Article de méthode

Contrôle optique d'une protéine Neuronal L'utilisation d'un acide aminé Unnatural génétiquement codificateur dans Neurones

DOI :

10.3791/53818

⸱

28 mars 2016

 ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, une procédure permettant d’activer sélectivement une protéine neuronale avec une courte impulsion de lumière en codant génétiquement un acide aminé non naturel photo-réactif dans une protéine neuronale cible exprimée dans les neurones en culture ou in vivo est présentée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La photostimulation est un moyen non invasif de contrôler les événements biologiques avec une excellente résolution spatiale et temporelle. De nouvelles méthodes sont souhaitées pour photoréguler les protéines endogènes exprimées dans leur environnement natif. Ici, nous présentons une approche pour contrôler optiquement la fonction d’une protéine neuronale directement dans les neurones à l’aide d’un acide aminé non naturel (Uaa) génétiquement codé. En utilisant une paire orthogonale ARNt/aminoacyl-ARNt synthétase pour supprimer le codon ambré, une Uaa 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyl-cystéine photoréactive (Cmn) est incorporée localement dans le pore d’une protéine neuronale Kir2.1, un canal potassique rectifiant vers l’intérieur. Le Cmn encombrant bloque physiquement le pore du canal, rendant Kir2.1 non conducteur. L’éclairage lumineux convertit instantanément Cmn en un acide aminé naturel plus petit Cys, activant la fonction de canal Kir2.1. Nous exprimons ces canauxpotassiques p hoto-inductables (PIRK) dans les neurones primaires de l’hippocampe du rat, et démontrons que l’activation lumineuse de PIRK cesse le décharge neuronale en raison de l’écoulement du courant K+ à travers les canaux Kir2.1 activés. En utilisant l’électroporation in utero, nous exprimons également PIRK dans le néocortex embryonnaire de souris in vivo, montrant l’activation lumineuse de PIRK dans les neurones néocorticaux. Le codage génétique de l’Uaa n’impose aucune restriction sur le type de protéine cible ou l’emplacement cellulaire, et une famille d’Uaas photoréactifs est disponible pour moduler différents résidus naturels d’acides aminés. Cette technique a donc le potentiel d’être généralement appliquée à de nombreuses protéines neuronales pour réaliser une régulation optique de différents processus dans le cerveau. Le protocole actuel présente une procédure accessible pour l’incorporation complexe d’Uaa dans les neurones in vitro et in vivo afin d’obtenir un photocontrôle de l’activité des protéines neuronales au niveau moléculaire.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Par rapport à la stimulation électrique classique, photostimulation offre une plus grande résolution temporelle et spatiale avec un minimum d'interférences dans le système physiologique de spécimens. Depuis la démonstration de l' utilisation de lasers pour stimuler les neurones en 1971 1, de nombreuses façons créatives ont été inventés pour contrôler l' activité neuronale exogène avec la lumière. Libération optique des agonistes photocaged a longtemps été utilisé pour étudier la réponse physiologique du réseau neuronal à des ligands 2,3,4. Cette technique a limité la spécificité due à la diffusion des agonistes en cage. Spécificité génétique est obtenue en exprimant de manière ectopique canaux opsin sensibles à la lumière et des pompes 5,6,7, et elle a été appliquée avec succès pour moduler des réseaux neuronaux sélectionnés dans des organismes modèles divers. Cependant, il serait difficile d'appliquer cette méthode pour contrôler optiquement diverses autres protéines neuronales, étant donné que le greffage photoresponsiveness à partir des protéines opsin à d'autres protéines would exiger l'ingénierie intense qui peut modifier les caractéristiques naturelles de la protéine à l'étude. Chimiquement attacher un ligand photosensible exogène à une protéine a montré une autre façon de contrôler la fonctionnalité des protéines de canal 8,9,10. Le ligand est présenté ou retiré du site de liaison de la protéine à travers la photoisomérisation du fragment azobenzène. chimie d'attache limite l'application principalement sur le côté extracellulaire de protéines membranaires, à l'exclusion du côté intracellulaire et des protéines intracellulaires.

