Production de l&#39;homme Norovirus SAILLANTES Domaines dans<em&gt; E. coli</em&gt; Pour X-ray Crystallography

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode pour exprimer et purifier les norovirus de haute qualité en saillie (P) dans les domaines E. coli pour une utilisation dans les études de cristallographie aux rayons X. Cette méthode peut être appliquée à d' autres domaines calicivirus P, ainsi que des protéines non structurales, à savoir., Protéines du génome viral lié (VPg), la protéase et l' ARN polymérase dépendante de l' ARN (RdRp).

Résumé

La capside norovirus est constituée d'une seule protéine structurale majeure, appelée VP1. VP1 est subdivisé en une coque (S) et un domaine en saillie (P) domaine. Le domaine S forme un échafaudage contiguë autour de l'ARN viral, tandis que les formes P de domaine de pointes virales sur le domaine S et contient déterminants pour les interactions d'antigénicité et de la cellule hôte. Le domaine P se lie structures d' hydrates de carbone, ie., Les antigènes du groupe histo-sang, qui sont considérés comme importants pour les infections à norovirus. Dans ce protocole, nous décrivons un procédé de production norovirus P domaines de haute qualité avec des rendements élevés. Ces protéines peuvent alors être utilisées pour la cristallographie aux rayons X et ELISA afin d'étudier les interactions d'antigénicité et de la cellule hôte.

Le domaine P est d'abord clone dans un vecteur d'expression et exprimé dans des bactéries. La protéine est purifiée en utilisant trois étapes qui consistent à immobilisés Chromatographie d'affinité d'ions métalliques et une Chromatographie d'exclusion de taille. Dansprincipe, il est possible de cloner, exprimer, purifier et cristalliser les protéines en moins de quatre semaines, ce qui rend ce protocole, un système rapide pour analyser les nouvelles souches émergentes de norovirus.

Introduction

Les norovirus humains sont la principale cause de gastro - entérite aiguë dans le monde ^1. Ces virus appartiennent à la famille Caliciviridae, dont il existe au moins cinq genres, y compris les norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus et Nebovirus. En dépit de leur fort impact sur le système de santé et une large distribution, l'étude des norovirus humains est entravée par l'absence d'un système de culture cellulaire robuste. À ce jour, il n'y a pas de vaccins approuvés ou stratégies antivirales disponibles.

La protéine majeure de capside norovirus, appelé ....

Protocole

1. P Domain Cloning

1. Déterminer la région P domaine de codage par alignement de séquences des souches de norovirus (par exemple, la souche GII.10, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU) ^6. En outre, retirer la région flexible à l'extrémité C-terminale du domaine P (figure 2A). Optimiser les codons d' ADN pour E. expression coli et comprennent BamHI (N-terminal) et Notl (C-terminal) des sites de restriction afin de sous-clone le domaine P région codante dans le vecteur d'expression pMalc2x ^6,7.
   Remarque: La région P domaine de codage est optimisé et synthétisé par un service comme....

Résultats

Le schéma du protocole décrit est représenté sur la figure 1. Le protocole comprend 6 parties principales qui comprennent le clonage du gène cible, l' expression d' une purification en trois étapes, et la cristallisation. La figure 2 illustre la conception de la construction d'expression (CE) , et caractéristiques du vecteur d'expression pMalc2x. La séquence du site de clonage multiple (MCS) du vecteur pMalc2x montre restriction et la pro.......

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole pour l'expression et la purification de P domaines de norovirus en haute qualité et la quantité. Les norovirus sont pas bien étudiés et les données structurelles sont continuellement nécessaires. À notre connaissance, la production de domaine P en utilisant d' autres protocoles (par exemple, P domaines de la TPS-étiqueté) a été problématique, à ce jour, et les données structurelles suffisantes sur l' interaction norovirus-hôte ont été portées disparues. Avec la métho.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Domaine P DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
vecteur pMalc2x  ; Sur	demande
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep	Kit Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Colonne de chromatographie Econo-Column	Bio-Rad	7372512	2,5 x 10 cm, possibilité d’utiliser d’autres tailles
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	divers	coupure de 10 kDa, 30 kDa et 50 kDa utilisée
Sous-clonage Efficacité DH5&alpha ; Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chimiquement compétent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protéase	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	Colonne
SEC JCSG Core suites	Qiagen	divers	4 dépistages avec chacun 96 puits
Glucides	Dextra Laboratories, Royaume-Uni	divers	produits du groupe sanguin