Myéloïde cellule d'isolement de la peau de souris et Vidange ganglion Après intradermique immunisation avec Live Atténuée Plasmodium sporozoïtes

Le paludisme est l'une des maladies infectieuses les plus meurtrières dans le monde, tuant plus d'un demi-million de personnes par an. L' infection par Plasmodium, l'agent causal de la maladie, débute par une phase de pré-érythrocytaire (PE). Au cours de cette phase, les sporozoïtes injectés dans la peau de l' hôte par un moustique anophèle femelle atteignent le foie via la circulation sanguine et de se différencier hépatocytes à l' intérieur dans les formes parasitaires qui infectent les globules rouges et causent les symptômes de la maladie.

Les étapes de PE de Plasmodium représentent une cible privilégiée pour la vaccination anti-malaria. En effet, les vaccins vivants atténués contre ces étapes, comme le rayonnement atténué sporozoïtes (RAS), les parasites génétiquement arrêtés (BPA) ou chimioprophylaxie et sporozoïtes (CPS) ont démontré leur capacité à protéger à la fois les rongeurs et les hôtes humains ^1-9. Dans le modèle de rongeur, la plupart des études de vaccination sont effectuées en utilisant une immunisation par voie intraveineuse, Qui est l'étalon-or en termes d'efficacité de protection. Cependant, la description d'un étage de la peau et l'importance du ganglion peau associée drainage (DLN) pour induire une protection a changé notre perception de la phase de PE et a souligné l'importance de l'injection par voie intradermique. Imagerie intravitale de P. berghei sporozoïtes injectés dans la peau de rongeurs ont montré que seulement environ 25% de l'inoculum atteint le foie via la circulation sanguine. Le reste ~ 75% distribue entre la dLn proximale (~ 15%) et la peau (~ 50%) ^10,11, où une petite proportion peut transformer et rester en vie pendant des semaines à l' intérieur des cellules de la peau ^12,13. En outre, des études ultérieures ont décrit que la mise en place d' une immunité protectrice efficace après la vaccination intradermique se déroule principalement dans la peau-DLN, où les cellules T CD8 ⁺ spécifiques du parasite sont activés, et que de façon marginale dans la rate ou du foie-DLNS ^14,15.

Tandis quela plupart des études se sont concentrées sur la caractérisation des cellules effectrices impliquées dans la mise en place de la réponse immunitaire protectrice, on sait beaucoup moins sur le sort des parasites vivants atténués injectés dans la peau, en particulier leurs interactions avec le système immunitaire inné. En particulier, la caractérisation des cellules présentant des antigènes impliqués dans l' antigène du parasite absorption, le traitement et la présentation aux cellules T CD8 ⁺ est d' une importance cruciale, sachant que l' acquisition de l' antigène PE peut se produire aussi bien dans la peau et les compartiments DLN. Des études antérieures d'imagerie intravitale décrit un afflux précoce de cellules positives fluorescentes vives Lys-GFP dans la peau suite à une piqûre de moustique infectieux ¹⁶ tout début des interactions entre les sporozoïtes et les cellules dendritiques ont été observées dans le dLn ^10,17. Plus récemment, il a été rapporté que les sporozoïtes inoculés dans la peau par les moustiques augmente la motilité des deux lymphocytes T de régulation et dendritiques dans la peausouris, tandis qu'un certain nombre de diminution des cellules présentatrices d'antigène a été observée dans le dLn ^18.