Photosensibles Uaas, après avoir été incorporé dans les protéines, fournir une stratégie générale pour manipuler les protéines avec de la lumière. Dans les premiers efforts, ARNt acylé chimiquement avec Uaas photocaged ont été microinjection dans des ovocytes de Xenopus pour incorporer les Uaas dans des récepteurs membranaires et des canaux ioniques 11, qui ont fait progresser la compréhension de leurs relations structure-fonction 12,13,14.Cette approche de microinjection est principalement limitée aux grandes ovocytes. Incorporation génétique d'un Uaa contourne le défi technique ARNt acylation et microinjection en utilisant une paire ARNt / synthétase orthogonale, qui intègre le Uaa grâce à la traduction de protéine endogène dans les cellules vivantes 15,16,17,18. UAA incorporation dans les protéines neuronales a été démontrée dans des neurones primaires et des cellules souches neurales 19,20. Plus récemment, Uaa photoréactif a été génétiquement incorporé dans une protéine neuronale dans le cerveau d'un mammifère in vivo pour la première fois 21. Ces avancées permettent d'étudier les protéines neuronales avec Uaas dans leur environnement cellulaire natif.

Rectification entrante du canal potassique Kir2.1 est un redresseur solide qui passe courants K + plus facilement dans qu'à l' extérieur de la cellule, et il est essentiel dans la régulation des processus physiologiques tels que l' excitabilité cellulaire, le tonus vasculaire, la fréquence cardiaque, reflux de sel finale et la libération d' insuline 22. La surexpression de Kir2.1 hyperpolarise le potentiel de membrane du neurone cible, qui devient moins excitables 23,24. Pour contrôler optiquement Kir2.1 dans ses cellules natives, Kang et al. Génétiquement incorporé un Uaa photo-sensible en Kir2.1 exprimé dans les cellules de mammifères, les neurones et les cerveaux de souris embryonnaires 21. Une brève impulsion de lumière a été en mesure de convertir le Uaa en un acide aminé naturel Cys, activant ainsi la cible protéine Kir2.1. Lorsque cette potassium à rectification entrante (PIRK) protéine de canal photo-inductible de rat a été exprimé dans les neurones hippocampiques primaires, on supprime la décharge neuronale en réponse à l'activation par la lumière. En outre, le canal de PIRK a été exprimé dans le néocortex embryonnaire de la souris et le courant PIRK activé par la lumière dans les neurones corticaux a été mesurée. La mise en œuvre réussie de la technologie Uaa in vivo dans le cerveau des mammifères ouvre la porte à contrôler optiquement protéines neuronalesdans leur environnement natif, ce qui permettra à la dissection optique des processus et des mécanismes neuronaux au niveau moléculaire.

Dans ce protocole , nous décrivons les procédures d'incorporation génétique des Uaas dans les neurones primaires en culture et dans le cerveau de souris embryonnaires in vivo. Le photoréactif Uaa Cmn et Kir2.1 sont utilisés pour illustrer le processus. Des méthodes pour évaluer l'incorporation réussie Uaa et le contrôle optique de l'activité de la protéine neuronale sont fournis. Ce protocole fournit un guide clair génétiquement codant Uaas dans les neurones et in vivo, et de réguler optiquement fonction de la protéine neuronale via un Uaa photosensible. Nous nous attendons à ce protocole pour faciliter l'adoption de la technologie Uaa in vivo pour les neurosciences et les études biologiques optogénétiques.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures de la présente étude ont été effectuées en utilisant des protocoles pour la manipulation des animaux au Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, en Californie Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) approuvé

