Article de méthode

Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion In vitro

DOI :

10.3791/53823

⸱

19 mars 2016

 ,  ,  ,  , 
1Transfusion Research Center, Belgium Red Cross-Flanders, 2Blood Service, Belgium Red Cross-Flanders, 3Department of Public Health and Primary Care, Catholic University of Leuven, 4Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Ghent

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La transfusion de plaquettes et l’hémostase ont été modélisées à l’aide de la reconstitution sanguine et des chambres de flux microfluidique pour étudier la fonction des plaquettes de banque de sang. Les données démontrent les conséquences de la lésion de stockage plaquettaire sur l’hémostase, in vitro.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les plaquettes sanguines préparées pour la transfusion perdent progressivement leur fonction hémostatique pendant le stockage. La fonction plaquettaire peut être étudiée à l’aide d’une variété d’expériences in vitro (indirectes), mais aucune d’entre elles n’est aussi complète que les chambres d’écoulement microfluidique. Dans ce protocole, la reconstitution de sang frais thrombocytopénique avec des plaquettes de banque de sang stockées est utilisée pour simuler une transfusion de plaquettes. Ensuite, l’échantillon reconstitué est perfusé dans des chambres d’écoulement microfluidique qui imitent l’hémostase sur les protéines de la matrice sous-endothéliale exposées. Les effets du don de sang, du transport, de la séparation des composants, du stockage et de l’inactivation des agents pathogènes peuvent être mesurés dans des plans expérimentaux appariés. Cela permet une comparaison fiable de l’impact de chaque manipulation dans la préparation des composants sanguins sur l’hémostase. Nos résultats démontrent l’impact du cycle de température, des taux de cisaillement, de la concentration plaquettaire et de la durée de stockage sur la fonction plaquettaire. En conclusion, ce protocole analyse la fonction des plaquettes de la banque de sang, ce qui permet d’optimiser la chaîne de traitement, y compris la phlébotomie, le transport, la préparation des composants, le stockage et la transfusion.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hémostase exige l'activité combinée et régulée des cellules, des protéines, des ions et des tissus dans un contexte spatiotemporel limité 1. une activité non contrôlée peut conduire à une hémorragie ou d'une thrombose et de la morbidité ou de la mortalité dans un spectre de troubles liés à la coagulation du sang. Une expérience de la chambre d'écoulement microfluidique est une technique difficile qui imite l' hémostase in vitro. Cette approche permet d'étudier l'interaction complexe des processus qui prennent part à l'hémostase avec un rôle de premier plan pour les plaquettes sanguines.

Suite à une lésion vasculaire, les plaquettes adhèrent aux protéines matrice sous-endothéliale exposée (glyco) pour empêcher la perte de sang. À la suite de l' adhérence, les plaquettes d' activer et de l' agrégat en réponse à la signalisation automobile et paracrine qui conduit finalement à la formation d'un réseau de plaquettes stabilisées par la fibrine et résultant en un solide, d'une plaie 2 thrombus d' étanchéité. Contrairement à la plupart des autres tests de la fonction plaquettaire, EXPERIments avec des chambres d'écoulement prennent en compte le paramètre physique de l' écoulement sanguin et par conséquent l'influence de la rhéologie dans les cellules participant biomolécules et 3,4.

expériences en chambre de débit ont généré des idées marquantes de l'hémostase et de la thrombose en faisant varier les paramètres clés qui influencent hémostatique (sub) processus, y compris les profils matrice adhésive, rhéologie et de débit, la composition cellulaire, la présence de toxines ou des médicaments, la force ionique et beaucoup plus. Au cours des deux dernières décennies, à faible débit des expériences en chambre d'écoulement nécessitant des volumes d'échantillons de grande taille (10-100 ml) ont évolué vers des chambres microfluidiques souvent constituées de petites chambres à plaques parallèles et dont la technologie moderne pour perfuser le sang total dans des conditions mur de cisaillement contrôlées 5. Microscaling a augmenté de façon significative le débit dosage surtout parce que la configuration matérielle a simplifié et moins (sang) volume est nécessaire, ce qui rend l'expérience Versati plus accessible etle. Par exemple, le sang de petits animaux de laboratoire peut maintenant être utilisé sans qu'il soit nécessaire de sacrifier les animaux. Des échantillons de sang de souris génétiquement modifiées ont ainsi contribué à l'identification de molécules clés favorisant ou inhibant l' hémostase et de nouvelles idées de base 6.