Nous avons cherché à identifier et quantifier plus précisément les sous - ensembles de leucocytes recrutés dans la peau et dLn correspondants, ainsi que ceux qui interagissent avec le parasite après l' injection intradermique de doses immunisantes de RAS ^19. Dans ce contexte, nous avons isolé les cellules myéloïdes (CD45 ⁺ CD11b ⁺⁾ des deux tissus et caractérisé par des sous - populations d'intérêt flux paramétrique multiples = cytométrie. Conformément à la réponse immunitaire décrite dans le stade précoce de Leishmania major infection de la peau ^20, la réponse de l' hôte principal de sporozoïtes injection se compose d'un recrutement successif de polynucléaires neutrophiles (CD45 ⁺ CD11b ⁺ Ly6G ⁺ Ly6C ^int) , suivie par les monocytes inflammatoires (CD45 ⁺ CD11b ⁺ Ly6G ^- Ly6C ⁺⁾ qui sont identifiés sur la base de differentil'expression al des marqueurs de surface et Ly6G Ly6C.

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les cellules myéloïdes de la peau de la souris et dLn après injection intradermique de doses immunisantes de RAS extraits de glandes infectées salivaires du moustique. injections intradermiques reproductibles et le traitement des tissus sont des étapes importantes pour quantifier les changements phénotypiques de l'infiltration population de cellules dans les tissus infectés. L'approche détaillée ci - dessous fournit un test fiable pour évaluer la peau et la réponse inflammatoire dLn à Plasmodium parasite et peut être étendu à divers systèmes expérimentaux.

Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de l'Institut Pasteur et par le Comité local d'éthique sur l'expérimentation animale (comité éthique IDF-Paris 1, Paris, France; numéro de contrat: 2.012 à 0.015) et réalisées en conformité avec les directives et règlements applicables.

1. Matériaux et réactifs

1. Utilisez femelle moustiques Anopheles stephensi (souche Sda500) qui se nourrissent de souris infectées 3-5 jours après la levée et à l' arrière , comme décrit précédemment ^21.
2. Utiliser des parasites Plasmodium berghei ANKA clone exprimant le gène de la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle de l'constitutive protéine de choc thermique 70 (HSP70) , le promoteur. Cela donne une vive fluorescence au cours du cycle de vie du parasite ^22.
3. Utiliser des souris femelles C57BL / 6JRj (7 semaines d'âge).
   REMARQUE: Tous les réactifs utilisés dans le protocole décrit sont répertoriés dans le T able des matériaux / équipement.

1. Entre 18-25 jours après le repas infectieux dans le sang, la collecte et à froid , anesthésier les moustiques dans un tube de 15 ml sur de la glace ²¹ comme décrit précédemment. les transférer avec précaution sur une boîte de Pétri en inversant le tube. Maintenir les insectes sur la glace et d'exposer les moustiques à une dose de 12 krad d'irradiation x γ- ou.
2. Isoler sporozoïtes atténués de irradiées glandes salivaires du moustique comme décrit précédemment ^21. Collecter des glandes salivaires infectées dans un petit volume (environ 15 pi) de phosphate solution saline tamponnée 1x Dulbecco (DPBS) sur la glace et en douceur les écraser pour libérer les sporozoïtes.
   NOTE: L'injection d'une suspension de parasite très concentré dans un petit volume étant critique, il est donc essentiel de récolter un nombre suffisant de glandes salivaires à partir d'un nombre élevé de moustiques présélectionnés bien infectés, comme en témoigne leur expression robuste devert-fluorescence.
3. Filtrer la suspension de sporozoïtes à travers un tamis de 35 um de la cellule bouchon adapté à un tube de faible adhérence 1,5 ml de microcentrifugation afin d'éliminer les débris et les amas de moustiques.
4. Compter le nombre total de sporozoïtes isolés comme décrit précédemment ²¹ et ajuster la concentration de parasites suspension de froid 1x DPBS pour obtenir 83.000 sporozoïtes / ul. Stocker les parasites sur la glace tout en continuant les prochaines étapes.
5. Collecter le nombre équivalent de glandes salivaires de moustiques non infectés qui seront utilisés comme témoin négatif et traiter l'échantillon comme décrit dans les étapes 2.2 et 2.3. Diluer l'échantillon, comme indiqué ci-dessus pour obtenir une concentration similaire d'extraits de glandes salivaires dans la suspension.
   NOTE: Les sporozoïtes peuvent être stockés sur la glace pendant un maximum de 2 heures. Cependant, de préférence ils sont injectés à l'intérieur d'une heure après l'écrasement des glandes salivaires.

