Analyse fonctionnelle complémentation (FCA): Un exercice de laboratoire conçu et mis en complétant l'enseignement des voies biochimiques

Summary

La validation des activités enzymatiques impliquées dans les voies biochimiques peut être élucidée en utilisant une analyse de complémentation fonctionnelle (CAF). Décrite dans ce manuscrit est le dosage CAF démontrant l'activité enzymatique des enzymes impliquées dans le métabolisme des acides aminés, de réponse stringente bactérienne et la biosynthèse du peptidoglycane bactérien.

Abstract

Functional dosage de complémentation (FCA) est un test in vivo qui est largement utilisé pour élucider la fonction / rôle des gènes / enzymes. Cette technique est très courante dans la biochimie, de la génétique et de nombreuses autres disciplines. Une vue d'ensemble de la technique pour compléter l'enseignement des voies biochimiques relatives aux acides aminés, peptidoglycane et la réponse stricte bactérienne est signalée dans ce manuscrit. Deux ADNc de l'organisme modèle Arabidopsis thaliana plante qui sont impliqués dans le métabolisme de la lysine (L, L-diaminopimélate aminotransférase (DAPI) et de la tyrosine aminotransferase (tyrB) impliqués dans le métabolisme de la tyrosine et phénylalanine sont surlignés. En outre, le peptidoglycane bactérien voie anabolique est mis en évidence par l'analyse de la -acetylmuramoyl-l-alanyl-D-glutamate méso ligase -2,6-diaminopimélate (Mure) gène UDP- N à partir de la bactérie Verrucomicrobium spinosum impliqué dans la croix-linking de peptidoglycane. La réponse rigoureuse bactérienne est également signalé par l'analyse de l'rsh (POT h de omolog de ​​r ela / s) gène bifonctionnel responsable d'un phénotype hyper-muqueux dans la bactérie Novosphingobium sp. Quatre exemples de FCA sont présentés. La vidéo se concentrera sur trois d'entre eux, à savoir la lysine, le peptidoglycane et la réponse rigoureuse.

Introduction

complémentation fonctionnelle dans le contexte d'élucider la fonction (s) / rôle (s) d'un gène est défini comme la capacité d'un homologue particulier ou d'un gène orthologue pour restaurer un mutant particulier avec un phénotype observable à l'état sauvage lorsque l'homologue ou d'un gène orthologue est introduit en cis ou trans dans l'arrière - plan mutant. Cette technique a été largement utilisée pour isoler et identifier la fonction (s) / rôle (s) de nombreux gènes. Un exemple particulier est l'isolement et l' identification des orotidine-5-phosphate décarboxylase de Candida albicans en utilisant ....

Protocol

NOTE: Les auteurs sont prêts à fournir des souches bactériennes et les plasmides recombinants pour faciliter l'incorporation de l'analyse de complémentation fonctionnelle à des fins d'enseignement pour les personnes qui sont intéressées. Les plasmides qui ont été utilisés pour faciliter les expériences de complémentation fonctionnelle sont énumérées dans le tableau 1.

1. Construction de Plasmides pour la complémentation fonctionnelle

1. Clonage de diaminopimélate aminotransférase (DAPL) pour complémentation fonctionnelle.
   1. Amplifier le cadre de lecture ouvert DAPL (ORF) du V. spinosum ....

Results

Les souches bactériennes qui sont utilisés dans les différentes analyses de complémentation fonctionnelle sont énumérées dans le tableau 2.

Analyse fonctionnelle de complémentation: L, L-diaminopimélate aminotransférase (DAPL)

E. coli mutant double AOH1 (Δ :: dapD Kan2, dapE6) héberge une mutation dans le gène dapE et une .......

Discussion

Bon nombre des cours qui font partie intégrante de la biotechnologie et de curriculum bioscience moléculaire à l'Institut de technologie de Rochester ont une composante de laboratoire en plus de la partie de lecture du cours. Le programme d'études pour l'année scolaire 2014-2015 contient un total de 48 cours, dont 29 contiennent un composant de laboratoire qui représentent environ 60%. Un tel cours est Fondements de la biochimie et de pathologie des plantes (FPBP), une conférence / cours de laboratoire mixte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli mutants	Hudson/Savka lab ou CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
Electroporateur	Biorad-USA	1652100
Cuvettes d’électroporation	Biorad-USA	1652082
Incubateur à température contrôlée	Générique
Microcentrifugeuse	Générique
Luria Agar	Thermofisher Scientific	22700025
Luria Bouillon	Thermofisher Scientific	12795084
M9 Medium	Sigma-Aldrich	63011
Pomme de terre Dextrose Medium	Fisher Scientfic  ;	DF0013-15-8
Kanamycine	Sigma-Aldrich	K1377
Diaminopimélate	Sigma-Aldrich	92591
Thymine	Sigma-Aldrich	T0376
Chloramphénicol	Sigma-Aldrich	C0378
Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754
Phénlylalanine	Sigma-Aldrich	P2126
Aspartate	Sigma-Aldrich	A9256
Valine	Sigma-Aldrich	V0500
Leucine	Sigma-Aldrich	L8000
Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
Gylcerol	Sigma-Aldrich	G5516
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Tétracyline	Sigma-Aldrich	87128
Taq ADN polymérase	Thermofisher Scientific	10342-020
Platine pfx ADN polymérase	Thermofisher Scientific	11708-013
T4 DNA ligase	Thermofisher Scientific	15224-041
E. coli Dh5-alpha	Thermofisher Scientific	18258012
E. coli Top10	Thermofisher Scientific	C4040-03
pET100D/topo vector	Thermofisher Scientific	K100-01
pCR2.1 Vecteur	Thermofisher Scientific	K2030-01