Les laboratoires de recherche spécialisés souvent utilisent encore sur mesure chambres d'écoulement , par exemple de polydiméthylsiloxane (PDMS) 7 qui polymérise sur des moules lithographiées qui peuvent être blueprinted par le logiciel. La chambre résultant est peu coûteux, jetable et peut être facilement démonté pour analyse post-hoc. En outre, essentiellement toute la conception des navires, y compris les bifurcations ou des virages serrés peut être construit sur commande. Cet avantage est aussi son inconvénient puisque la normalisation était déjà le principal problème avec les expériences de la chambre d'écoulement et PDMS sur mesure chambres n'ont pas aidé cela. En plus de cette question particulière, le revêtement (conditions), des sondes fluorescentes, anticoagulant, templit- et le temps entre le prélèvement et l' analyse sont tous mal standardisés 8. La normalisation de ces variables est difficile, mais néanmoins nécessaire pour permettre la comparaison des résultats entre les laboratoires. Ce sujet est le principal objet de la Société internationale de thrombose et d' hémostase au sous-comité scientifique et de la normalisation sur Biorheology 9,10.

Les concentrés plaquettaires (PC) sont transfusées chez les patients souffrant de diverses maladies qui causent la thrombocytopénie et / ou des saignements. Mais les plaquettes dans le PC sont connus pour désensibiliser, en particulier en fonction du temps de stockage 11, un processus de dégradation liée au vieillissement et communément appelée lésion de stockage des plaquettes. On prétend parfois que ces plaquettes restaurer en circulation une fois transfusé 12, mais la preuve de ceci est rare. En outre, la fonctionnalité des plaquettes constituant un PC ne sont pas systématiquement testé car la relation entre ces essais etl' efficacité thérapeutique ou prophylactique ne sait pas 13. chambres d'écoulement microfluidiques offrent un moyen d'enquêter sur la fonction plaquettaire dans le PC pour optimiser la chaîne de manipulations entre la collecte et la délivrance. Il est un puissant outil de recherche pour (appariés) des comparaisons directes de PC comme nous l' avons déjà publiés 14,15 et est décrite ici.

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Protocole

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Ce protocole suit les lignes directrices éthiques institutionnelles pour la recherche sur des échantillons humains et le consentement éclairé a été obtenu à partir de tous les bailleurs de fonds impliqués. Approbation pour les expériences décrites ici a été obtenu à partir de la commission d'examen institutionnel de l'Hôpital universitaire d'Anvers.

Nota: Les indications de température sont toujours la température ambiante, sauf indication contraire.

