenter le nombre de cellules d'intérêt, piscine 2 injecté oreilles ou 2 DLNS de la même souris par échantillon.
8. Récolte et processus en parallèle les oreilles et DLNS de souris inoculées avec soit 1x DPBS ou des extraits de glandes salivaires. Inclure 2 échantillons d'oreille et de ganglions lymphatiques supplémentaires récoltés à partir d'une souris naïve pour les contrôles négatifs et simples compensation de coloration.

5. Cellule d'isolement de ganglions lymphatiques

1. Incuber les ganglions lymphatiques (planche A) à 37 ° C + 5% de _CO2 pendant 15 min sous agitation douce. Ajouter de l'acide éthylènediaminetétraacétique 10 mM final (EDTA) par puits pour neutraliser collagénase et DNase actiactivi-. Effectuez les étapes suivantes sur la glace.
2. Dissocier les ganglions lymphatiques en utilisant l'extrémité supérieure d'un piston de la seringue de 5 ml. Presse en mouvements circulaires contre la crépine jusqu'à ce que tout ce qui reste est les tissus conjonctifs blancs.
3. Rincer la crépine de cellules deux fois avec 500 ul DPBS 1x + 2% de sérum fœtal bovin (FBS) + 2 mM EDTA. Transférer tout le volume du puits dans un tube de 15 ml.
4. Rincer le puits deux fois avec 500 ul DPBS 1x + 2% FBS + EDTA 2 mM et de transférer le volume dans le tube de 15 ml. Garder les tubes sur la glace.

6. Cellule d'isolement de la peau de l'oreille

1. Incuber les dépliants d'oreille (planche B) à 37 ° C + 5% de CO ₂ pendant 1 heure sous agitation douce.
   NOTE: Après 20 min d'incubation, couper les feuillets d'oreille avec des ciseaux en petits morceaux pour faciliter la digestion des tissus et de mettre l'échantillon dans l'incubateur pour les 40 min restants. Les cellules individuelles peuvent être observés dans le milieu à la fin du temps d'incubation.
2. Ajouter finale 10 mM EDTA par puits pour neutraliser les activités de collagénase et DNase. Effectuez les étapes suivantes sur la glace.
3. Transférer les fragments de tissus de l'oreille et le volume total de milieu dans un nouveau puits contenant un tamis cellulaire de 70 pm à l'aide d'une pipette de 1 ml. Coupez 2 à 3 mm de l'extrémité de la pointe pour recueillir les fragments de tissus de l'oreille plus facilement.
4. Dissocier les fragments de tissus de l'oreille à l'aide de l'extrémité supérieure d'un piston de la seringue de 5 ml. Presse en mouvements circulaires contre la crépine jusqu'à ce que tout ce qui reste est les tissus conjonctifs blancs.
5. Rincer les crépines de cellules deux fois avec 500 ul DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA.
6. Transférer la totalité du volume du puits dans un tube de 50 ml à travers un tamis cellulaire de 70 pm.
7. Rincer le puits avec 500 ul de DPBS 1x + 2% de FBS + 2 mM d'EDTA et transférer le volume dans le tube de 50 ml. Garder le tube sur la glace.
   NOTE: Les différentes étapes pour isoler les cellules totales de la peau et des tissus dLn sont résumés dans la figure 5.

title "> 7. comte et Viabilité des cellules recueillies

1. Centrifuger la peau et des échantillons dLn pendant 5 min à 450 xg à 4 ° C et jeter le surnageant. Resuspendre doucement le culot avec 300 DPBS ul 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA.
2. Prélever un petit volume de chaque échantillon pour compter le nombre total de cellules isolées à partir de la peau et DLN en utilisant un hémocytomètre. Ajouter 0,04% de bleu trypan pour déterminer la viabilité cellulaire.

8. Blocage des non Antigène spécifique de reliure

1. Ajouter 10 pg / ml de CD16 non marqué d'anticorps / CD32 Fc-bloc. Incuber 20 min à 4 ° C (peut aller plus).
2. Ajouter 2 ml de froid 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Centrifuger l'échantillon pendant 5 min à 450 xg à 4 ° C et jeter le surnageant. Resuspendre doucement le culot avec 300 DPBS ul 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA et maintenir les échantillons sur la glace.