1. Uaa Incorporation dans Kir2.1 et expression de l'Resultant PIRK dans la Neuronal Culture primaire

  1. ADN Construction
    1. Sélectionnez un site cible de Kir2.1 pour Uaa incorporation. Exploiter les connaissances antérieures et des informations sur la structure et la fonction de Kir2.1, de sorte que le site choisi avec le photoréactif Uaa incorporé permet une modulation optique de la fonction Kir2.1 21.
    2. La construction d'un gène Kir2.1 d'ADN recombinant codant pour le site choisi muté au codon d'arrêt TAG ambre. Utilisez les techniques de clonage standard 25 pour cloner l'ADN Kir2.1-TAG dans un plasmide d'expression de mammifère.
    3. Clone ARNt gènes / synthétase qui sont spécifiques pour l'UAA et intègrent le Uaa en réponse àle codon d'arrêt TAG dans un autre plasmide d' expression de mammifère 21.
      Remarque: Pour optimiser l'incorporation UAA, différents promoteurs et des combinaisons de cassettes de gènes (par ARNt synthétase, et Kir2.1) peuvent être testés dans des plasmides différents.
    4. Obtenir un ADN de plasmide de haute qualité en utilisant miniprep ou MaxiPrep kits commerciaux selon le protocole du fabricant. Autour de 1,9 du ratio 260/280 est optimal pour l'ADN purifié. Si nécessaire, effectuer une électrophorèse sur gel d' agarose pour vérifier la pureté de l'ADN préparée 25. Superenroulé ADN plasmidiques avec une grande pureté sont les meilleurs pour la transfection neuronale.
  2. Culture Rat hippocampique Neurones primaire
    1. lamelles Lieu de verre (cercles, 12 mm de diamètre) dans des plaques à 24 puits, une lamelle sur chaque puits, et enrober chaque puits avec 250 pi de 0,5 mg / ml de poly-D-lysine (dans 100 mM de tampon borate: 1,24 g borique tétraborate de sodium et 1,90 g d' acide dans 400 ml d' eau désionisée distillée H 2 O ou 2 ddH O à pH 8,5) pour plus de 10 heures à la température ambiante, scellé. Préparer environ 10-12 lamelles recouvertes par chiot.
    2. Le jour de la dissection, recueillir les cerveaux néonatales de bébés rats postnataux (1-4 jour postnatal) après les anesthésier avec isoflurane et décapitant. Anesthetize les chiots dans une chambre d'anesthésie contenant isoflurane (2-4%). Attendez jusqu'à ce qu'ils perdent conscience et ne parviennent pas à répondre à des stimuli tactiles et de pincement des pattes.
    3. En utilisant la technique standard 26, disséquer hippocampes du cerveau dans un endroit chaud (~ 37 ° C) une solution saline (10 mM de HEPES et 20 mM de D-glucose ajoutée dans une solution saline équilibrée de Hank), et collecter des hippocampes dans un tube conique de 4,5 ml de sérum physiologique tiède .
    4. Ajouter 500 ul de 2,5% de trypsine à hippocampes (0,25% de concentration finale de la trypsine) et laisser incuber pendant 10 minutes dans un bain-marie à 37 ° C.
    5. Rincer soigneusement le tissu avec une solution saline (3 x 10 ml) et trituré.
    6. Récupérer les neurones dissociés dans 1 ml wdes milieux de croissance contenant du bras du milieu essentiel minimum (MEM) additionné de 5% de sérum bovin fœtal (FBS), 21,2 mM de D-glucose, 2 mM de L-glutamine, 2% B-27 et de dilution du sérum à 0,1%.