Installation 1. Préparation Chambre de débit

  1. Lanes Préparation, tubages et Pins
    1. Vortexer la suspension de collagène vigoureusement et on dilue au 1/20 dans la solution de glucose isotonique fourni par le fournisseur à une concentration finale de 50 pg / ml.
      Note: Nous utilisons le collagène de tendon équin, principalement composé de type fibrilles I. Le type de collagène équin I est souvent désigné comme "Horm" collagène et est la norme d' or pour ce type de dosage 9 pour des raisons historiques, ainsi que biologiques. humain de type III, le collagène peut aussi être utilisé, mais the fibrilles manteau moins bien et la réponse plaquettaire est pas aussi forte. D' autres surfaces de revêtement peuvent également être utilisés, par exemple , facteur de von Willebrand (VWF), le fibrinogène, la fibronectine, la laminine, la vitronectine, la thrombospondine-1 , ou des combinaisons de ceux - ci 16.
    2. Prenez une nouvelle biopuce jetable du conteneur du fournisseur. Les dimensions des biopuces sont utilisées ici 0.4W x 0,1 H x 20L mm 3.
    3. Pipet 0,8 ul dans la voie (s) de la biopuce microfluidique sur une extrémité de la puce et marquer comme sortie. Assurez-vous que la voie est rempli 5/6 avec le collagène contenant une solution de revêtement préparée en 1.1.1. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air.
      Remarque: Les canaux sont partiellement recouverts pour éviter l'accumulation de fibres de collagène à l'entrée du canal (voir la discussion).
    4. Incuber à 4 ° C pendant 4 heures ou pendant une nuit dans un récipient fermé et humidifiée.
    5. Bloquer les canaux revêtus par pipetage du tampon de blocage (1,0% (p v) de sérum / albumine bovine à unej 0,1% (p / v) de glucose à 10 mM, 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), une solution saline tamponnée (HBS, 0,9% (p / v) de NaCl, pH 7,4) à l'autre extrémité et une marque comme entrée. Assurez-vous que la voie est complètement rempli avec le tampon de blocage évitant les bulles d'air.
    6. Couper un tube à longueur égale (12 cm). Utilisez un par voie et connecter chaque tube avec une épingle. Par exemple, une expérience comparant deux conditions, courir en double exemplaire, il faudra quatre tronçons de tubes et quatre broches à préparer.
    7. Rincer le tube avec de l'eau distillée en utilisant une seringue et une aiguille 26 G, ou les connecteurs annexés.
    8. Saturer le tube avec un tampon de blocage. Conserver dans un récipient fermé et humidifié pour un minimum de 1 heure.
  2. Préparation de la pompe et de collecteur
    1. Rincer la pompe et le collecteur avec de l'eau distillée, éliminer les bulles d'air.
    2. Aspirer le tampon de blocage de la voie (s) de biopuce en utilisant la pointe de 10 pi fixe à la sortie. Nettoyer la surface dela biopuce avec une poussière de précision sans essuyage et l'alcool dénaturé pour éliminer les empreintes et la poussière.
    3. Fixer la biopuce sur une platine de microscope automatisé. Si plus d'une voie est utilisée simultanément en une seule opération, connectez le à huit voies répartiteur collecteur à la sortie de biopuce.
      Note: Les huit voies collecteur répartiteur est un morceau de matériel (figure S1) relié à la pompe et la biopuce. Il permet le fonctionnement de tous les (huit) des voies disponibles sur une biopuce ou une combinaison de voies de circulation, qui peuvent être définis par l'opérateur dans le logiciel qui l'accompagne.
    4. Utilisez les broches dans le tube pour les fixer dans l'entrée de biopuce. Placer l'autre extrémité du tube (sans broche) dans un tube à essai conique de 1,5 ml rempli avec du HBS. Rincer tous les tuyaux et leurs voies connectés avec 1 ml HBS en utilisant la pompe, de façon à éliminer reste du tampon de blocage et mal adhérer collagène.

