Article de méthode

Détermination du photorécepteur cellulaire Sensibilité spectrale dans un modèle Insecte de In Vivo intracellulaires Recordings

DOI :

10.3791/53829

⸱

26 février 2016

 ,  , 
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine, 2School of Life Sciences, University of Sussex

Dans cet article

Résumé

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La technique électrophysiologique de l'enregistrement intracellulaire est démontrée et utilisée pour déterminer les sensibilités spectrales des cellules photoréceptrices unique dans l'œil composé d'un papillon.

Résumé

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l'enregistrement intracellulaire est une technique puissante utilisée pour déterminer comment une seule cellule peut répondre à un stimulus donné. Dans la recherche de la vision, l'enregistrement intracellulaire a été historiquement une technique couramment utilisée pour étudier la sensibilité des cellules photoréceptrices individuelles à différents stimuli de lumière qui est encore utilisé aujourd'hui. Cependant, il reste un manque de méthodologie détaillée dans la littérature pour les chercheurs qui souhaitent reproduire des expériences d'enregistrement intracellulaire dans les yeux. Nous présentons ici l'insecte comme un modèle pour l'examen de la physiologie de l'œil plus généralement. cellules photoréceptrices insectes sont situés près de la surface de l'œil et sont donc faciles à atteindre, et bon nombre des mécanismes impliqués dans la vision sont conservés à travers embranchements des animaux. Nous décrivons la procédure de base pour l' enregistrement in vivo intracellulaire de cellules photoréceptrices dans l'œil d'un papillon, avec le but de rendre cette technique plus accessible aux chercheurs ayant peu d' expérience dans l' electrophysiology. Nous introduisons l'équipement de base nécessaire, comment préparer un papillon vivant pour l'enregistrement, comment insérer une microélectrode de verre dans une seule cellule, et, enfin, la procédure d'enregistrement lui-même. Nous expliquons également l'analyse de base de données de réponse premières pour la détermination de la sensibilité spectrale de types de cellules individuelles. Bien que notre protocole met l' accent sur ​​la détermination de la sensibilité spectrale, d' autres stimuli (par exemple, la lumière polarisée) et les variations de la méthode sont applicables à cette configuration.

Introduction

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Les propriétés électriques des cellules telles que les neurones sont observées en mesurant le flux d'ions à travers les membranes cellulaires comme un changement de tension ou de courant. Une variété de techniques électrophysiologiques ont été développés pour mesurer des événements bioélectriques dans les cellules. Neurones trouvés dans les yeux des animaux sont accessibles et leurs circuits sont souvent moins complexes que dans le cerveau, ce qui rend ces cellules de bons candidats pour l'étude électrophysiologique. Les applications courantes de l' électrophysiologie dans l'œil comprennent électrorétinogramme (ERG) 1,2 et microélectrodes e....

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Protocole

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Tous les animaux ont été traités le plus humainement possible. Les insectes ont été expédiés sous forme de pupes du Costa Rica entomologique Supply, Costa Rica.

1. Heliconius pupes soins

  1. Suspendre tous les pupes espacées 2-3 cm de distance dans une chambre humidifiée en utilisant des broches d'insectes.
  2. Après l'éclosion, permettent des ailes à sécher puis garder les papillons vivants pendant au moins 1 jour dans une chambre humidifiée et se nourrissent d'une solution diluée de miel par jour avant l'enregistrement.
    1. Diluer le miel avec de l'eau à une solution de miel de 20% en volume, et verser dans une....

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Résultats

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Pour de nombreux éléments de la configuration de l' enregistrement, une description écrite ne fournit pas assez de détails. Figure 1 est un schéma des composants impliqués dans la configuration d'enregistrement complet. Dans la figure 2, les spectres sont tracés pour la lumière blanche et chaque filtre d'interférence pour donner une idée de la raison pour laquelle un facteur de correction est nécessaire et ce qui est nécessaire pour calculer cette correction. La figure .......

