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Article de méthode

Dérivation libre Feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines Cellules souches

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⸱

DOI :

10.3791/53806

⸱

3 mars 2016

 ,  , 
1The Center for Stem Cell Biology, Developmental Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Cancer Biology and Genetics Program, Gerstner Sloan-Kettering Graduate School, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 3Thermo Fisher Scientific

Dans cet article

Résumé

Ce travail décrit un protocole de différenciation in vitro pour produire pigmentées, mélanocytes matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines par une crête neurale et mélanoblaste étape intermédiaire en utilisant un protocole de 25 jours sans alimentation.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) représentent une plate-forme pour étudier le développement humain in vitro dans des conditions normales et pathologiques. Les chercheurs peuvent orienter la différenciation des hPSC dans le type de cellule d’intérêt en manipulant les conditions de culture pour récapituler les signaux observés au cours du développement. L’un de ces types de cellules est le mélanocyte, une cellule productrice de pigments d’origine de la crête neurale (NC) responsable de la protection de la peau contre les rayons UV. Ce protocole présente une extension d’un protocole de différenciation de la crête neurale in vitro actuellement disponible à partir de hPSC pour différencier davantage les NC en mélanocytes entièrement pigmentés. Les précurseurs de mélanocytes peuvent être enrichis à partir du protocole Neural Crest via une exposition programmée à des activateurs de la signalisation WNT, BMP et EDN3 dans des conditions de double inhibition SMAD. Les précurseurs de mélanocytes résultants sont ensuite purifiés et matures en mélanocytes entièrement pigmentés par culture dans un milieu sélectif. Les mélanocytes résultants sont entièrement pigmentés et se colorent de manière appropriée pour les protéines caractéristiques des mélanocytes matures.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) fournissent une plate - forme pour imiter la différenciation normale de façon évolutive pour la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues, et les thérapies de remplacement cellulaire 1-6. D'un intérêt particulier, hPSCs ouvrent des pistes pour l'étude difficile d'isoler ou de types rares / transitoires cellulaires où les échantillons des patients sont rares. Les cellules souches pluripotentes En outre, induites (CSPi) permettent aux chercheurs d'étudier le développement et la modélisation de la maladie d'une manière spécifique au patient de démêler les mécanismes uniques 1,2,7-11. Le protocole précédemment publié pour la différenciation des mélanocytes de hPSCs nécessite jusqu'à 6 semaines de différenciations et implique la culture de cellules avec un milieu conditionné à partir de cellules L-Wnt3a 12. Le premier protocole présenté par Mica et al. Et décrit ici produit des cellules pigmentées en trois semaines et supprime l'ambiguïté et les incohérences associées à un milieu conditionné.

mélanocytes are dérivé de la crête neurale, une population migratoire des cellules uniques aux vertébrés. La crête neurale est définie lors de la gastrulation et représente une population de cellules sur le bord de la plaque neurale, en bordure entre le neuronal et ectoderme non-neural. Au cours de la neurulation, le tissu nerveux évolue à partir d' une plaque de neurones pour former des plis neuraux, qui convergent vers la ligne médiane dorsale entraînant la 13,14 du tube neural.

Les cellules de la crête neurale émergent de la plaque de toit du tube neural, opposée à la notochorde et subissent une transition épithélio-mésenchymateuse avant de migrer loin de donner lieu à une population diverse de cellules différenciées. Le sort des cellules de la crête sont définies en partie par la localisation anatomique de la plaque de toit le long de l'axe du corps de l'embryon. les dérivés de cellules neurales comprennent des crêtes caractéristiques des deux lignées mésoderme (cellules musculaires lisses, les ostéoblastes, les adipocytes, les chondrocytes) et les cellules ectodermiques (mélanocytes, c Schwannaunes, neurones) 14. Les cellules souches de la crête neurale régulation positive du facteur de transcription SOX10 et peuvent être isolés par des cellules activées par fluorescence de tri avec des anticorps dirigés contre p75 et HNK1.

Les cellules de la crête neurale Fated pour devenir mélanocytes passent par un stade de mélanoblaste et régulent positivement KIT et MITF (microphtalmie associée facteur de transcription) 6,21 MITF est un régulateur maître du développement des mélanocytes et est un facteur de transcription responsable du contrôle beaucoup du développement des mélanocytes 22- 24. mélanoblastes humaines migrent vers la couche basale de l'épiderme où ils résident soit dans le renflement de cheveux ou entouré par les kératinocytes de l'épiderme (unités formant pigmentaires) pour servir de précurseurs des mélanocytes, pigmentées matures. La différenciation et la maturation des mélanoblastes dans les melanocytes pigmentés se produit concomitant avec la colonisation du bulbe pileux et l'expression de la filière de production de mélanine (TYRP1, TYR, et OCA2PMEL) 25,26.