2. Préparation des échantillons de sang

  1. Collecte et séparation desensemble du sang frais à partir d' un volontaire sain. 17
    1. Recueillir les premiers millilitres de sang dans un tube sous vide contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) comme anticoagulant et utiliser exclusivement cet échantillon pour numération globulaire complète (CBC) avec un analyseur d'hématologie automatisé.
    2. Collecter un volume de sang dans un anticoagulant approprié en utilisant des tubes sous vide. Anticoagulants standard pour les expériences de la chambre d'écoulement sont l'héparine ou l'hirudine lorsque la fibrine formation ne fait pas partie du protocole d'étude et de citrate de sodium quand il est.
      Remarque: L'héparine a été utilisée comme anticoagulant pour toutes les expériences décrites dans les résultats.
      Note: La quantité de sang est fonction du nombre d'essais à effectuer. Environ 1 tube (7 ml) à 3 voies.
    3. Placer les tubes sur un rotateur en attendant la reconstitution du sang.
      Remarque: Le test doit être terminé à moins de 3 h de saignées.
    4. Centrifuger pendant 15 min à 250 g pour préparer plasma riche en plaquettes (PRP). Ne pas utiliser la pause de centrifugation pour éviter de perturber le culot légèrement tassées.
      1. Lorsque plus d'un tube a été recueilli, en commun le sang dans un seul tube de centrifugation conique.
        Remarque: La centrifugation peut être effectuée plus lentement ou moins long terme, en fonction du rendement du PRP et différentiel cellule "contamination" préférée.
    5. Retirer et jeter le PRP et le manteau buffy rendement des cellules de globules rouges avec quelques plaquettes.
      Remarque: Le nombre de plaquettes dans la fraction de globules rouges est de 13 ± 5 x 10 3 par pi (moyenne ± écart type, n = 12) en moyenne dans nos mains.
  2. Reconstitution du sang
    1. groupe sanguin AB Thaw (Rhésus D négatif) du plasma à 37 ° C pendant 5 min et 20 sec par 4 ml.
    2. Déterminer le taux d'hématocrite des globules rouges concentrés préparés 2.1.5 en utilisant un analyseur hématologique automatisé.
    3. Déterminer la concentration en plaquettes dans la banque de sang préparé concentré plaquettaire that sera utilisé pour reconstituer la fraction de globules rouges ci-dessus.
    4. Calculer le volume de globules rouges concentrés et un concentré de plaquettes qui produiront 40% d'hématocrite et 250 x 10 ^ plaquettes / ul dans un échantillon de 1 ml.
      Note: D'autres titres cibles des cellules peuvent être fixés de façon arbitraire, en fonction du protocole d'étude.
    5. Transfert concentré de globules rouges et le plasma dans un nouveau tube à l'aide d'une pointe de pipette écrêté et ajouter le concentré de plaquettes jusqu'à un volume de 1 ml d'échantillon est atteinte.
      Remarque: En fonction des variables étudiées, la fraction de plasma doit être égale dans tous les échantillons reconstitués, car le plasma a une influence significative sur le taux de formation de thrombus. Par exemple, répétée congélation-décongélation ou de plasma provenant de donneurs différents ou sur différents anticoagulants peuvent influencer le résultat.
    6. Mélanger le sang reconstitué doucement en inversant et effectuer une CBC.
    7. Préparer un "blanc" échantillon de contrôle dans lequel le volume de la fraction plaquettaire est remplacépar le même volume de 0,9% (m / v) de chlorure de sodium dans de l' eau pour déterminer la concentration de plaquettes endogènes ( à savoir les plaquettes sanguines non bancaires) dans le sang reconstitué à l' aide d' une SRC.
  3. étiquetage
    1. Pipeter 1 ml de sang reconstituées dans un tube à essai contenant 1 ul de 5 mM calcéine AM (5 uM de concentration finale).
      Note: D' autres colorants cellulaires peuvent être utilisés 14.
    2. Mélanger doucement en inversant.
    3. Incuber pendant 5 min à 37 ° C avant utilisation.