3. L'injection de sporozoïtes dans le Dermal Layer de l'oreille

1. Anesthésier les animaux par injection intraperitoneale de kétamine (50 mg / kg) de mélange / xylazine (5 mg / kg). Attendez 5-8 min pour la souris d'être dans un état d'inconscience et d'appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée. Évaluer la profondeur de l'anesthésie en effectuant un pincement de l'orteil douce sur les deux pieds arrière.
   NOTE: La dose d'anesthésie dure moins de 20 minutes, de sorte que les prochaines étapes doit être fait rapidement.
2. Stabiliser le pavillon de l' oreille de la souris en fixant la face ventrale avec du ruban adhésif transparent précédemment placé sous un stéréomicroscope (figure 1A). Appuyez doucement sur l'oreille pour éviter d'endommager le système vasculaire.
3. Charger un / 35 aiguille de calibre biseautée 10 pi de seringue avec 0,6 pi de parasites remises en suspension ^10.
4. Fournir la suspension de sporozoïtes en 4 sites d'injection (0,15 ul par site) en insérant avec précaution l'aiguille sur la face dorsale de l'oreille (figure 1A), au- dessous de l'épiderme, avecle biseau vers le haut, en prenant soin d'éviter les vaisseaux sanguins. Laisser l'aiguille reste dans le derme pour quelques secondes pour empêcher le reflux de la solution injectée avant de le retirer. Observer une papule caractéristique à chaque site d'injection à la fin de la procédure (figure 1B et 1C).
5. Après l'injection, retirer délicatement l'oreille de la bande.
6. Injecter l'oreille controlatérale avec la même dose de parasites en suivant les étapes 3,2-3,4.
7. Injecter 2 autres souris avec soit 0,6 ul de 1 x DPBS ou 0,6 ul de 1 x DPBS + extrait de glandes salivaires des moustiques non infectées afin d'évaluer la réponse inflammatoire médiée par l'injection seule et le dépôt de matériau de moustiques dans le derme.
8. Assurer le suivi de la souris de l'anesthésie avant de le placer dans la cage.
   NOTE: Le dépôt des sporozoïtes appropriée dans la peau , peut être contrôlée par microscopie à fluorescence (figure 2A et 2B), La souris étant préparé comme décrit previsously ^23.

4. peau et Vidange ganglion

1. Préparer un milieu standard (SM) comme suit: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + 25 mM d'acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) complété avec 400 U / ml de collagénase et de 50 ug / ml de désoxyribonucléase (DNase) .
2. Préparer deux 6 puits à fond plat des plaques de culture de tissu sur la glace avec 4,5 ml SM + 70 pm tamis cellulaire par puits pour les échantillons DLN (planche A) et 4,5 ml SM par puits pour les échantillons de peau (planche B).
3. Au point de temps désiré après l'inoculation des sporozoïtes, anesthésier profondément la souris par injection intrapéritonéale de kétamine (125 mg / kg) / xylazine (12,5 mg / kg) mélange dislocation cervicale antérieure. Assurez-vous que la souris montre des signes de mort clinique et commencer la dissection immédiatement.
   NOTE: La cinétique de recrutement des cellules myéloïdes peuvent être examinées à différents moments après injection (soit 2 h, 4 h et 24 h comme décrit précédemment ^14).
4. Désinfecter l'oreille inoculé et la région du col correspondant avec 70% d'éthanol pour réduire la possibilité de contamination.
5. Avec des ciseaux et des pinces stériles, aseptiques disséquer le proximal auriculaire dLn sans recueillir la graisse environnante. Effectuer une première incision dans le sillon jugulo-carotidienne et enlever les poils du champ opératoire. Étirez l'incision avec 2 pinces pour exposer le DLN qui apparaît grisâtre par rapport au tissu environnant.
6. Pincez les tissus conjonctifs soigneusement sur le haut de la DLN avec une pince pour faciliter son retrait. Extraire le DLN en plaçant une pince au- dessous du tissu lymphoïde (figure 3A et 3B). Placez le dLn dans un puits contenant 4,5 ml SM + 70 um cellule crépine (planche A).
7. Récolter toute l' oreille inoculés avec des ciseaux et des pinces (figure 4A) tranchants stériles. Separmangé les dorsales et ventrales aspects de l'oreille par pincement et espaçant la coupe se termine par deux pinces (figure 4B - 4E). Placez-les dans un puits contenant 4,5 ml SM (planche B) en veillant à la fois les tissus sont complètement immergés dans le milieu.
   NOTE: Afin d'améliorer la fiabilité de l'expérience et augmenter le nombre de cellules d'intérêt, piscine 2 injecté oreilles ou 2 DLNS de la même souris par échantillon.
8. Récolte et processus en parallèle les oreilles et DLNS de souris inoculées avec soit 1x DPBS ou des extraits de glandes salivaires. Inclure 2 échantillons d'oreille et de ganglions lymphatiques supplémentaires récoltés à partir d'une souris naïve pour les contrôles négatifs et simples compensation de coloration.