Isoler mélanocytes humains et mélanoblastes des patients est coûteux, difficile et de limiter en quantité. Ce protocole permet aux chercheurs de différencier hPSCs (induite ou embryonnaire) dans les mélanocytes ou des précurseurs de mélanocytes dans un procédé rapide, reproductible, évolutive et économique bien défini sans tri cellulaire. Le protocole a été précédemment utilisé pour identifier des défauts spécifiques de la maladie lors de la différenciation iPSCs des patients atteints de troubles de la pigmentation.

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Protocole

NOTE: Le protocole de mélanocytes décrit ici a été démontrée par Mica et al.

1. Vaisselle Préparation du milieu de culture, enduit et entretien de hPSCs

  1. moyen Préparation
    Remarque: Conserver tout milieu à 4 ° C dans l'obscurité pendant 2 semaines. Filtrez tous les moyen de stérilisation.
    1. Préparer DMEM / 10% de FBS. Mélanger 885 ml de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml Pen / Strep et 5 ml L-glutamine. Filtre pour la stérilisation.
    2. Préparer CSEh moyen. Mélanger 800 ml de DMEM / F12, KSR 200 ml, 5 ml de L-glutamine, de 10 ml de MEM au moins une solution d'acides aminés essentiels, 1 ml de ß-mercaptoethanol et 5 ml Pen / Strep. Après filtration à ajouter 10 ng / ml de FGF-2.
    3. Préparer le milieu KSR-différenciation: Mélanger 820 ml de DMEM knock-out, 150 ml KSR, 10 ml de L-Glutamine, 10 ml Pen / Strep, 10 ml de MEM minimum solution d'acides aminés essentiels et 1 ml de β-mercaptoéthanol. Filtre pour la stérilisation.
    4. Préparer le milieu N2-différenciation. Dissoudre 12 g DMEM / F12 poudre in dH 2 O. 980 Ajouter 1,55 g de glucose, 2 g de bicarbonate de sodium et 100 mg de transferrine humaine. Mélanger 2 ml de dH2Û avec 25 mg d' insuline humaine et 40 pi de NaOH 1 N; Une fois dissous, ajouter le mélange au support. Ajouter 100 pi de dichlorhydrate de putrescine, 60 ul sélénite, 100 ul de la progestérone. Amener le volume final à 1 l avec dH 2 O avant de filtrer.
    5. Préparer le milieu de mélanocytes complet. Mélanger 50% de milieu Neurobasal, 30% Low glucose DMEM, et 20% MCDB201. À ce module: 0,8% ITS + 250 nM de L-glutamine, 100 pM d'acide ascorbique (L-AA), 50 ng de toxine / ml de choléra, 50 ng / ml de SCF, 0,05 uM de dexaméthasone, 100 nM EDN3, 4 ng / FGF2 ml . Filtre stérile puis ajouter les réactifs restants: supplément de 2% de B27, 25 ng / ml BMP4, 3 uM CHIR99021, 500 uM AMPc.
  2. Revêtement des plats Culture
    1. Effectuer le revêtement en utilisant la protéine gélatineux tel que Matrigel. Lors de l'ouverture, aliquoter et congeler Matrigel dans 1 ml de pièces pour éviter le gel répétitif dégel cycles. Décongeler et re-suspendre une aliquote de 1 ml congelé avec 19 ml de DMEM / F12. Planche 5 ml sur un plat de 10 cm. Incuber les boîtes pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer la protéine gélatineuse immédiatement avant l'étalement des cellules et laver avec DMEM / F12.
    2. Effectuer le revêtement en utilisant Poly-L ornithine bromhydrate / souris laminine-I / fibronectine (PO / Lam / FN). Antenne Coat avec du PBS contenant 15 ug / Poly-L ml ornithine bromhydrate. Incuber O / N à 37 ° C dans un incubateur humidifié. Aspirer la solution et laver les plaques avec du PBS trois fois avant le revêtement avec du PBS contenant 1 pg / ml de laminine de souris-I et 2 pg / ml de fibronectine. Incuber les boîtes O / N à 37 ° C dans un incubateur humidifié.
      1. Avant le plaquage des cellules, aspirer la solution et on laisse les plaques sécher complètement sans couvercle dans la hotte de culture tissulaire. Laisser les plaques à sécher pendant environ 10-15 min.
        Remarque: Les plats sont secs et prêts pour le placage cellulaire lorsque des structures cristallines apparaissent à la surface par les yeux. Le plates peuvent être conservées avec du PBS contenant LAM / PN dans l'incubateur pendant deux semaines, aussi longtemps que le liquide ne s'évapore. Les plaques peuvent être conservées séchées à température ambiante pendant quelques heures.
  3. Entretien de hPSCs
    Note: hPSCs sont maintenus à 0,1% de gélatine et de fibroblastes embryonnaires de souris mitotique inactivé (MEF) dans CSEh-moyen. Les cellules doivent être divisées tous les 6-8 jours.
    1. Enduire un plat de 10 cm avec 0,1% de gélatine dans du PBS à température ambiante pendant 5 min.
    2. Décongeler MEFs congelés rapidement dans un bain d'eau à 37 °.
    3. Aspirer la gélatine et de la plaque les cellules. FAE en plaques à une densité de ~ 50000 cellules / cm2 dans du DMEM / 10% de FBS. Incuber MEFs à 37 ° CO / N avant d'ajouter hPSCs.
    4. Aspirer le% de FBS DMEM / 10 à partir de la plaque MEF préparée, laver la plaque avec du PBS et ajouter 10 ml CSEh-milieu avec hPSCs. Le passage hPSCs dans un rapport de 1: 5/10 en fonction de la densité avant le repiquage.
      Remarque: Si les hPSCs sont décongelés ou repiquées comme des cellules individuelles, supcomplément avec 10 uM Y-27632 dichlorhydrate (Rocki) jusqu'à ce que le premier passage.
    5. Nourrissez cellules par jour avec des produits frais 10 ml CSEh-moyen.
    6. Avant de commencer une différenciation éliminer toutes les colonies pluripotentes qui semblent contenir des cellules différenciées, des bords irréguliers, ou des centres transparents 28. Déloger mécaniquement et aspirer les colonies irrégulières avec une pipette sous une hotte à flux laminaire avec un microscope à dissection.