3. Perfusion Assay

  1. Concentrez l'objectif sur les fibres de collagène collées au fond des ruelles. Idéalement, utilisez contraste de phase ou de réglages contraste interférentiel différentiel (DIC) pour cette stratégie de focalisation. Sélectionnez 'Z Set actuel pour les régions de tuiles sélectionnées »dans le logiciel d'expérimentation pour résoudre numériquement les Z-positions sélectionnées.
  2. Sélectionner une région d'intérêt (ROI) dans la voie (xy) dans le logiciel d'expérimentation des microscope qui sera enregistrée au cours de l'expérience.
    Remarque: Le retour sur investissement peut être une zone de surface choisie arbitrairement dans une voie de perfusion. Il est conseillé de ne pas analyser la formation de thrombus à proximité de l'entrée et la sortie d'une voie afin d'éviter les effets secondaires du profil d'écoulement variable dans cette région, même si cela est relativement faible. La surface spécifique du ROI doit contenir un nombre de plaquettes ou de thrombus pour permettre le nivellement du signal. Dans ce protocole , le retour sur investissement est un agrégat numériquement cousu de trois images côte à côte de taille égale entraînant 0,62 mm 2 dans le milieu de la 2 cm de long couloir.
  3. Mélanger les échantillons doucement en inversant et positionner ceux-ci à côté de la biopuce sur la scène automatisée.
  4. Placer le tuyau qui est relié à l'entrée de la biopuce dans les tubes à essai contenant des échantillons de sang reconstituées.
  5. Lancez la pompe à 50 dyne / cm 2 (ou d' autres contraintes de cisaillement comme souhaité) pour les canaux liés tubes à essaicontenant les échantillons de sang reconstituées à l'aide du logiciel de la pompe.
    Remarque: Les autres contraintes de cisaillement peuvent être utilisés.
  6. Enregistrement des images toutes les 15 sec pendant 5 min en temps réel en utilisant le logiciel d'acquisition et de l'expérience du microscope.
    Remarque: D'autres séries de temps peut être utilisé en fonction de la configuration expérimentale.
    Note: Nous utilisons généralement un grossissement 100X (objectif 10X et 10X lentilles), mais supérieur (ou inférieur) grossissement peut facilement être utilisé comme une alternative.

4. Laver Out

  1. Laver tous les tubes fixé à la sortie et raccordée au collecteur à canaux multiples ou à la pompe à l'aide d'eau distillée, suivi d'hypochlorite de sodium (eau de Javel) 0,5% (v / v) et enfin 0,1 M de NaOH dans l'eau. Jeter le tube épinglé à l'entrée de la biopuce comme des déchets dangereux.

Analyse 5. Données

  1. Déterminer la cinétique de croissance du thrombus avec le logiciel d'analyse d'images. Les commandes suivantes sont spécifiques pour ZEN2012.
    1. Ouvrez l'analyse plugin image pour déterminer la couverture de surface des plaquettes.
    2. Régler le seuil de fluorescence dans l'onglet Analyser Interactive pour définir l'intensité de pixel qui est en corrélation avec un signal positif, à savoir une plaquette collée ou de plaquettes adhérentes.
    3. Utilisez Créer des tables pour générer automatiquement une feuille de calcul qui contiendra les zones de surface séparées (en pm 2) de ces "objets" contenant des pixels avec un signal entre les seuils sélectionnés. Cette opération est effectuée pour chaque point de temps.
      Remarque: Une fois les seuils de fluorescence ont été choisi, le logiciel d'analyse détecte automatiquement des «objets» dans le champ de vision qui remplissent les critères. Ces objets sont thrombus, les petits agrégats de plaquettes ou de plaquettes individuelles et couvrent un certain nombre de pixels. Chaque objet est répertorié dans la feuille de calcul séparément.
    4. Conservez ces feuilles de calcul au format XML et les ouvrir dans un programme de feuille de calculpour d'autres calculs.
    5. Nombre de zones de la surface des objets sélectionnés par sommation et diviser le résultat par la superficie totale du champ de mesure (pm 2). Cela donnera la couverture de surface relative (%). Faites-le pour chaque point de temps.
    6. Tracer ces couvertures de surface en fonction du temps de perfusion et de calculer la pente de la régression linéaire, ce qui donne la cinétique de cette condition particulière de croissance du thrombus.

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Résultats

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Pour démontrer la variation intra-essai, trois échantillons de sang identiques reconstitués entiers ont été perfusés simultanément sur ​​collagène surfaces revêtues (figure 1). Il en est résulté un coefficient de variation de 8,7%. Cette statistique suggère intra-dosage acceptable et variation intralaboratoire permettant la comparaison fiable entre les échantillons liés.

