Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d'embryons de poisson zèbre

14.6K vues

⸱

DOI :

10.3791/53877

⸱

12 mars 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules uniques à partir d’embryons de poisson-zèbre, enrichir pour des cellules d’intérêt, capturer des cellules de poisson-zèbre dans des systèmes de multiplexage de cellules uniques basés sur la microfluidique, et évaluer l’expression génique à partir de cellules uniques.

Résumé

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un organisme modèle puissant pour étudier le développement des vertébrés. Bien que de nombreux aspects du développement embryonnaire du poisson-zèbre aient été décrits au niveau morphologique, on sait peu de choses sur la base moléculaire des changements cellulaires qui se produisent au fur et à mesure que l’organisme se développe. Grâce aux progrès récents de la microfluidique et des technologies de multiplexage, il est maintenant possible de caractériser l’expression des gènes dans des cellules uniques. Cela permet d’étudier l’hétérogénéité entre les cellules individuelles de populations cellulaires spécifiques afin d’identifier et de classer les sous-types cellulaires, de caractériser les états intermédiaires qui se produisent lors de la différenciation cellulaire et d’explorer les réponses cellulaires différentielles aux stimuli. Cette étude décrit un protocole permettant d’isoler des cellules uniques viables à partir d’embryons de poisson-zèbre pour des tests de multiplexage à haut débit. Cette méthode peut être rapidement appliquée à tout type de cellule embryonnaire de poisson-zèbre avec des marqueurs fluorescents. Une extension de cette méthode peut également être utilisée en combinaison avec des technologies de séquençage à haut débit pour caractériser complètement le transcriptome de cellules uniques. Comme preuve de principe, l’abondance relative des marqueurs de différenciation cardiaque a été évaluée dans des cellules uniques isolées dérivées de progéniteurs cardiaques positifs nkx2.5. En évaluant l’expression génique au niveau de la cellule unique et à un seul point temporel, les données soutiennent un modèle dans lequel les progéniteurs cardiaques coexistent avec une descendance différenciante. La méthode et le flux de travail décrits ici sont largement applicables à la communauté de recherche sur le poisson-zèbre, ne nécessitant qu’une lignée de poisson transgénique étiquetée et un accès aux technologies de microfluidique.

Introduction

La plupart des études actuelles de biologie cellulaire et moléculaire sont basées sur des moyennes de la population. Cependant, les événements biologiques importants peuvent être masqués par ces analyses basées sur la population traditionnelle puisque les populations mineures peuvent jouer un rôle majeur dans les processus biologiques et les résultats de la maladie. Comprendre l' expression des gènes dans les populations hétérogènes au niveau de la cellule unique peut (et a) conduire à des idées biologiques et cliniques pertinentes 1,2. Une préoccupation pour les études de développement embryonnaire, dans une plus grande population de cellules, les cellules progénitrices sont souvent sous - représentées, ce qui rend difficile de détecter les changements subtils dans l' expression des gènes qui déclenchent finalement les décisions du destin cellulaire 3. De même, un seul type de cellule peuvent avoir des profils d'expression différents en réponse au microenvironnement 4. Par exemple, les cellules endothéliales résidentes dans le même organe ou dans différents organes (par exemple., De l' aorte ou des reins) présentent une hétérogénéité significative malgré le partage MORP communhological caractéristiques fonctionnelles et 5. En outre, les cellules cancéreuses qui peuplent la même tumeur peuvent également avoir des profils variés ou des mutations moléculaires au niveau cellulaire unique 6.