      Note: Ajouter la L-glutamine et B-27 le jour de la dissection pour préparer un milieu de croissance frais.
    7. Compter les neurones avec un hémocytomètre et la plaque eux sur des lamelles dans des plaques 24 puits à raison de 1,0 à 1,5 x 10 5 cellules / puits avec une densité du milieu de croissance de 500 microlitres après filtration à travers une maille de nylon de 40 pm.
    8. Incuber la culture des neurones à 35 ° C dans 5% de CO2: 95% d' air humidifié incubateur pendant 2-3 semaines. Pour le meilleur résultat, ne pas perturber la culture autant que possible au cours de l'incubation.
  3. Le phosphate de calcium (Ca-P) Transfection de la culture primaire Neuronal
    1. Faire des solutions mères et conserver à 4 ° C: 0,5 M BES (N, N -bis [2-hydroxy-éthyl] -2-aminoéthanesulfonique acide) tampon (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M de NaCl (10x); ddH stérile 2 O; NaOH stérile N 1.
    2. Le jour de la transfection, faire fraîche M solution 2,5 CaCl 2 en ddH 2 O et le filtre stérile avec filtre de 0,22 um. Faire 2x frais BES tamponnée Saline (BBS) contenant BES 50 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4 et NaCl 280 mM à pH 7,00 (ajuster le pH avec NaOH) et le filtre stérile avec filtre de 0,22 um.
      Remarque: Calculer la quantité de solution de CaCl 2 et du tampon BBS en fonction du nombre de lamelles à transfecter. Regardez aussi 1.3.4.
    3. Remplacez le support de croissance de la culture avec 500 milieux de croissance de transfection préchauffée ul frais. (Milieu de transfection peuvent être fabriqués avec du MEM, plus 21,2 mM de D-glucose).
      Note: Ne pas jeter les anciens médias.
    4. Calculer la quantité de ddH 2 O et se préparer à ajouter afin de rendre la solution de transfection (33 pi par chaque lamelle) contenant 1,65 ul de CaCl2, 0,7 pg d' ADN, et 16,5 &# 181; l 2x BBS.
    5. Préparer immédiatement la solution de transfection avant de l'ajouter à la culture. Pour préparer, d' abord combiner CaCl 2 et ddH 2 O tout en agitant doucement le tube. Continuer à agiter et ajouter lentement de l'ADN dans la solution. Enfin, ajouter goutte à goutte tampon 2x BBS tout en agitant.
    6. Immédiatement ajouter 30 ul de solution de transfection à chaque lamelle de la culture des neurones.
    7. Rock the boîte de culture à quelques reprises pour mélanger la solution et incuber à 35 ° C dans un 5% de CO 2: 95% d' air incubateur humidifié pendant 45 min-1 heure. Après que les neurones sont incubés avec la solution de transfection, des précipités très fins Ca-P formeraient une couche recouvrant les neurones.
    8. Remplacer le milieu de transfection de 500 ul préchauffée tampon de lavage (135 mM de NaCl, 20 mM d' HEPES, 4 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM de Na 2 HPO 4, 10 mM de glucose à pH 7,3, stériles filtrée avec filtre de 0,22 um) et incuber à 356; C dans un 5% de CO 2: 95% d' air humidifié incubateur pendant 15-20 min. Ca-P précipités disparaîtraient après l'étape de lavage.
    9. Remplacer le tampon de lavage avec 500 ul de milieu de croissance frais. Encore une fois, remplacer le milieu de croissance avec le support d'origine enregistrée.
    10. Ajouter l'Uaa Cmn (pré-mélangé dans 50 ul de milieux de culture chaud) à la culture pour atteindre 1 mM de concentration finale.
