La technique électrophysiologique de l'enregistrement intracellulaire est démontrée et utilisée pour déterminer les sensibilités spectrales des cellules photoréceptrices unique dans l'œil composé d'un papillon.
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Article de méthode
Détermination du photorécepteur cellulaire Sensibilité spectrale dans un modèle Insecte de
Dans cet article
Résumé
Résumé
l'enregistrement intracellulaire est une technique puissante utilisée pour déterminer comment une seule cellule peut répondre à un stimulus donné. Dans la recherche de la vision, l'enregistrement intracellulaire a été historiquement une technique couramment utilisée pour étudier la sensibilité des cellules photoréceptrices individuelles à différents stimuli de lumière qui est encore utilisé aujourd'hui. Cependant, il reste un manque de méthodologie détaillée dans la littérature pour les chercheurs qui souhaitent reproduire des expériences d'enregistrement intracellulaire dans les yeux. Nous présentons ici l'insecte comme un modèle pour l'examen de la physiologie de l'œil plus généralement. cellules photoréceptrices insectes sont situés près de la surface de l'œil et sont donc faciles à atteindre, et bon nombre des mécanismes impliqués dans la vision sont conservés à travers embranchements des animaux. Nous décrivons la procédure de base pour l' enregistrement in vivo intracellulaire de cellules photoréceptrices dans l'œil d'un papillon, avec le but de rendre cette technique plus accessible aux chercheurs ayant peu d' expérience dans l' electrophysiology. Nous introduisons l'équipement de base nécessaire, comment préparer un papillon vivant pour l'enregistrement, comment insérer une microélectrode de verre dans une seule cellule, et, enfin, la procédure d'enregistrement lui-même. Nous expliquons également l'analyse de base de données de réponse premières pour la détermination de la sensibilité spectrale de types de cellules individuelles. Bien que notre protocole met l' accent sur la détermination de la sensibilité spectrale, d' autres stimuli (par exemple, la lumière polarisée) et les variations de la méthode sont applicables à cette configuration.
Introduction
Les propriétés électriques des cellules telles que les neurones sont observées en mesurant le flux d'ions à travers les membranes cellulaires comme un changement de tension ou de courant. Une variété de techniques électrophysiologiques ont été développés pour mesurer des événements bioélectriques dans les cellules. Neurones trouvés dans les yeux des animaux sont accessibles et leurs circuits sont souvent moins complexes que dans le cerveau, ce qui rend ces cellules de bons candidats pour l'étude électrophysiologique. Les applications courantes de l' électrophysiologie dans l'œil comprennent électrorétinogramme (ERG) 1,2 et microélectrodes e....
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Protocole
Tous les animaux ont été traités le plus humainement possible. Les insectes ont été expédiés sous forme de pupes du Costa Rica entomologique Supply, Costa Rica.
1. Heliconius pupes soins
- Suspendre tous les pupes espacées 2-3 cm de distance dans une chambre humidifiée en utilisant des broches d'insectes.
- Après l'éclosion, permettent des ailes à sécher puis garder les papillons vivants pendant au moins 1 jour dans une chambre humidifiée et se nourrissent d'une solution diluée de miel par jour avant l'enregistrement.
- Diluer le miel avec de l'eau à une solution de miel de 20% en volume, et verser dans une....
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Résultats
Pour de nombreux éléments de la configuration de l' enregistrement, une description écrite ne fournit pas assez de détails. Figure 1 est un schéma des composants impliqués dans la configuration d'enregistrement complet. Dans la figure 2, les spectres sont tracés pour la lumière blanche et chaque filtre d'interférence pour donner une idée de la raison pour laquelle un facteur de correction est nécessaire et ce qui est nécessaire pour calculer cette correction. La
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Discussion
l'enregistrement intracellulaire peut être une technique difficile à maîtriser en raison des nombreuses étapes techniques impliquées. Pour les expériences réussies de plusieurs points importants doivent être pris en considération. Tout d'abord, il est important d'avoir une table bien vibrationally isolé sur lequel l'expérience est réalisée. De nombreux chercheurs utilisent des tables d'air, qui séparent complètement le dessus de table de la base, ce qui donne l'isolation des vibrations de qualité.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Nous remercions la fin Rudy Limburg pour fabriquer le périmètre de bras articulés, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, et Raju Metherate pour nous prêter le matériel, et Almut Kelber et Kentaro Arikawa, pour l'encouragement. Ce travail a été soutenu par une Fondation (NSF) Graduate Research Fellowship National Science à KJM et subvention NSF IOS-1257627 à la BAD
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plusieurs | espèces locales disponibles, nécessitent des permis USDA pour l’expédition. Carolina Bio Supply propose plusieurs espèces d’insectes qui peuvent être commandées aux États-Unis sans avoir besoin de permis supplémentaires | ||
| Grand cylindre | Toute chambre qui reste humidifiée fonctionnera | ||
| Pinles à insectes, taille 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100 % Desert Mesquite Honey Trader | Joe’s | Toute solution de miel ou de saccharose fonctionnera | |
| Lampe à arc au xénon | Oriel Instruments | 66003 | Oriel fait désormais partie de Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel | Instruments 68805 | Oriel fait désormais partie de Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel | Instruments 11190 | Oriel fait désormais partie de Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel fait désormais partie de Newport Corporation |
| Transporteur ferroviaire, petit (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel fait maintenant partie de Newport Corporation |
| Adaptateur de filetage, 8-32 mâle à 1/4-20 mâle, paquet de 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Poteau de montage optique, 1,0 po, 0,5 po de diamètre inoxydable, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| Support de poteau optique antidérapant, 2 po, 0,5 po. Diamètre des poteaux, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Monture d’objectif fixe, 50,8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Monture d’objectif fixe, 25,4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Ensemble de lentille à condenseur | Newport Corporation | 60006 | |