Dans des systèmes modèles, transcriptomique dans des cellules individuelles a réussi à identifier de nouvelles populations de cellules, caractérisé par des états intermédiaires qui se produisent au cours de la différenciation cellulaire, et ont révélé des réponses cellulaires à des stimuli différentielles 7,8,9. Ces idées auraient été masqués dans des études basées sur la population classiques. embryons de poisson zèbre sont une source extrêmement sous-utilisées de la tige, progéniteurs et la différenciation des cellules pour explorer des questions d'hétérogénéité cellulaire unique et la régulation moléculaire des identités cellulaires au cours du développement. Leur très stéréotypée, ex vivo le développement et la facilité de manipulation génétique font un excellent système modèle pour cette approche 10,11. Plus précisément, une limitation majeure à l'interprétation de la cellule unique genles données e d'expression est que l' identification fiable des nouveaux états de cellules intermédiaires au cours du développement exige une synchronisation très prudent de la collecte des tissus 9. Cela est nécessaire pour assurer que l'hétérogénéité entre les cellules capturées représente l'hétérogénéité au sein d'un tissu à un seul point du temps plutôt que de l'hétérogénéité dans l'expression des gènes présenté par la différenciation des cellules dépendant de l'âge. Par rapport à des souris, le développement de l' embryon de poisson zèbre peut être précisément synchronisée à travers un grand nombre d'embryons 12. En outre, avec les grandes tailles d'embrayage, les embryons de poisson zèbre peuvent être utilisés comme une source abondante de cellules souches et progénitrices.

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules à partir d'embryons de poisson zèbre et de capturer des cellules individuelles en utilisant un circuit de microfluidique intégré (IFC) puce et autoprep système disponible dans le commerce pour qRT-PCR analyse de l'expression génique. Ce protocole peut être rapidement cessible à tous les essais à haut débit de multiplexage, y compris touteséquençage du transcriptome qui permet une analyse plus complète de l' hétérogénéité cellulaire 13. Il offre également plusieurs avantages aux essais traditionnels d'expression génique. Le protocole d'isolement d'une cellule unique donne une viabilité élevée après FACS, ce qui diminue la proportion de cellules compromis qui sont inclus dans les applications en aval. En utilisant un CFI, les cellules capturées peuvent être directement observées pour évaluer les taux de capture et d'évaluer la santé des cellules morphologiquement. En outre, ce protocole est largement applicable à la communauté de recherche zebrafish, exigeant seulement une ligne de poissons transgéniques étiquetés et l'accès aux technologies de capture de cellules microfluidiques.

Comme preuve de principe, des cellules individuelles dérivées de progéniteurs cardiaques ont été isolés et capturés sur une puce IFC, puis l'abondance relative des marqueurs de différenciation cardiaque a été mesurée par qRT-PCR. l'analyse de l'expression génique au niveau de la cellule unique démontre que progéniteurs cardiaques coexistent avec leur différeprogéniture ntiating. L'idée tirée de profilage à cellule unique de progéniteurs cardiaques peut faire la lumière sur l'hétérogénéité des profils d'expression génique entre les cellules progénitrices cardiaques au cours du développement des vertébrés, qui peuvent avoir été masqués dans les analyses basées sur la population traditionnelle.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Ce protocole nécessite l'utilisation de direct, le poisson zèbre adulte pour produire des embryons. Les embryons sont récoltés pour la collecte des tissus. Il est essentiel d'obtenir l'approbation de l'éthique appropriées commissions d'examen pour mener cette expérience.