2. Placage de hPSCs pour Différenciation

Remarque: Les conditions de différenciation sont décrites pour boîtes de 10 cm.

  1. Préparer 10 cm plats Matrigel avant de commencer la différenciation comme décrit à l'étape 1.3.1.
  2. Lorsque hPSCs placage pour une différenciation commencent avec une assiette de hPSCs à une densité prête pour le passage (~ 80% de confluence) aspirez le CSEh-milieu, laver avec du PBS et ajouter 3 ml de 0,05% de trypsine-EDTA aux cellules.
  3. Vigoureusement secouer le plat horizontally pendant 2 minutes tout en visualisant sous le microscope jusqu'à ce que le MEF décoller comme des cellules individuelles. Les colonies HPSC devraient rester attachés comme des colonies.
  4. Aspirer le trypsine après le MEF ont levé, mais avant que les colonies de hPSCs détachent.
  5. Ajouter 10 ml de CSEh-milieu contenant 10 uM Y-27632 dichlorhydrate à la plaque et détacher les cellules par pipetage de haut en bas sur les colonies.
  6. Aspirer la solution Matrigel de l'antenne de 10 cm préparé à l'étape 2.1 et laver avec DMEM / F12 pour éliminer les grumeaux. Plate les hPSCs à un rapport 1: 2 sur la plaque Matrigel. Ajouter CSEh-milieu contenant 10 uM Y-27632 dichlorhydrate jusqu'à 10ml. Incuber à 37 ° CO / N.
    Remarque: Ce placage devrait se traduire par environ 100 000 cellules / cm2.

3. Induction of Neural Différenciation

Remarque: La différenciation doit être initié (jour 0), lorsque les hPSCs sont confluentes à 80%. Les cellules peuvent être nourris quotidiennement avec CSEh-moyencontenant 10 uM Y-27632 dichlorhydrate jusqu'au début de la différentiation.