    11. Incuber la culture transfectées à 35 ° C dans 5% de CO2: 95% d' air humidifié incubateur pendant 12 à 48 heures avant les essais.
  4. Le total d'enregistrement portable avec activation Lumière
    1. Préparer des solutions supplémentaires / intracellulaires. La solution intracellulaire contenant 135 mM de gluconate de potassium, 10 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, 1 mM d' EGTA, 2,56 mM de K 2 ATP et 0,3 mM de GTP Li 2 à pH 7,4. La solution d'enregistrement extracellulaire contient du NaCl 150 mM, KCl 3 mM, 5 mM de MgCl2, 0,5 mM de CaCl 2, 5 mM de glucose et 10 mM de HEPES à pH 7,4.
    2. Mettre en place la plate-forme d'électrophysiologie pour le patch de cellule entière serrage: microscope équipé de 4X et 20X objectifs, le contraste d'interférence différentiel (DIC), et le filtre mCitrine (excitation: 495/10 nm, émission: 525/25 nm); manipulateur; amplificateur patch-clamp; numériseur; l'acquisition de données et de logiciels d'analyse.
      1. Installez une diode électroluminescente (LED) avec une émission de 385 nm par le microscope à la plate-forme pour fournir de la lumière au point focal de 1 cm à un angle de 45 °. Vérifiez la puissance de la LED avec un compteur de puissance lumineuse.
    3. Tirez pipettes de patch à partir d'électrodes de verre en utilisant un extracteur micropipette commercial pour avoir 3-6 Mohm de pipette. Suivez les instructions du fabricant pour mettre en place l'extracteur micropipette.
      1. Pour tester la résistance à la pipette, d'abord remplir la pipette avec la solution intracellulaire et le positionner sur le support d'électrode. Trempez la pipette dans une boîte de culture de 35 mm rempli de la solution extracellulaire, placé sur le microscope platform. Immergez une électrode de masse dans le plat pour compléter un circuit.
      2. Allumez l'amplificateur / numériseur et commencer un logiciel d'acquisition de données. Surveiller la résistance de la pipette à un protocole d'essai de la membrane.
    4. Prendre une lamelle couvre-objet de la culture des neurones de l'incubateur et rinçage une fois dans la solution extracellulaire. Utilisation de la graisse à vide, maintenez la lamelle au milieu d'une boîte de culture de 35 mm rempli de la solution extracellulaire frais.
    5. Placez la lamelle / plat sur la plate-forme électrophysiologie de microscope.
    6. En utilisant les techniques de patch de serrage standard, patcher un neurone avec mCitrine fluorescence 27. activité neuronale Enregistrer avec pince de courant de la méthode (I-clamp). En premier lieu, d'ajuster le potentiel de repos de -72 mV environ par injection d'un faible courant. Ensuite, d'injecter un courant de l'étape (10 à 200 pA) pour induire une cuisson en continu (5-15 Hz) des potentiels d'action.
    7. Manuellement ou en utilisant le logiciel d'acquisition de données, clignote une impulsion (un péchégle impulsion de 100 ms -1 durée sec) de la lumière LED au neurone lors de l' enregistrement, et voir si les potentiels d'action sont affectés.
    8. Ajouter mM BaCl2 0,5 au bain et à vérifier si les potentiels d'action sont récupérés.