| Lentille convexe en silice, 50,8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Roue à filtres à six positions, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Moyeu à montage sur roue à filtres | Newport Corporation | FWM | |
| Lentille concave en silice, 25,4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Support de collimateur | Newport Corporation | 77612 | |
| Sonde à faisceau de collimation | Newport Corporation | 77644 | |
| Convertisseur de virole, terminaison SMA à virole standard de 11 mm | Newport Corporation | 77670 | Cet adaptateur permet à la fibre optique de s’insérer dans le support du collimateur. |
| 600 &mu ; Câble obtique à fibre UV-vis de diamètre | m Oriel Instruments | 78367 | Oriel fait désormais partie de Newport Corporation |
| Shutter avec unité d’entraînement | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| Filtre ND métallique en silice fondue UV, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| Filtre ND métallique en silice fondue UV, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lampe | Ocean Optics | Spectromètre LS-1-Cal | |
| Optics | USB-2000 | ||
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| 300 nm ; | Edmund Optics | 67749 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 310 nm ; | Edmund Optics | 67752 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 320 nm ; | Edmund Optics | 67754 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 330 nm ; | Edmund Optics | 67756 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 340 nm ; | Edmund Optics | 65614 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 350 nm ; | Edmund Optics | 67757 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 360 nm ; | Edmund Optics | 67760 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 370 nm ; | Edmund Optics | 67761 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 380 nm ; | Edmund Optics | 67762 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 390 nm ; | Edmund Optics | 67763 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 400 nm ; | Edmund Optics | 65732 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 410 nm ; | Edmund Optics | 65619 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 420 nm ; | Edmund Optics | 65621 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 430 nm ; | Edmund Optics | 65622 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 440 nm ; | Edmund Optics | 67764 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 450 nm ; | Edmund Optics | 65625 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 460 nm ; | Edmund Optics | 67765 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 470 nm ; | Edmund Optics | 65629 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 480 nm ; | Edmund Optics | 65630 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 492 nm ; | Edmund Optics | 65633 | |
| Filtre passe-bande interférentiel, 500 nm ; | Edmund Optics | 65634 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 510 nm ; | Edmund Optics | 65637 | |
| Filtre passe-bande interférentiel, 520 nm ; | Edmund Optics | 65639 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 532 nm ; | Edmund Optics | 65640 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 540 nm ; | Edmund Optics | 65642 | |
| Filtre passe-bande interférent, 550 nm ; | Edmund Optics | 65644 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 560 nm ; | Edmund Optics | 67766 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 570 nm ; | Edmund Optics | 67767 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 580 nm ; | Edmund Optics | 65646 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 589 nm ; | Edmund Optics | 65647 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 600 nm ; | Edmund Optics | 65648 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 610 nm ; | Edmund Optics | 65649 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 620 nm ; | Edmund Optics | 65650 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 632 nm ; | Edmund Optics | 65651 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 640 nm ; | Edmund Optics | 65653 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 650 nm ; | Edmund Optics | 65655 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 660 nm ; | Edmund Optics | 67769 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 671 nm ; | Edmund Optics | 65657 | |
| Filtre passe-bande interférentiel, 680 nm ; | Edmund Optics | 67770 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 690 nm ; | Edmund Optics | 65659 | |
| Filtre passe-bande d’interférence, 700 nm ; | Edmund Optics | 67771 | |
| de Faraday | Toute structure métallique qui peut être mise à la terre et qui s’adapte à la configuration expérimentale fonctionnera. | ||
| Stéréomicroscope, grossissement 6X, 12X, 25X, 50X | Wild Heerbrugg | Wild M5 | N’importe quel stéréomicroscope fera l’affaire |
| Support de microscope avec bras oscillant et base lourde | McBain Instruments | N’importe quelle base lourde avec bras | |
| fera l’affaire Bras | Construit sur mesure, Voir Figure 4 | ||
| Illuminateur haute intensité Fiber-lite | Dolan-Jenner | MI-150 | Pour l’échantillon d’éclairage |
| Guide de lumière à col de cygne Fiber-lite | Dolan-Jenner | EEG 2823 | N’importe quel guide de lumière à col de cygne fera l’affaire |
| Table en marbre | |||
| Table en bois | Un trou doit être percé à travers cette table afin que le bac à sable puisse reposer sur la table en marbre en dessous | ||
| Boîte en bois remplie de sable | construite sur mesure, n’importe quelle boîte avec du sable | ||
| Manipulateur | Carl Zeiss - Iéna | ||
| Porte-électrode | |||
| Platine | |||
| Fils à pince crocodile pour la mise à la terre | |||
| Fil | |||
| Fil d’argent, 0,125 mm de diamètre | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| câbles | BNC | ||
| Préamplificateur avec tête | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Réducteur de bruit | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 canaux, Dual Trace, Alt-triggering, sans sonde | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC Adaptateur | |||
| Matériel Powerlab 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Logiciel Labchart | Instruments ADI | Chart 5 | |
| Générateur d’impulsions 10 MHz | BK Precision | 4030 | |
| Extracteur de pipettes en verre | Sutter Instruments | P-87 | |
| Capillaires en verre borosilliqué avec filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Chlorure de potassium, 3 M | |||
| en plastique fendu | |||
| Cire | |||
| de fusion Fer à souder | Weller | ||
| Plate-forme avec base magnétique à rotule | photo et vidéo | ||
| tranchant en acier au carbone, lame de rasoir cassable | Microscopie électronique Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
Références
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al.
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Réimpressions et autorisations
