Récolte sélective de Marginating-pulmonaires Leucocytes

Résumé

Les leucocytes marginaux-pulmonaires présentent des caractéristiques uniques et des fonctions immunologiques distinctes par rapport aux autres populations de leucocytes. Nous décrivons ici le prélèvement sélectif de cette sous-population de leucocytes pulmonaires, par perfusion forcée des poumons chez le rat et la souris. Les leucocytes pulmonaires marginaux semblent essentiels pour déterminer la susceptibilité aux maladies transmissibles par le sang et les maladies pulmonaires.

Résumé

Les leucocytes marginaux-pulmonaires (MP) sont des leucocytes qui adhèrent à l’endothélium interne des capillaires pulmonaires. Il a été démontré que les leucocytes MP présentent une composition et des caractéristiques uniques par rapport aux leucocytes d’autres compartiments immunitaires. Les preuves suggèrent une cytotoxicité plus élevée des cellules tueuses naturelles et un profil pro- et anti-inflammatoire distinct de la population de leucocytes MP par rapport aux immunocytes circulants ou spléniques. La méthode présentée ici permet la récolte sélective de MP-leucocytes par perfusion forcée des poumons chez la souris ou le rat. Contrairement à d’autres méthodes utilisées pour extraire les leucocytes pulmonaires, telles que le broyage des tissus et la dégradation biologique, cette méthode produit exclusivement des leucocytes à partir des capillaires pulmonaires, non contaminés par des cellules parenchymateuses, interstitielles et broncho-alvéolaires. De plus, la technique de perfusion préserve mieux l’intégrité et le milieu physiologique des MP-leucocytes, sans induire de réponses physiologiques dues au traitement tissulaire. Cette population unique de leucocytes MP est stratégiquement située pour identifier et réagir aux cellules circulantes anormales, car toutes les cellules malignes circulantes et les cellules infectées sont détenues lors de leur passage dans les capillaires pulmonaires, interagissant physiquement avec les cellules endothéliales et les leucocytes résidents. Ainsi, la récolte sélective de leucocytes MP et leur étude dans diverses conditions peuvent faire progresser notre compréhension de leur signification biologique et clinique, en particulier en ce qui concerne le contrôle des cellules aberrantes circulantes et des maladies pulmonaires.

Introduction

Leucocytes adhérant aux capillaires des poumons ( par exemple, marginating-pulmonaire (MP) leucocytes) ¹ ont été montrées pour présenter la composition leucocytaire distincte et une activité unique par rapport aux leucocytes d'autres compartiments immunitaires (par exemple, la circulation, de la rate, la moelle osseuse) ^{2- 4.} Par exemple, exposition MP-leucocytes plus tueuses naturelles (cellules NK) cytotoxicité contre les cellules tumorales différentes, par rapport à circulants et spléniques cellules NK, ainsi que l'ARN messager différencié (ARNm) niveaux et augmentation de la sécrétion de cytokines pro- et anti-inflammatoires. La composition des cellules est également différenciée des leucocytes circulants comme MP-leucocytes ont un rapport plus élevé de l'immunité innée / adaptative par rapport aux leucocytes circulants (50% contre 30%, respectivement). L'objectif de la méthode présentée ici est de permettre la récolte sélective de MP-leucocytes, afin d'étudier ce compartiment immunitaire important et unique (population cellulaire), et elucIDATE l'impact des diverses manipulations (par exemple, l' activation immunitaire) sur ces cellules spécifiques.

Pour comprendre l'importance de cette population unique, il est important de noter que le système immunitaire peut contrôler les cellules tumorales circulantes, des micrométastases et des maladies résiduelles par des fonctions in vivo de l' immunité à médiation cellulaire (CMI). Cette capacité est évidente malgré l'échec précédent du système immunitaire pour contrôler la tumeur primaire, et amplement étayée par des preuves in vivo chez des patients cancéreux et des modèles animaux ^5. Surtout, ces résultats sont souvent incompatibles avec in vitro et ex vivo études qui rapportent que la plupart des cellules tumorales autologues sont résistantes à la cytotoxicité par la circulation des leucocytes dans des échantillons de sang chez les humains et les animaux (mesuré par les essais de cytotoxicité) ^6,7. Cet écart peut être attribué à l'existence in vivo des populations leucocytaires distincts, tels que mentionnés ci lesusmentionné population leucocytaire MP, et plus particulièrement son sous - population de cellules NK activées ^3. En effet, les cellules tumorales syngéniques (de MADB106), qui se sont révélés être résistants à la circulation et les leucocytes spléniques, se sont révélés être lysées par les cellules NK-MP ^3,8. Ainsi, les cellules prétendument «NK» résistantes MADB106 qui produisent des métastases aux poumons de fischer344 (F344), les rats sont contrôlés par des cellules NK-MP, mais pas par circulation ou des cellules NK spléniques qui sont couramment étudiées compte tenu de leur facilité d'accès.