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Discussion

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l'enregistrement intracellulaire peut être une technique difficile à maîtriser en raison des nombreuses étapes techniques impliquées. Pour les expériences réussies de plusieurs points importants doivent être pris en considération. Tout d'abord, il est important d'avoir une table bien vibrationally isolé sur lequel l'expérience est réalisée. De nombreux chercheurs utilisent des tables d'air, qui séparent complètement le dessus de table de la base, ce qui donne l'isolation des vibrations de qualité.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

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Nous remercions la fin Rudy Limburg pour fabriquer le périmètre de bras articulés, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, et Raju Metherate pour nous prêter le matériel, et Almut Kelber et Kentaro Arikawa, pour l'encouragement. Ce travail a été soutenu par une Fondation (NSF) Graduate Research Fellowship National Science à KJM et subvention NSF IOS-1257627 à la BAD

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plusieursespèces locales disponibles, nécessitent des permis USDA pour l’expédition. Carolina Bio Supply propose plusieurs espèces d’insectes qui peuvent être commandées aux États-Unis sans avoir besoin de permis supplémentaires
Grand cylindreToute chambre qui reste humidifiée fonctionnera
Pinles à insectes, taille 2BioQuip1208B2
100 % Desert Mesquite Honey TraderJoe’sToute solution de miel ou de saccharose fonctionnera
Lampe à arc au xénonOriel Instruments66003Oriel fait désormais partie de Newport Corporation
Universal Power SupplyOrielInstruments 68805Oriel fait désormais partie de Newport Corporation
Optical TrackOrielInstruments 11190Oriel fait désormais partie de Newport Corporation
Rail Carrier, Large (2x)Oriel Instruments11641Oriel fait désormais partie de Newport Corporation
Transporteur ferroviaire, petit (4x)Oriel Instruments11647Oriel fait maintenant partie de Newport Corporation
Adaptateur de filetage, 8-32 mâle à 1/4-20 mâle, paquet de 10Newport CorporationTA-8Q20-10
Poteau de montage optique, 1,0 po, 0,5 po de diamètre inoxydable, 8-32 & 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
Support de poteau optique antidérapant, 2 po, 0,5 po. Diamètre des poteaux, 1/4-20 (5x)Newport CorporationVPH-2
Monture d’objectif fixe, 50,8 mmNewport CorporationLH-2
Monture d’objectif fixe, 25,4 mmNewport CorporationLH-1
Ensemble de lentille à condenseurNewport Corporation60006
Lentille convexe en silice, 50,8 mmNewport CorporationSPX055
Roue à filtres à six positions, x2Newport CorporationFW1X6
Moyeu à montage sur roue à filtresNewport CorporationFWM
Lentille concave en silice, 25,4 mmNewport CorporationSPC034
Support de collimateurNewport Corporation77612
Sonde à faisceau de collimationNewport Corporation77644
Convertisseur de virole, terminaison SMA à virole standard de 11 mmNewport Corporation77670Cet adaptateur permet à la fibre optique de s’insérer dans le support du collimateur.
600 &mu ; Câble obtique à fibre UV-vis de diamètrem Oriel Instruments78367Oriel fait désormais partie de Newport Corporation
Shutter avec unité d’entraînementUniblitz100-2B
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 ODNewportFRQ-ND01
Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 ODNewportFRQ-ND03
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 ODNewportFRQ-ND05
Filtre ND métallique en silice fondue UV, 1.0 ODNewportFRQ-ND10
2.0 ODNewportFRQ-ND30
Filtre ND métallique en silice fondue UV, 3.0 ODNewportFRQ-ND50
LS-1-Cal lampeOcean OpticsSpectromètre LS-1-Cal
OpticsUSB-2000
SpectraSuite SoftwareOcean Optics
300 nm  ;Edmund Optics67749
Filtre passe-bande d’interférence, 310 nm  ;Edmund Optics67752
Filtre passe-bande d’interférence, 320 nm  ;Edmund Optics67754
Filtre passe-bande d’interférence, 330 nm  ;Edmund Optics67756
Filtre passe-bande d’interférence, 340 nm  ;Edmund Optics65614
Filtre passe-bande d’interférence, 350 nm  ;Edmund Optics67757
Filtre passe-bande d’interférence, 360 nm  ;Edmund Optics67760
Filtre passe-bande d’interférence, 370 nm  ;Edmund Optics67761
Filtre passe-bande d’interférence, 380 nm  ;Edmund Optics67762
Filtre passe-bande d’interférence, 390 nm  ;Edmund Optics67763