5. Cellule d'isolement de ganglions lymphatiques

1. Incuber les ganglions lymphatiques (planche A) à 37 ° C + 5% de _CO2 pendant 15 min sous agitation douce. Ajouter de l'acide éthylènediaminetétraacétique 10 mM final (EDTA) par puits pour neutraliser collagénase et DNase actiactivi-. Effectuez les étapes suivantes sur la glace.
2. Dissocier les ganglions lymphatiques en utilisant l'extrémité supérieure d'un piston de la seringue de 5 ml. Presse en mouvements circulaires contre la crépine jusqu'à ce que tout ce qui reste est les tissus conjonctifs blancs.
3. Rincer la crépine de cellules deux fois avec 500 ul DPBS 1x + 2% de sérum fœtal bovin (FBS) + 2 mM EDTA. Transférer tout le volume du puits dans un tube de 15 ml.
4. Rincer le puits deux fois avec 500 ul DPBS 1x + 2% FBS + EDTA 2 mM et de transférer le volume dans le tube de 15 ml. Garder les tubes sur la glace.

6. Cellule d'isolement de la peau de l'oreille

1. Incuber les dépliants d'oreille (planche B) à 37 ° C + 5% de CO ₂ pendant 1 heure sous agitation douce.
   NOTE: Après 20 min d'incubation, couper les feuillets d'oreille avec des ciseaux en petits morceaux pour faciliter la digestion des tissus et de mettre l'échantillon dans l'incubateur pour les 40 min restants. Les cellules individuelles peuvent être observés dans le milieu à la fin du temps d'incubation.
2. Ajouter finale 10 mM EDTA par puits pour neutraliser les activités de collagénase et DNase. Effectuez les étapes suivantes sur la glace.
3. Transférer les fragments de tissus de l'oreille et le volume total de milieu dans un nouveau puits contenant un tamis cellulaire de 70 pm à l'aide d'une pipette de 1 ml. Coupez 2 à 3 mm de l'extrémité de la pointe pour recueillir les fragments de tissus de l'oreille plus facilement.
4. Dissocier les fragments de tissus de l'oreille à l'aide de l'extrémité supérieure d'un piston de la seringue de 5 ml. Presse en mouvements circulaires contre la crépine jusqu'à ce que tout ce qui reste est les tissus conjonctifs blancs.
5. Rincer les crépines de cellules deux fois avec 500 ul DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA.
6. Transférer la totalité du volume du puits dans un tube de 50 ml à travers un tamis cellulaire de 70 pm.
7. Rincer le puits avec 500 ul de DPBS 1x + 2% de FBS + 2 mM d'EDTA et transférer le volume dans le tube de 50 ml. Garder le tube sur la glace.
   NOTE: Les différentes étapes pour isoler les cellules totales de la peau et des tissus dLn sont résumés dans la figure 5.