  1. Le jour 0 et le jour 1, nourrir les cellules avec 10 ml de milieu KSR-différenciation contenant 100 nM LDN193189 et 10 uM SB431542.
  2. Le jour 2, nourrir les cellules avec 10 ml de milieu KSR-différenciation contenant 100 nM LDN193189, 10 uM SB431542 et 3 uM CHIR99021.
  3. Au jour 3, alimenter les cellules avec 10 ml de milieu KSR-différenciation contenant 10 uM SB431542 et 3uM CHIR99021.
  4. Aux jours 4 et 5, l'alimentation des cellules avec 15 ml de 75% de milieu KSR-différenciation et de 25% de milieu N2 contenant 3 uM de différenciation CHIR99021.
    Note: Ne vous inquiétez pas de voir une grande quantité de mort cellulaire en termes de cellules flottantes. Ceci est normal et à prévoir.
  5. Aux jours 6 et 7 d'alimentation des cellules avec 15 ml de 50% de milieu KSR-différenciation et de 50% de milieu N2 contenant à la fois la différenciation 3uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 et 100 nm EDN3.
  6. Les jours 89 et l'alimentation des cellules avec 20 ml de 25% de milieu KSR-différenciation et de 75% de milieu N2 contenant à la fois la différenciation 3uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 et 100 nm EDN3.
  7. Les jours 9 et 10 préparer des plats PO / Lam / FN comme indiqué dans 1.2.2 pour re-placage des cellules le jour 11.
  8. Au jour 10 cellules d'alimentation avec 20 ml de milieu N2 contenant 3 uM différenciation CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 et 100 nm EDN3.

4. réensemencement en Droplets pour des spécifications NC

  1. Le jour 11 aspirée Lam / FN des PO / LAM / plaques préparées FN et sécher complètement.
  2. Retirer moyen des cellules Jour 11, laver avec du PBS et ajouter 4 ml de solution de détachement des cellules telles que Accutase par boîte de 10 cm. Incuber pendant 25 min à 37 ° C.
  3. Ajouter 5 ml de milieu complet mélanocytes dans le plat et remettre les cellules par pipetage manuellement de haut en bas avec une pipette de 10 ml jusqu'à ce que toutes les cellules ont soulevé la plaque. Transférer la suspension dans un tube de 15 ml.
  4. Faites tourner lacellules vers le bas pendant 5 minutes à 200 xg et remettre les cellules à 2 x 10 6 cellules par ml dans un milieu complet mélanocytes. Compter les cellules en utilisant l'exclusion du bleu trypan sur un hémocytomètre ou technique équivalente.
  5. Planche 10 pi gouttelettes proches les uns des autres (sans les toucher) sur les séchées PO / Lam / FN boîtes de 10 cm. Si la plaque a été suffisamment séchée, les gouttelettes auraient bien bords définis et ne pas courir.
    Note: Ceci crée un environnement local à haute densité pour les cellules, ce qui est important lorsque les plaquant les cellules, tout en maintenant la pièce dans la boîte d'expansion.
  6. Laisser les gouttelettes de se tenir à température ambiante pendant 10-20 min pour permettre aux cellules d'adhérer, puis lentement (ne pas déranger les cellules attachées) ajouter 10 ml de milieu complet mélanocytes. Déplacer plat à l'incubateur.

5. Expansion mélanocytes progéniteurs

  1. Continuer l'alimentation avec un milieu de mélanocytes complet tous les 2 à 3 jours.
    Remarque: Pigmentation devrait commencer à être visible wurant amas de cellules à la fin de la première semaine et devenir très clair par la deuxième semaine. Voir la plaque sur un fond blanc, tel qu'une feuille de papier pour discerner ces petites grappes sombres premières. Les cellules deviendront progressivement plus pigmentée au fil du temps, jusqu'à ce que la totalité de la plaque est uniformément pigmentés (voir la figure 2B).
  2. cellules Passage une fois par semaine à un rapport de ~ 1: 6 (dépôt sous forme de gouttelettes est plus nécessaire à ce stade). Utilisez Accutase pour dissocier les cellules et laver deux fois avec un milieu ordinaire Neurobasal avant de re-placage dans un milieu complet mélanocytes. Maintenir les cellules sur PO / LAM / plaques FN.
    Note: Nous avons constaté que le moyen complet mélanocytes est le mieux adapté pour le maintien et l'expansion de CSEh et mélanocytes iPSC dérivées. Cependant, les cellules peuvent être cultivées dans brièvement disponibles dans le commerce à moyen M254 mais les médias simplifié augmente le risque de cellules mortes et de levage de la plaque.