1. Obtenir Embryons étagées

  1. La veille de l'expérience, la préparation, le poisson zèbre adulte en bonne santé pour la reproduction. Placez un mâle et une femelle sur les côtés opposés d'un diviseur clair dans un réservoir d'élevage.
  2. Répétez 1.1 pour autant de réservoirs que nécessaire pour la production d'embryons suffisante pour l'application en aval de reproduction. Obtenir des embryons de deux poissons sauvages de type et les poissons transgéniques qui expriment des protéines fluorescentes dans le type cellulaire d'intérêt.
    NOTE: Le nombre d'embryons nécessaires pour les applications en aval dans les étapes 2-8 dépend de l'abondance relative des cellules d'intérêt au point d'intérêt de temps. Bien que cela puisse varier selon le type de cellules, 200 embryons produisent 2000-5000 cellules triées lorsque le caunes d'intérêt représentent <1,0% des cellules totales à 24 HPF (heures après la fécondation).
  3. Le lendemain matin, changer l'eau dans le réservoir de panure en transférant les poissons à un réservoir d'élevage frais et retirez le diviseur. Inclinez le réservoir à un angle afin d'encourager l'élevage.
  4. Recueillir des embryons mis en scène.
    1. Toutes les 15 min, recueillir des embryons en transférant les adultes à un réservoir d'élevage frais et en passant les œufs qui sont laissés à travers une passoire à thé.
      NOTE: embryons de poisson zèbre se développent de manière synchrone lorsqu'il est maintenu à des densités et des températures comparables.
    2. Rincer les oeufs avec des oeufs de l'eau (0,21 g / L instantanée des sels de l'océan dans 1 L d'eau distillée deux fois) et transfert à une boîte de Pétri. Transférer la boîte de Pétri à un incubateur humide à 28,5 ° C avec une circulation d'air.
  5. Deux heures après la dernière collecte, tri fécondé, les embryons multicellulaires en 10 cm des boîtes de Pétri et de réduire la densité à 50 embryons par boîte. Sélectionnez des embryons provenant d'une seule, 15fenêtre de temps min de la collecte pour l'application en aval. Incuber embryons à 28,5 ° C.
    NOTE: Par exemple, la collecte d'embryons à 8:30, 08h45, 09h00, 09h15, 09h30, 09h45, 10h00 et 10h15. La comparaison entre les points de temps, si le plus grand nombre d'embryons fécondés sont des embrayages collectées à 9:00, puis utilisez seulement ces embryons pour des applications en aval.

2. Set Up pour cellule unique Dissociation

  1. Environ 30 minutes avant le point d'intérêt (18 HPF) de temps supprimer les embryons de leur chorion manuellement à l'aide de pinces fines.
  2. Recueillir et étiqueter pour chaque condition qui suit: deux 2 ml microtubes, un 40 um crépine cellulaire, une boîte de 35 mm de culture cellulaire, et deux FACS tubes surmontés avec un tamis cellulaire de 35 pm.
  3. Refroidir les réactifs suivants sur la glace: Egg eau contenant 0,21 g / L sels de l'océan instantanée dans 1L d'eau distillée deux fois; De-yolking tampon contenant NaCl 55 mM , KCl 1,8, et 1,25 mM NaHCO 3; et le tampon FACS contenant de Leibovitz L-15 milieux additionnés de sérum bovin fœtal 5% inactivé à la chaleur.
  4. Apportez 1 ml par échantillon de Cell Dissociation Réactif 1 à RT. Thaw 1 ml de cellules Dissociation Réactif 2 par échantillon sur la glace. Porter à TA, immédiatement avant utilisation.