9. Peau Coloration et les cellules des ganglions lymphatiques myéloïdes

1. Incuber ski précédemment bloquén et dLn cellules avec Live Tracker / Dead (soit 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole ou DAPI), des anticorps spécifiques anti-CD45 et anti-CD11b isolé.
   NOTES: Afin d'enrichir les sous - populations de cellules myéloïdes d'intérêt, en particulier ceux rares, CD45 ⁺ cellules et les lymphocytes peuvent être respectivement purifiés à partir de la peau ou l' épuisement de la dLn par billes magnétiques cellules de facilitation tri. Etant donné que la plupart des cellules isolées à partir du DLN sont CD45 ^+, l'utilisation d'anticorps anti-CD45 est pas obligatoire. D'autres marqueurs peuvent être inclus pour identifier les sous-populations de cellules myéloïdes d'intérêt par la stratégie positive ou négative-gating. Dans ce protocole, les cellules myéloïdes recrutés dans le DLN ont été enrichies en excluant CD8a cellules ⁺ (tout le compartiment des cellules T peut être ciblé en utilisant anti-CD3 de l' anticorps spécifique).
2. Incuber 30 min à 4 ° C dans l'obscurité. Ajouter 500 DPBS ul 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA, centrifuger l'échantillon 5 min à 450 xg à 4 ° C et jeter le supernatant. Répéter deux fois l'étape de lavage.
3. Resuspendre les échantillons avec 300 DPBS ul 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. Transférer la totalité du volume dans un tube FACS à travers un tamis cellulaire de 35 pm. Rincer le filtre avec 100 DPBS ul 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA.
4. Exécutez les cellules colorées dans un cytomètre de flux. Porte en direct des cellules individuelles (DAPI ^-, FSC-W) pour exclure les cellules mortes et doublets. Terrain CD45 ⁺ CD11b ⁺ événements pour la peau (figure 6A) et (CD45 ⁺⁾ CD8a ^- CD11b ⁺ événements pour le DLN (figure 6B).

Résultats

Nous avons récemment démontré que l' injection seringue-aiguille doses immunisantes de P. berghei sporozoïtes dans la peau de la souris induit un recrutement successif de polynucléaires neutrophiles suivie par les monocytes inflammatoires de la peau et dLn ^19. La section protocole décrit ci - dessus détaille la procédure utilisée pour isoler avec succès des cellules myéloïdes en direct à partir des deux tissus après des injections multiples d' un grand nombre ...

Discussion

Dans la perspective de la vaccination à grande échelle de l' homme à l' aide d' un vaccin sporozoïtes du paludisme ensemble, l' un des principaux défis à relever est de développer des voies et des méthodes d'administration des parasites optimisés pour assurer la vaccination et la protection ^24,25 réussie. Chez les humains, l'évaluation de l' efficacité protectrice médiée par des parasites vivants atténués (LAP) a été réalisé en suivant les moustiques naturel morsures ^2, ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kétamine : Imalgene® ; 1 000	Merial-50		mg/kg : injection préalable de sporozoïte 125 mg/kg : sacrifice préalable
Xylazine : Rompun® ; 2 %	Bayer-5		mg/kg : injection préalable de sporozoïte 12,5 mg/kg :
seringue NanoFil de sacrifice préalable + aiguille de calibre 35	World Precision Instruments.	-	-
Omnican® ; 50 Seringue à insuline 0,5 ml/50 U.I.	B. Braun Medical  ;
Plaque de culture tissulaire à 6 puits &ndash ; Fond plat	BD Falcon  ;		353046-70
et micro ; crépine à cellules M  ;	BD Falcon  ;	352350-2
ml seringue	Terumo	SS-02S-BLUE
MAXTM 15 ml Tube conique en polypropylène	BD Falcon  ;		352097-BLUE
MAXTM 50 ml Tube conique en polypropylène	BD Falcon  ;		352098-5
ml Tube en polystyrène à fond rond avec 35 µ ; m Capuchon de crépine	BD Falcon
1x CaCl2- et MgCl2--free	Life Technologies	14190-094-DMEM
1x + GlutaMAXTM	Life Technologies	31966-021-Collagénase
de Clostridium histolyticum, type IV 0,5-5,0 unités FALGPA/mg solide  ;	Sigma-Aldrich  ;	C5138	400 U/ml  ;
Désoxyribonucléase I du pancréas bovin, type IV  ;	Sigma-Aldrich  ;	D5025	50 et micro ; g/ml
de sel disodique EDTA	Sigma-Aldrich  ;	E-5134	10 mM ou 2,5 mM
FBS	Biowest	S1810-500-HEPES
solution tampon (1M)	Gibco	15630-056	25 mM
Trypan blue Stain (0,4 %)	Life Technologies	15250-061	Dilution 1:10  ;
Anti-souris CD16/CD32 (clone 2.4G2)	BD Biosciences	553142	10 µ ; g/ml final (1:50)
DAPI FluoroPureTM grade	Life Technologies	D21490	1 µ ; g/ml final
Anti-souris CD45 (clone 30-F11)	BD Biosciences	559864	; Dilution 1:200
Anti-souris CD11b (clone M1/70)	BD Biosciences	557657	; Dilution 1:400
Anti-souris CD8&alpha ; (clone 5H10)	Technologies de la vie	MCD0830	Dilution 1:100
Souris femelles C57BL/6JRj (âgées de 7 semaines)  ;	Laboratoires Janvier	-	-