L'entrée de la chambre d'écoulement com...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microfluidiques expériences en chambre d'écoulement sont un excellent outil pour étudier la fonction plaquettaire dans le sang circulant et sont utilisés pour évaluer l' hémostase in vitro dans des contextes expérimentaux. Malgré une mauvaise standardisation interlaboratoires 9, nous démontrons que , dans notre laboratoire , la variation expérimentale est acceptable. Ceci permet de comparer de manière fiable des échantillons (appariés) dans une étude donnée. Ceci a été validé en utilisant le ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucune reconnaissance.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de vacutainer BD avec EDTA  ;Becton, Dickinson and Company368856
Tube de vacutainer BD avec héparineBecton, Dickinson and Company368480
Tube de vacutainer BD avec citrate de sodiumBecton, Dickinson and Company366575
Tube de sang HirudinRoche6675751 001
BD vacutainer EclipseBecton, Dickinson and Company368650Aiguille de prélèvement sanguin avec support préfixé
Pointes de pipette 100-1 000Greiner bio-one740290
Pointes de pipette 2-200Greiner bio-one739280
Pointes de pipette 1-10EppendorfA08928
Tube 5 mlSimport11691380
Tube conique 15 mlGreiner bio-one1888271
Tube conique 50 mlGreiner bio-one227261
10 ml SeringueBD309604
Lingettes de précisionKimtech5511
Vena8 Fluoro+ BiochipsCellix188V8CF-400-100-02P10Nommé dans Figure S1 A comme 'Biochip’Vena8
TubingCellixTUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100FNommé dans Figure S1 B comme 'Tube jetable
Aiguilles Vena8 CellixSS-P-B1IC-B1OC-PACK200Nommé dans Figure S1 B comme 'Pin’Connectors
pour câbles d’entrée unique de biopucesCellixCONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connectCellixMF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSISNommé dans Figure S1 B comme 'Tube réutilisable' et 'Splitter’Boîte
humidifiéeCellixHUMID-BOX
Pompe microfluidique logicielle CellixN/AVenaflux Assay
HormCollagen Takeda/Nycomed1130630Collagène tendineux équin natif (type I)
Solution de glucose isotonique pour diluer le collagène est complétée
Solution saline tamponnée HEPES (HBS)dans la maison préparationdans la maison Préparation maison10 mM 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine acide éthananesulfonique (HEPES) solution saline tamponnée (0,9 % (p/v) NaCl, pH 7,4)
Tampon bloquantdans la préparation maisonPréparation maison1,0 % (p/v) d’albumine sérique bovine et 0,1 % (p/v) de glucose dans HBS
Calcein AMSondes moléculairesC1430
Eau de Javel 10 %dans la maison préparationdans la maison préparation
0,1 M NaOHdans la maison préparationdans la maison
Alcool dénaturéFiersT0011.5
Mirus Evo NanopumpCellix188-MIRUS-PUMP-EVOavec Multiflow8. Nommé dans Figure S1 A comme 'Pompe' et 'Microscope collecteur'
ZeissAxio Observer Z1équipé d’une caméra à LED colibri et d’une caméra CCD haute résolution
Microscope logiciel  ;ZeissN/AZEN 2012
Analyseur d’hématologieSysmexN/A
Centrifugeuse de tableEppendorf521-0095
Incubateur de plaquettesHelmerPF-48i
Bain d’eau d’incubationGFL1013
Pipettede marqueA03429
Tube RollerRatekBTR5-12V
Dispositif d’amarrage stérileTerumo BCTTSCD
Scelleuse de tubesTerumo BCTAC-155
VortexVWR58816-121
'

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Microfluidic Flow ChambersPlatelet TransfusionHemostasis ModelingReconstituted BloodCollagen BindingThrombus Growth KineticsShear Rate AnalysisBlood Component PreparationPlatelet Concentrate QualityFlow Chamber Experiment

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