1. Centrifuger la peau et des échantillons dLn pendant 5 min à 450 xg à 4 ° C et jeter le surnageant. Resuspendre doucement le culot avec 300 DPBS ul 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA.
2. Prélever un petit volume de chaque échantillon pour compter le nombre total de cellules isolées à partir de la peau et DLN en utilisant un hémocytomètre. Ajouter 0,04% de bleu trypan pour déterminer la viabilité cellulaire.

8. Blocage des non Antigène spécifique de reliure

1. Ajouter 10 pg / ml de CD16 non marqué d'anticorps / CD32 Fc-bloc. Incuber 20 min à 4 ° C (peut aller plus).
2. Ajouter 2 ml de froid 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Centrifuger l'échantillon pendant 5 min à 450 xg à 4 ° C et jeter le surnageant. Resuspendre doucement le culot avec 300 DPBS ul 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA et maintenir les échantillons sur la glace.

9. Peau Coloration et les cellules des ganglions lymphatiques myéloïdes

1. Incuber ski précédemment bloquén et dLn cellules avec Live Tracker / Dead (soit 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole ou DAPI), des anticorps spécifiques anti-CD45 et anti-CD11b isolé.
   NOTES: Afin d'enrichir les sous - populations de cellules myéloïdes d'intérêt, en particulier ceux rares, CD45 ⁺ cellules et les lymphocytes peuvent être respectivement purifiés à partir de la peau ou l' épuisement de la dLn par billes magnétiques cellules de facilitation tri. Etant donné que la plupart des cellules isolées à partir du DLN sont CD45 ^+, l'utilisation d'anticorps anti-CD45 est pas obligatoire. D'autres marqueurs peuvent être inclus pour identifier les sous-populations de cellules myéloïdes d'intérêt par la stratégie positive ou négative-gating. Dans ce protocole, les cellules myéloïdes recrutés dans le DLN ont été enrichies en excluant CD8a cellules ⁺ (tout le compartiment des cellules T peut être ciblé en utilisant anti-CD3 de l' anticorps spécifique).
2. Incuber 30 min à 4 ° C dans l'obscurité. Ajouter 500 DPBS ul 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA, centrifuger l'échantillon 5 min à 450 xg à 4 ° C et jeter le supernatant. Répéter deux fois l'étape de lavage.
3. Resuspendre les échantillons avec 300 DPBS ul 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. Transférer la totalité du volume dans un tube FACS à travers un tamis cellulaire de 35 pm. Rincer le filtre avec 100 DPBS ul 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA.
4. Exécutez les cellules colorées dans un cytomètre de flux. Porte en direct des cellules individuelles (DAPI ^-, FSC-W) pour exclure les cellules mortes et doublets. Terrain CD45 ⁺ CD11b ⁺ événements pour la peau (figure 6A) et (CD45 ⁺⁾ CD8a ^- CD11b ⁺ événements pour le DLN (figure 6B).

Nous avons récemment démontré que l' injection seringue-aiguille doses immunisantes de P. berghei sporozoïtes dans la peau de la souris induit un recrutement successif de polynucléaires neutrophiles suivie par les monocytes inflammatoires de la peau et dLn 19. La section protocole décrit ci - dessus détaille la procédure utilisée pour isoler avec succès des cellules myéloïdes en direct à partir des deux tissus après des injections multiples d' un grand nombre de sporozoïtes dans le derme de l' oreille (figures 1 et 2). Dans les 24 premières heures, la DLN (Figure 3) et le site d'injection de la peau (figure 4) ont été isolés et traités comme résumé dans la figure 5 pour analyser l'infiltration cellulaire en flux multi-paramétrique cytométrie. Dans l' ensemble, cette technique nous a permis d'isoler une moyenne 10 4 CD45 + CD11b + et 2.10 4 CD11b + cellules individuelles vivantespour la peau et dLn respectivement. La viabilité acceptable de cellules individuelles non-débris variait de 40-70% pour la peau et 70-90% pour le DLN. Comme le montre la figure 6, la fréquence des cellules myéloïdes dans la peau (CD45 + CD11b +) et le DLN (CD8a - CD11b +) fortement augmente suite à l' injection intradermique de RAS par rapport aux souris non infectées.