Filtre passe-bande d’interférence, 400 nm  ;Edmund Optics65732
Filtre passe-bande d’interférence, 410 nm  ;Edmund Optics65619
Filtre passe-bande d’interférence, 420 nm  ;Edmund Optics65621
Filtre passe-bande d’interférence, 430 nm  ;Edmund Optics65622
Filtre passe-bande d’interférence, 440 nm  ;Edmund Optics67764
Filtre passe-bande d’interférence, 450 nm  ;Edmund Optics65625
Filtre passe-bande d’interférence, 460 nm  ;Edmund Optics67765
Filtre passe-bande d’interférence, 470 nm  ;Edmund Optics65629
Filtre passe-bande d’interférence, 480 nm  ;Edmund Optics65630
Filtre passe-bande d’interférence, 492 nm  ;Edmund Optics65633
Filtre passe-bande interférentiel, 500 nm  ;Edmund Optics65634
Filtre passe-bande d’interférence, 510 nm  ;Edmund Optics65637
Filtre passe-bande interférentiel, 520 nm  ;Edmund Optics65639
Filtre passe-bande d’interférence, 532 nm  ;Edmund Optics65640
Filtre passe-bande d’interférence, 540 nm  ;Edmund Optics65642
Filtre passe-bande interférent, 550 nm  ;Edmund Optics65644
Filtre passe-bande d’interférence, 560 nm  ;Edmund Optics67766
Filtre passe-bande d’interférence, 570 nm  ;Edmund Optics67767
Filtre passe-bande d’interférence, 580 nm  ;Edmund Optics65646
Filtre passe-bande d’interférence, 589 nm  ;Edmund Optics65647
Filtre passe-bande d’interférence, 600 nm  ;Edmund Optics65648
Filtre passe-bande d’interférence, 610 nm  ;Edmund Optics65649
Filtre passe-bande d’interférence, 620 nm  ;Edmund Optics65650
Filtre passe-bande d’interférence, 632 nm  ;Edmund Optics65651
Filtre passe-bande d’interférence, 640 nm  ;Edmund Optics65653
Filtre passe-bande d’interférence, 650 nm  ;Edmund Optics65655
Filtre passe-bande d’interférence, 660 nm  ;Edmund Optics67769
Filtre passe-bande d’interférence, 671 nm  ;Edmund Optics65657
Filtre passe-bande interférentiel, 680 nm  ;Edmund Optics67770
Filtre passe-bande d’interférence, 690 nm  ;Edmund Optics65659
Filtre passe-bande d’interférence, 700 nm  ;Edmund Optics67771
de FaradayToute structure métallique qui peut être mise à la terre et qui s’adapte à la configuration expérimentale fonctionnera.
Stéréomicroscope, grossissement 6X, 12X, 25X, 50XWild HeerbruggWild M5N’importe quel stéréomicroscope fera l’affaire
Support de microscope avec bras oscillant et base lourdeMcBain InstrumentsN’importe quelle base lourde avec bras
fera l’affaire BrasConstruit sur mesure, Voir Figure 4
Illuminateur haute intensité Fiber-liteDolan-JennerMI-150Pour l’échantillon d’éclairage
Guide de lumière à col de cygne Fiber-liteDolan-JennerEEG 2823N’importe quel guide de lumière à col de cygne fera l’affaire
Table en marbre
Table en boisUn trou doit être percé à travers cette table afin que le bac à sable puisse reposer sur la table en marbre en dessous
Boîte en bois remplie de sableconstruite sur mesure, n’importe quelle boîte avec du sable
ManipulateurCarl Zeiss - Iéna
Porte-électrode
Platine
Fils à pince crocodile pour la mise à la terre
Fil
Fil d’argent, 0,125 mm de diamètreWorld Precision InstrumentsAGW0510
câblesBNC
Préamplificateur avec têteDagan CorporationIX2-700
Humbug Réducteur de bruitQuest ScientificHumbug
Oscilloscope, 30 MHz, 2 canaux, Dual Trace, Alt-triggering, sans sondeEZ Digitalos-5030
BNC Adaptateur
Matériel Powerlab 2/20ADI instrumentsML820
Logiciel LabchartInstruments ADIChart 5
Générateur d’impulsions 10 MHzBK Precision4030
Extracteur de pipettes en verreSutter InstrumentsP-87
Capillaires en verre borosilliqué avec filamentWorld Precision Instruments1B120F-4
Chlorure de potassium, 3 M
en plastique fendu
Cire
de fusion Fer à souderWeller
Plate-forme avec base magnétique à rotulephoto et vidéo
tranchant en acier au carbone, lame de rasoir cassableMicroscopie électronique Sciences72004
Vaseline
Microsoft ExcelMicrosoft
en plastique UV Filtre ND métallique en silice fondue UV , Ocean Filtre passe-bande d’interférence, Cage à cardan surélevée d’échantillonde cuivre isoléen TTube à basse températureHama double

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
  2. Leboulle, G., et al.

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Mots-clés

Enregistrement intracellulairecellules photor ceptricesmicro lectrode de verrelampe au x nonr sistance de l lectrodestimulation lumineuseanalyse de la r ponseadaptation l obscurit

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