MP-leucocytes purifiés actifs et ne sont pas accessibles par les méthodes classiques de récolte de leucocytes dans les poumons, qui sont basés sur un broyage du tissu pulmonaire ou la dégradation biologique ^9. Notre approche présente deux avantages majeurs par rapport aux approches de traitement des tissus. Tout d'abord, la méthode de perfusion récolte sélective MP-leucocytes, en les séparant des autres cellules qui proviennent du parenchyme pulmonaire interstitielle et compar broncho-alvéolairetments. En second lieu, la meilleure technique de perfusion préserve l'intégrité et le milieu physiologique de la MP-leucocytes, à la différence du broyage et le traitement biologique des approches qui endommagent les cellules, modifier leur morphologie et induisent la production et la libération de divers facteurs qui modulent l'activité immunitaire et plus particulièrement répriment NK ¹⁰ cytotoxicité.

Les poumons sont un organe cible majeure pour les métastases du cancer et pour diverses maladies infectieuses. Toutes les cellules cancéreuses circulantes et des cellules infectées passent à travers les capillaires pulmonaires où ils ont besoin de se déformer et d'interagir avec des cellules endothéliales capillaires et les leucocytes résidents. Dans ces conditions, les cellules circulantes peuvent être facilement ciblés par MP-leucocytes résidents. Il semble donc intéressant de disposer biologiquement leucocytes activés dans ce compartiment immunitaire, et il est important d'étudier cette MP-population unique dans différents milieux biologiques, expérimentaux et cliniques. Il est digne de noter que syl' activation stemic immunitaire par divers-réponse modificateurs biologiques (par exemple l' acide polyinosinique-polycytidylique (poly I: C) ou de type C CpG ODN (CpG-C ODN)) ont été montrés pour activer MP-leucocytes plus de leucocytes circulants ^{3, 8,11.}

Protocole

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux (IACUC) à l'Université de Tel-Aviv.

1. Protocole Rat

1. Les préparatifs
   1. Disposer 2 papillon 21 G aiguilles. Eventuellement, préparer 2 contondants tranchant papillon 21 G aiguilles en déposant le tranchant de l'aiguille.
   2. Stériliser outils chirurgicaux: 2 paires de ciseaux, une pince émoussée tranchant, hémostatique, pinces à dents tissus stérilisés par autoclave à 121 ° C pendant au moins 30 minutes sur la gravité paramètre (sec).
   3. Préparer du PBS héparinisé (30 unités / ml) par addition de 30 unités d'héparine par ml de tampon phosphate salin (1 x PBS). Utilisez à la température ambiante. 35 ml est le volume minimal nécessaire par animal.
   4. PBS héparinisé flux dans les conduites de la pompe péristaltique et les aiguilles de papillon pour éviter les bulles d'air.
2. Perfusion des Poumons et Collection de MP-leucocytes
   1. Euthanasier l'animal par une surdose de 8% isoflurane. Confirmer l'euthanasie par la respiration de surveillance cessation.
   2. Lors de la cessation de la respiration, ouvrir immédiatement les cavités péritonéale et à la poitrine à l'aide des ciseaux stériles et des pinces à dents tissus. Effectuer une incision abdominale médiane le long de l'abdomen jusqu'à la pointe du sternum.
   3. Soulevez le sternum à l'aide de la pince, coupe prudemment la cage thoracique des deux côtés, sans perforer un organe interne ou les gros vaisseaux sanguins. Fixer un hémostatique sur le sternum, et rostrale fois la cage thoracique afin d'exposer le complexe cardiorespiratoire.
   4. Insérez une aiguille papillon dans le ventricule droit du cœur, et dans environ une minute recueillir le volume maximal de sang dans une seringue (~ 6 ml de 250 g animal).
   5. Fixer la veine cave avec un hémostatique pour éviter perfusion arrière du foie (voir Discussion).
   6. Tenez l'aiguille de papillon dans le ventricule droit en remplaçant la seringue contenant le sang avec le tuyau d'écoulement de la ppompe eristaltic.
   7. Insérer une deuxième aiguille papillon relié à une seringue de 5 ml de récolte dans le ventricule gauche, ce qui évite la pénétration du septum interventriculaire.
   8. Allumez la pompe péristaltique à une vitesse d'environ 5 ml / min et de recueillir doucement dans la seringue les premiers millilitres de perfusat qui sont contaminés par du sang. Continuez jusqu'à ce que la couleur perfusat vire du noir au rouge pâle. (Jeter la perfuste de sang contaminé).
   9. Sans arrêt de la pompe péristaltique, à remplacer rapidement la seringue de 5 ml de récolte avec une seringue 20 ml de récolte et de recueillir 20 ml de liquide de perfusion pulmonaire en utilisant une plus grande vitesse de perfusion (jusqu'à 7 ml / min). surveiller en continu le flux de perfusat dans la seringue de collecte, tout en évitant la formation de vide.
   10. Cesser l'écoulement de la pompe péristaltique.
3. leucocytes Extraction
   1. Centrifuger le liquide de perfusion pendant 10 minutes à 400 x g.
   2. Aspirer le liquide.
   3. Ajouter 10 ml de PBS ou moyen, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le liquide. Répéter deux fois cette étape. L'utilisation de PBS ou de milieu dépend de l'utilisation conséquente de l'échantillon.
   4. Ajouter 20 ml de PBS ou moyen, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le liquide.
   5. Reconstituer les cellules à la concentration voulue, en fonction de l'utilisation de l' échantillon ( par FACS, la PCR, etc.).

