Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion In vitro

Résumé

La transfusion de plaquettes et l’hémostase ont été modélisées à l’aide de la reconstitution sanguine et des chambres de flux microfluidique pour étudier la fonction des plaquettes de banque de sang. Les données démontrent les conséquences de la lésion de stockage plaquettaire sur l’hémostase, in vitro.

Résumé

Les plaquettes sanguines préparées pour la transfusion perdent progressivement leur fonction hémostatique pendant le stockage. La fonction plaquettaire peut être étudiée à l’aide d’une variété d’expériences in vitro (indirectes), mais aucune d’entre elles n’est aussi complète que les chambres d’écoulement microfluidique. Dans ce protocole, la reconstitution de sang frais thrombocytopénique avec des plaquettes de banque de sang stockées est utilisée pour simuler une transfusion de plaquettes. Ensuite, l’échantillon reconstitué est perfusé dans des chambres d’écoulement microfluidique qui imitent l’hémostase sur les protéines de la matrice sous-endothéliale exposées. Les effets du don de sang, du transport, de la séparation des composants, du stockage et de l’inactivation des agents pathogènes peuvent être mesurés dans des plans expérimentaux appariés. Cela permet une comparaison fiable de l’impact de chaque manipulation dans la préparation des composants sanguins sur l’hémostase. Nos résultats démontrent l’impact du cycle de température, des taux de cisaillement, de la concentration plaquettaire et de la durée de stockage sur la fonction plaquettaire. En conclusion, ce protocole analyse la fonction des plaquettes de la banque de sang, ce qui permet d’optimiser la chaîne de traitement, y compris la phlébotomie, le transport, la préparation des composants, le stockage et la transfusion.

Introduction

Hémostase exige l'activité combinée et régulée des cellules, des protéines, des ions et des tissus dans un contexte spatiotemporel limité ^1. une activité non contrôlée peut conduire à une hémorragie ou d'une thrombose et de la morbidité ou de la mortalité dans un spectre de troubles liés à la coagulation du sang. Une expérience de la chambre d'écoulement microfluidique est une technique difficile qui imite l' hémostase in vitro. Cette approche permet d'étudier l'interaction complexe des processus qui prennent part à l'hémostase avec un rôle de premier plan pour les plaquettes sanguines.

Suit....

Protocole

Ce protocole suit les lignes directrices éthiques institutionnelles pour la recherche sur des échantillons humains et le consentement éclairé a été obtenu à partir de tous les bailleurs de fonds impliqués. Approbation pour les expériences décrites ici a été obtenu à partir de la commission d'examen institutionnel de l'Hôpital universitaire d'Anvers.

Nota: Les indications de température sont toujours la température ambiante, sauf indication contraire.

Installation 1. Préparation Chambre de débit

1. Lanes Préparation, tubages et Pins
   1. Vortexer la suspension de collagène vigoureusement....

Résultats

Pour démontrer la variation intra-essai, trois échantillons de sang identiques reconstitués entiers ont été perfusés simultanément sur ​​collagène surfaces revêtues (figure 1). Il en est résulté un coefficient de variation de 8,7%. Cette statistique suggère intra-dosage acceptable et variation intralaboratoire permettant la comparaison fiable entre les échantillons liés.

L'entrée de la chambre d'écoulement com.......

Discussion

Microfluidiques expériences en chambre d'écoulement sont un excellent outil pour étudier la fonction plaquettaire dans le sang circulant et sont utilisés pour évaluer l' hémostase in vitro dans des contextes expérimentaux. Malgré une mauvaise standardisation interlaboratoires ^9, nous démontrons que , dans notre laboratoire , la variation expérimentale est acceptable. Ceci permet de comparer de manière fiable des échantillons (appariés) dans une étude donnée. Ceci a été validé en utilisant le .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube de vacutainer BD avec EDTA  ;	Becton, Dickinson and Company	368856
Tube de vacutainer BD avec héparine	Becton, Dickinson and Company	368480
Tube de vacutainer BD avec citrate de sodium	Becton, Dickinson and Company	366575
Tube de sang Hirudin	Roche	6675751 001
BD vacutainer Eclipse	Becton, Dickinson and Company	368650	Aiguille de prélèvement sanguin avec support préfixé
Pointes de pipette 100-1 000	Greiner bio-one	740290
Pointes de pipette 2-200	Greiner bio-one	739280
Pointes de pipette 1-10	Eppendorf	A08928
Tube 5 ml	Simport	11691380
Tube conique 15 ml	Greiner bio-one	1888271
Tube conique 50 ml	Greiner bio-one	227261
10 ml Seringue	BD	309604
Lingettes de précision	Kimtech	5511
Vena8 Fluoro+ Biochips	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	Nommé dans Figure S1 A comme 'Biochip’Vena8
Tubing	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F	Nommé dans Figure S1 B comme 'Tube jetable
Aiguilles Vena8 Cellix		SS-P-B1IC-B1OC-PACK200	Nommé dans Figure S1 B comme 'Pin’Connectors
pour câbles d’entrée unique de biopuces	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect	Cellix	MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS	Nommé dans Figure S1 B comme 'Tube réutilisable' et 'Splitter’Boîte
humidifiée	Cellix	HUMID-BOX
Pompe microfluidique logicielle Cellix		N/A	Venaflux Assay
Horm	Collagen Takeda/Nycomed	1130630	Collagène tendineux équin natif (type I) Solution de glucose isotonique pour diluer le collagène est complétée
Solution saline tamponnée HEPES (HBS)	dans la maison préparation	dans la maison Préparation maison	10 mM 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine acide éthananesulfonique (HEPES) solution saline tamponnée (0,9 % (p/v) NaCl, pH 7,4)
Tampon bloquant	dans la préparation maison	Préparation maison	1,0 % (p/v) d’albumine sérique bovine et 0,1 % (p/v) de glucose dans HBS
Calcein AM	Sondes moléculaires	C1430
Eau de Javel 10 %	dans la maison préparation	dans la maison préparation
0,1 M NaOH	dans la maison préparation	dans la maison
Alcool dénaturé	Fiers	T0011.5
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	avec Multiflow8. Nommé dans Figure S1 A comme 'Pompe' et 'Microscope collecteur'
	Zeiss	Axio Observer Z1	équipé d’une caméra à LED colibri et d’une caméra CCD haute résolution
Microscope logiciel  ;	Zeiss	N/A	ZEN 2012
Analyseur d’hématologie	Sysmex	N/A
Centrifugeuse de table	Eppendorf	521-0095
Incubateur de plaquettes	Helmer	PF-48i
Bain d’eau d’incubation	GFL	1013
Pipette	de marque	A03429
Tube Roller	Ratek	BTR5-12V
Dispositif d’amarrage stérile	Terumo BCT	TSCD
Scelleuse de tubes	Terumo BCT	AC-155
Vortex	VWR	58816-121