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Résultats

Ce protocole fournit un procédé pour dériver, les mélanocytes matures totalement pigmentées à partir hPSCs d'une manière in vitro libre dispositif d' alimentation, rentable et reproductible. Par contraste avec les Fang et al. Protocole précédemment établie pour les mélanocytes HPSC dérivés, le protocole décrit ne nécessite pas de milieu conditionné et diminue l'exigence de temps. Le protocole Fang et al. , Utilise un milieu conditionné provenant d&#...

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Discussion

Pour la différenciation réussie de mélanocytes de hPSCs les suggestions suivantes devraient être prises en considération. Tout d'abord, il est essentiel de travailler dans des conditions de culture stériles en tout temps. En outre, il est important de commencer par pluripotentes, hPSCs complètement indifférenciées; si la population de départ contient des cellules différenciées, le rendement sera invariablement tomber que les contaminants ne peuvent pas être dirigées vers mélanocytes et peuvent encore perturber les c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont aucun intérêt à divulguer contradictoires.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une bourse pour les chercheurs de mélanome de la Fondation M. Joanna Nicolay et par les Instituts nationaux de la santé en vertu de Ruth L. Award Research Service national Kirschstein F31. Ce travail a également été soutenu par des subventions de NYSTEM et l'initiative sur les cellules souches Tri-institutionnelle (Starr Foundation).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
apo transfert humainSigmaT1147
Acide ascorbique (L-AA)SigmaA4034100 mM
B27 (supplément B27)Invitrogen17504044
&beta ;-MercaptoethanolGibco-Life Technologies21985-02310 mg/ml
BMP4R& D Systems314-bp
CHIR99021Tocris-R& D Systems44236 mM
Toxine cholériqueSigmaC805250 mg/ml
AMPc (AMPc cyclique)SigmaD0627100 mM
DexaméthasoneSigmaD2915-100MG50 &mu ; M
DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle MediumGibco-Life Technologies11985-092
DMEM/F12 - Dulbecco’s Modified Eagle Medium : Mélange de nutriments F-12Gibco-Life Technologies1133--032
DMEM/F12poudre Invitrogen12500-096
EDN3 (Endothéline-3, humain)American Peptide Company88-5-10B100 &mu ;
M FibronectineBD Biosciences356008200 &mu ; g/ml
de gélatine (PBS sans Mg/Ca)en interne0,1 % dans PBS
GlucoseSigmaG7021
Insuline humaineSigmaI2643
ITS+ Universal Culture Supplement Premix  ;BD Biosciences354352
KSR (Knockout Serum Replacement)Gibco-Life Technologies10828-028
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
L-GlutamineGibco-Life Technologies25030-081
LDN193189Stemgent04-0074100 mM
Faible teneur en glucose DMEMInvitrogen11885-084
Matrigelmatrix BD Biosciences354234Dissoudre 1:20 dans DMEM/F12
MCDB201 MediumSigmaM6770
MEM minimum essential amino acids solutionGibco-Life Technologies11140-080
Fibroblastes embryonnaires de souris (7 millions de cellules/flacon)GlobalStemGSC-8105M
Laminin-I de sourisR& D Systems3400-010-011 mg/ml
Milieu neurobasalInvitrogen21103049
Péniciline/StreptomycineGibco-Life Technologies15140-12210 000 U/ml
Poly-L Bromhydrate d’omithineSigmaP365515 mg/ml  ;
ProgestéroneSigmaP87830,032 g dans 100 ml 100 % éthanol
Chlorhydrate de putrescineSigmaP5780
FGF2 (FGF humain recombinant basique)R& D Systems233-FB-001MG/CF10 mg/ml
SB431542Tocris-R& D Systems181410 mM
SéléniteSigmaS5261
Bicarbonatede sodium SigmaS5761
SCF (Facteur de cellules souches humaines recombinantes)  ;Peprotech Inc.300-0750 &mu ; g/ml
TYRP1 (G-17) AnticorpsSanta Cruz104431:200
Anticorps TYRP2Abcam740731:200
Trypsine-EDTA (0,05 %)Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 dichlorhydrateTocris-R& D Systèmes125410 mM

Références

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Mots-clés

Diff renciation des m lanocytesdiff renciation de la cr te neuralesignalisation WNT BMP EDN3inhibition double SMADculture en milieu s lectifenrichissement des pr curseurs des m lanocytesm lanocytes pleinement pigment ssolution de d tachement cellulairerev tement de laminine et de fibronectine PO
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