2. Uaa Incorporation dans Kir2.1 et expression de l'Resultant PIRK dans le cerveau de souris embryonnaires in vivo

  1. ADN Construction
    1. Concevoir l'ADN plasmidique de manière similaire à l'étape 1.1. Pour l' expression in vivo, utiliser un promoteur fort tel que l' ACG (poulet bêta-actine promoteur CMV activateur).
    2. Purifier l'ADN avec un maxiprep kit commercial sans endotoxine selon le protocole du fabricant. Effectuer une extraction au phénol-chloroforme suivie par une précipitation à l'éthanol 25 pour acquérir l' ADN de très haute qualité (condensé à 2-5 pg / pl).
  2. In Utero électroporation à la souris embryonnaires néocortex
    Note: La techni baseQue in utero électroporation a été décrite précédemment 28.
    1. Anesthésier une souris enceinte chronométré au jour embryonnaire 14,5 (E14.5) avec du pentobarbital sodique (injection intraperitoneale, 50 pg par kg de poids corporel en grammes) ou isoflurane (par inhalation, 2-4%). Surveiller profondeur de l'anesthésie en vérifiant la perte de conscience et aucune réponse à des stimuli tactiles et de pincement des pattes.
    2. Faire une petite incision sur la ligne médiane abdominale. exposer doucement les cornes utérines avec des pinces et du bout des doigts.
    3. Injecteront environ 1 pi de solution d'ADN (2-5 pg / pl de chaque plasmide, en fonction de la construction) dans le ventricule latéral de chaque littermate avec une pipette en verre inséré à travers la paroi utérine. Dans la plupart des cas, environ 60 à 80% des embryons sont injectés au total.
    4. Électroporation les embryons avec un electroporator (33-35 V, 50 msec, 950 msec intervalle, 4-8 impulsions).
    5. Remettre les cornes utérines à la cavité abdominale doucement avec pourCèpes et du bout des doigts. Suturer la paroi musculaire et la peau avec une suture chirurgicale pour permettre aux embryons de poursuivre le développement.
  3. Uaa microinjection
    1. Faire une petite incision sur la ligne médiane abdominale à nouveau à E16,5, et d'exposer doucement les cornes utérines avec des pinces et du bout des doigts.
    2. Injecter environ 5/2 pi Cmn-Ala (500 mM), du côté électroporation ou les deux côtés du ventricule latéral avec une pipette en verre inséré à travers la paroi utérine. Pour augmenter la biodisponibilité Cmn, utilisez le dipeptide Cmn-Ala (CMN-alanine) pour délivrer Cmn in vivo 21.
    3. Encore une fois, retourner les cornes utérines à la cavité abdominale doucement avec une pince et le bout des doigts. Suturer la paroi musculaire et la peau avec une suture chirurgicale pour permettre aux embryons de poursuivre le développement.
  4. Obtenir aiguë tranches cerveau
    1. Faire 1 litre de liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) contenant du NaCl 119 mM, 2,5 mM de KCl, 1,3 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26,2 mM NaHCO 3, et 11 mM de glucose à pH 7,3.
    2. Prenez 200 ml ACSF et de congélation rapide à -80 ° C pendant 20-30 min. Bubble le reste de l' ACSF avec 5% de CO 2: 95% de O 2 gazeux à la température ambiante.
    3. Préparer et stériliser les outils de chirurgie pour récolter les cerveaux des embryons. Aussi préparer un seau de glace.
    4. Faire ~ solution d'agarose à bas point de fusion de 100 ml à 4% dans un flacon en chauffant dans un four micro-ondes. Refroidir solution pendant environ 5 min avant qu'il ne commence à se solidifier.
    5. Euthanasier la souris 12-24 h après l' injection Cmn-Ala par CO 2 surdosage. Faire de grandes incisions dans la zone abdominale, et de disséquer les embryons électroporées / microinjection de l'utérus avec des ciseaux fins et forceps.
    6. cerveaux de récolte des embryons avec des ciseaux fins et des pinces.
    7. Placez chaque cerveau sur une boîte de culture de 10 cm placé sur le seau à glace. Divisez deux hémisphères en utilisant une lame tranchante, et placer chaquehémisphère sur le plat avec le plan sagittal médian de toucher le fond du plat. Verser rapidement sur la solution d'agarose sur le cerveau (environ 500 pi par hémisphère).
    8. En utilisant une lame bien aiguisé, couper carré l'agarose autour d'un cerveau pour faire un bloc d'agarose cerveau intégré.
    9. Utilisation de tissu adhésif, colle vers le bas de la surface de plan sagittal médian du bloc d'agarose sur un support pour vibratome. Remplir la chambre de vibratome avec ACSF pré-réfrigérés et couper 200 um tranches de cerveau sagittal.
    10. Incuber tranches aiguës dans ACSF supplémenté avec 3 mM myo - inositol, l' acide ascorbique 0,4 mM et du pyruvate de sodium 2 mM à 33 ° C pendant 42 min tout en faisant barboter avec 5% de CO 2: 95% O 2 gazeux.
    11. Après 42 min, éteignez l'appareil et continuer à incuber les tranches à la température ambiante avec barbotage. Commencez à cellules entières d'enregistrement de patch au moins 15 minutes après avoir éteint le chauffage.