Figure 1: Je ntradermal injection de sporozoïtes dans l'oreille de la souris. (A) Image montrant l' injection intradermique de sporozoïtes dans le pavillon de l' oreille d'une souris anesthésiée. La face ventrale de l'oreille est stabilisé avec du ruban adhésif transparent précédemment placé sous un microscope à dissection. L'aiguille est insérée avec précaution sur la face dorsale de l'oreille, sous l'épiderme, avec le biseau vers le haut. (B - C) Les photos montrant la face dorsale du pavillon de l' oreille avant (B) et après (injection C) intradermique de 0,1-0,2 pi de la suspension parasitaire. Une papule caractéristique (flèche noire) est observable au niveau du site d'injection à la fin de l'opération. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

. Figure 2: Imagerie de sporozoïtes Déposés dans les Derme d'oreille de souris (A) La microscopie à fluorescence montrant RAS migration à partir du site d'injection (indiqué par les lignes en pointillés) dans la peau de la souris 15 min post-injection (barre d'échelle = 60 pm; 10X grossissement). Le chemin de sporozoïtes est représentée par la projection d'intensité maximale du signal fluorescent. Vert et rouge fluorescence remontrer respectivement la position du parasite dans la peau au début et après 10 secondes d'acquisition. (B) de grossissement supérieur de RAS (vert) injecté dans la peau (barre d'échelle = 20 pm; 25X grossissement). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Vidange ganglionnaire Processing (A) Image montrant la dissection du proximal auriculaire dLn après injection intradermique de bleu Evans à des fins de démonstration.. Après dislocation cervicale de la souris, le col est désinfectée avec 70% d'éthanol. Une première incision est réalisée dans la zone jugulaire-carotide avec des ciseaux tranchants et la peau est enlevée du champ opératoire. L'incision est étirée avec 2 pinces pour exposer le DLN qui apparaît grAyish par rapport au tissu environnant. Les tissus conjonctifs sont ensuite soigneusement pincés avec une pince sur le dessus de l'dLn et progressivement séparés de lui. Enfin, le DLN est extrait en plaçant une pince sous le tissu lymphoïde. (B) Photo montrant le dLn extrait dans une goutte de PBS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4:. Traitement de la peau de l' oreille Photos montrant les étapes successives pour traiter l'oreille inoculés. (A) Après la dislocation cervicale de la souris, l'oreille est désinfectée avec 70% d' éthanol et retiré avec des ciseaux et des pinces acérées stériles. (B - D) La dorsale et ventrale de l'oreille sont légèrement séparées par pincement et sstimulation à part la coupe se termine par deux pinces. (E) Image montrant les nageoires dorsales et ventrales aspects de l'oreille avant traitement enzymatique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5:.. Protocole Résumé Représentation schématique des étapes clés pour isoler les cellules totales de la peau et des tissus dLn S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6: myéloïde population de cellules isolées à partir de la peau de l' oreille et le proximal dLn FACS représentatifs parcelles montrant la.stratégie de gating pour analyser le compartiment myéloïde dans la peau (A) et le DLN (B). CD45 + CD11b + et CD8a - cellules CD11b + ont été bloqués sur le total des événements singulets en direct pour la peau et dLn respectivement. Pour chaque condition, 5 x 10 5 événements au total ont été acquises (2 épis et 2 dLn regroupés par échantillon). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.