2. Protocole de souris

1. Les préparatifs
   1. Disposer 2 papillon 25 G aiguilles. Eventuellement, préparer 2 contondants tranchant papillon 25 G aiguilles en déposant le tranchant de l'aiguille.
   2. Stériliser outils chirurgicaux: 2 paires de ciseaux, une pince émoussée tranchant, hémostatique, pinces à dents tissus stérilisés par autoclave à 121 ° C pendant au moins 30 minutes sur la gravité paramètre (sec).
   3. Préparer du PBS héparinisé (30 unités / ml) par addition de 30 unités d'héparine par ml de solution PBS 1x. Utilisez à la température ambiante. 25 ml est le volume minimal nécessaire par animal.
   4. Stream PBS héparinisé dans les lignes de pompe péristaltique et les aiguilles de papillon pour éviter les bulles d'air.
2. Perfusion des Poumons et Collection de MP-leucocytes
   1. Euthanasier l'animal par une surdose de 8% isoflurane. Confirmer l'euthanasie par la respiration de surveillance cessation.
   2. Lors de la cessation de la respiration, ouvrir immédiatement les cavités péritonéale et à la poitrine à l'aide des ciseaux stériles et des pinces à dents tissus. Effectuer une incision abdominale médiane le long de l'abdomen jusqu'à la pointe du sternum.
   3. Soulevez le sternum à l'aide de la pince, coupe prudemment la cage thoracique des deux côtés, sans perforer un organe interne ou les gros vaisseaux sanguins. Fixer un hémostatique sur le sternum, et rostrale fois la cage thoracique afin d'exposer le complexe cardiorespiratoire.
   4. Fixer la veine cave avec un hémostatique pour éviter perfusion arrière du foie (voir Discussion).
   5. Insérez une aiguille papillon reliée à la conduite d'évacuation de la pompe péristaltique dans le droit êmetricle du coeur, et une deuxième aiguille papillon relié à une seringue de 2 ml de récolte dans le ventricule gauche du cœur, avoidingpenetration du septum interventriculaire.
   6. Mettez la pompe à une vitesse d'environ 2 ml / min et de recueillir les premiers millilitres de perfusat de sang contaminé dans la seringue de récolte jusqu'à ce que le perfusat vire du noir au rouge pâle (Jeter la perfuste de sang contaminé).
   7. Sans arrêt de la pompe péristaltique, à remplacer rapidement la seringue 2 ml de récolte avec une seringue 10 ml de récolte et de recueillir 10 ml de liquide de perfusion pulmonaire en utilisant une plus grande vitesse de perfusion (jusqu'à 4 ml / min). surveiller en continu le flux de perfusat dans la seringue de collecte, tout en évitant la formation de vide.
   8. Cesser l'écoulement de la pompe péristaltique.
3. leucocytes Extraction
   1. Centrifuger le liquide de perfusion pendant 10 minutes à 400 x g.
   2. Aspirer le liquide.
   3. Ajouter 10 ml de PBS ou moyen, centrifugeuse à 400g pendant 10 min, et aspirer le fluide. Répétez cette étape trois fois. L'utilisation de PBS ou de milieu dépend de l'utilisation conséquente de l'échantillon.
   4. Ajouter 10 ml de PBS ou moyen, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le liquide.
   5. Reconstituer les cellules à la concentration voulue, en fonction de l'utilisation de l' échantillon ( par FACS, la PCR, etc.).

Résultats

L'exposition MP-compartiment une composition leucocyte sous-ensemble différent par rapport aux leucocytes circulants. En utilisant une analyse de cytométrie en flux, les sous-populations leucocytaires ont été identifiés et quantifiés pour caractériser la composition à la fois en circulation et MP leucocytes. Les granulocytes et les lymphocytes ont été identifiés sur la base avant et latérales éparpillements. Dans les lymphocytes, NKRP-1 des cellules ^lumineuses ont été iden...

Discussion

La méthode présentée ici permet la récolte sélective et à l'étude de la population unique de MP-leucocytes. Par rapport à la circulation des leucocytes ou splénique, la population de MP se caractérise par une composition distincte de sous - populations leucocytaires, les niveaux plus élevés d'activation, la libération ultérieure de diverses cytokines et des niveaux plus élevés d' ARNm de cytokines pro- et anti-inflammatoires ^2,3. Plus précisément, nous avons montré que les cellules NK-MP sont plus...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Autoclud Pompe
Aiguille papillon	OMG		26G
Aiguille papillon	OMG		21G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Seringue	Pic solution		2,5 ml
Seringue	Pic solution		5 ml
Seringue	Solution Pic 10		ml
Seringue	Solution Pic		25 ml
Pince à bords arrondis Ciseaux
hémostatique
Pince à tissus Héparine
sodique muqueuse porcine (sans perservatifs)	Sigma Aldrich

péristaltique