  5. Le total d'enregistrement portable avec activation Lumière
    1. Préparer le intracellular solution contenant 130 mM de gluconate de potassium, 4 mM de MgCl2, 5 mM de HEPES, 1,1 mM d' EGTA, 3,4 mM de Na 2 ATP, 10 mM de créatine phosphate de sodium et 0,1 mM de Na 3 GTP à un pH de 7,3 ajusté avec KOH.
    2. Tirez pipettes de patch à partir d'électrodes de verre en utilisant un extracteur micropipette commercial pour avoir 3-6 Mohm de pipette.
    3. Mettre en place la tranche électrophysiologie rig pour la cellule entière patch clamp et superfuse la chambre d'enregistrement avec ACSF à 2 ml / min débit d'une pompe à perfusion. Réglez la température de la chambre à environ 33 ° C.
      Remarque: La plate-forme tranche d'électrophysiologie est équipée d'une chambre de perfusion, d'un objectif à immersion dans l'eau et un régulateur de température. En outre, le filtre de la GFP (excitation: 480/30 nm, émission: 535/40 nm) et le filtre mCherry (excitation: 580/20 nm émission: 675/130 nm) sont nécessaires.
      1. Installez une LED avec une émission de 385 nm par le microscope à la plate-forme pour fournir de la lumière au point focal de 1 cm à 45 °angle. Vérifiez la puissance de la LED avec un compteur de puissance lumineuse.
    4. Prenez soigneusement une tranche de cerveau avec une pipette en verre et placer dans la chambre de perfusion. Maintenez la tranche avec une harpe.
    5. Patch un neurone avec fluorescence mCherry / GFP de la région du néocortex 27. activité PIRK d'enregistrement à l'aide de verrouillage de tension de la méthode (V-clamp). Tout d'abord, maintenir le potentiel de membrane à -60 mV. Puis, fiche courants à des potentiels fixes négatifs de la membrane (-100 mV) ou des rampes de tension (-100 mV à +40 mV). Plus précisément, surveiller Kir2.1 courants entrants spécifiques à -100 mV.
    6. Manuellement ou en utilisant le logiciel d'acquisition de données, clignote une impulsion (une seule impulsion de 100 ms -1 durée sec) de la lumière LED au neurone lors de l' enregistrement, et voir si les protéines Pirk sont activées. Une fois PIRK est activé, courants entrants à -100 mV augmenteraient considérablement.
    7. Ajouter mM BaCl2 0,5 au bain et à vérifier si PIRK est inactivée à nouveau.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour incorporer génétiquement un Uaa en une protéine dans les neurones, la première étape importante consiste à concevoir gène approprié construit pour délivrer et exprimer des gènes efficacement dans les neurones. Il y a trois composantes génétiques pour Uaa incorporation: (1) le gène cible avec le codon d'arrêt TAG ambrée introduit au site choisi pour Uaa incorporation (2) un ARNt orthogonal à reconnaître le codon d'arrêt TAG muté, et (3) une aminoacyl orthogonale -tRNA synthétase pour...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour réaliser la photo-modulation efficace, la première étape importante est de décider où incorporer le Uaa photosensible dans la protéine cible. Les informations structurelles et fonctionnelles de la protéine cible est très utile pour guider la sélection des sites candidats. Dans le même temps, le but de la réglementation lumière déterminerait quel site est le plus approprié. Après avoir choisi les sites candidats, nous vous recommandons de tester les sites dans des lignées cellulaires de mammifères tels que le rein e...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Dr S. Szobota pour sa discussion utile sur la culture des neurones et la transfection Ca-P. L.W. remercie le soutien de The Salk Innovation Grant, du California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1) et des National Institutes of Health (1DP2OD004744).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Verres de couverture, cercles, 12 mm, épaisseur 0,13-0,17 mmCarolina Biologicals633029
Corning BioCoat Poly-D-LysineCorning Discovery Labware354210
D-(+)-Glucose solutionSigma-AldrichG8769
Iris Spatule incurvéeFine Science Tool10092-12
Couteau à dissection - pointefine coudéeOutil de science fine10056-12
GlutaMAX-I SupplémentLife Technologies35050-061
MITO+ Extenseur de sérumBD Biosciences355006
Falcon 40 µ ; m Filtre cellulaireCorning Life Sciences352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyéthyl)-2-acide aminoéthanesulfonique, N,N-Bis(2-hydroxyéthyl)taurine)Sigma-AldrichB6420
SOURCE LUMINEUSE LED &ndash ; LED noire 385Prizmatix Ltd.
Agarose, point de fusion bas, qualité analytiquePromegaV2111

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239(2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Canal Kir2 1PIRK photo inductibleneurones hippocampiqueslectroporation in uterotransfection au phosphate de calciumactivation lumineuse

Articles connexes