3. cellule unique Dissociation

  1. À l'aide d'une pipette en verre large de l'alésage, le transfert d'embryons 100-300 dans un tube de centrifugeuse de 2 ml de micro dans un volume minimum d'eau oeuf.
  2. Euthanasier embryons en remplaçant l'eau avec l'eau Oeuf 1 ml glacée et submergeant tube dans la glace pendant 20 min.
    ATTENTION! Il est essentiel d'obtenir l' approbation du comité de surveillance appropriée de protection des animaux pour cette méthode d'euthanasie (refroidissement sur ​​la glace suivie par la dissociation cellulaire comme l' euthanasie secondaire). l'euthanasie norme exige généralement que les embryons <3 jours après la fécondation sont blanchis après qu'ils sont refroidis, ce qui ne convient pas pour l'obtention de cellules viables.
  3. Laver les embryons deux fois avec 1 ml Egg eau glacée. Pour laver, utiliser une grande pipette en verre d'alésage pour enlever Egg eau et un P1000 pour ajouter Egg eau.
  4. Retirer le jaune en remplaçant l'eau de l'embryon avec 1 ml Deyolking Buffer et triturant 8-12 fois avec une pointe de P1000, ou jusqu'à ce que le jaune est dissous et que les corps des embryons sont visibles.
  5. Recueillir le tissu par centrifugation à 300 g pendant 1 min. Utiliser une pipette pour enlever délicatement le surnageant sans perturber le culot de tissu. Re-suspendre Egg Water 1.
  6. Répétez l'étape 3.5 pour un total de trois lavages, mais sur le lavage final, remettre en suspension dans 1 ml RT cellulaire Dissociation Réactif 1.
  7. Incuber dans la cellule de dissociation de réactif 1 pendant 10 min à température ambiante avec des tubes placés à l'horizontale. Chaque 2-3 min, triturer doucement avec une pipette P1000 pour empêcher l'agglutination.
    REMARQUE: Manipuler les échantillons doucement au cours des étapes de trituration. Parfois, une seule grande touffe formera dans le tube à partir d'un enchevêtrement de corps d'embryon. Cette volontédisperser la digestion supplémentaire assistée par trituration douce. NE PAS VORTEX.
  8. Recueillir le tissu par centrifugation à 300 g pendant 3 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de cellules Dissociation Réactif 2.
  9. Incuber pendant 5-15 min à température ambiante. Placer les tubes horizontalement. Chaque 2-3 min, triturer doucement pour empêcher l'agglutination. Toutes les 5 min, d'évaluer les progrès de la digestion.
    1. Pour évaluer les progrès de la digestion, diluer 2 ul surnageant dans 18 pi de tampon FACS et pipette comme une goutte sur une boîte de culture cellulaire.
    2. Placez une lamelle sur l'échantillon et observer sous un microscope de culture tissulaire à 10X et 20X grossissements.
      NOTE: La préparation doit apparaître comme un mélange de cellules individuelles, de petits groupes, de grandes grappes, et le corps de l'embryon essentiellement intacte occasionnelle.
    3. évaluer visuellement la proportion de la préparation qui est des cellules individuelles et de petits agrégats.
      REMARQUE: Over-digestion permettra de réduire la viabilité; sous-digestion va réduire le rendement de la cellule unique.
  10. Recueillir la préparation cellulaire par centrifugation à 300 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de tampon FACS froid.
  11. Humidifiez un tamis cellulaire de 40 pm avec FACS Buffer. Passer la suspension cellulaire à travers le tamis cellulaire de 40 pm sur une boîte de culture cellulaire de 35 mm. Laver le tamis cellulaire une fois avec 1 ml FACS tampon de tri.
  12. Transférer le flux continu dans un tube de microcentrifugeuse de 2 ml. Recueillir les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min et remettre en suspension dans 100 pi FACS Buffer.
  13. Comptez le rendement cellulaire en utilisant un hémocytomètre. Diluer les échantillons à 5x10 6 cellules par ml, ou la concentration optimale recommandée pour FACS la machine de choix. Facultatif: Lors du comptage rendement des cellules sur le hémocytomètre, les cellules mortes Counterstain avec du bleu trypan pour confirmer la viabilité de la préparation cellulaire avant tri FACS.
    NOTE: Les préparations sont trop diluées prendra quantité excessive de temps à trier. Les préparatifs qui sont trop concentrated ont tendance à agglomérer en multimères et sont suboptimale pour trier une population pure.
  14. Réserve 10-20% de chaque échantillon à utiliser comme témoins non colorées. Pour les échantillons restants, les cellules mortes de la tache en ajoutant un live fluorescent / morts (L / D) la discrimination colorant dans chaque échantillon. Ne pas laver.
    REMARQUE: Tout colorant fluorescent qui pénètre dans les cellules avec des membranes cellulaires compromises et les taches acides nucléiques peuvent être utilisés comme colorant L / D, à condition que les spectres de fluorescence est compatible avec la machine FACS de choix et d'étiquetage fluorophore cellules d'intérêt.
    1. Ne pas laver la préparation après l'ajout du colorant comme certaines cellules meurent en transit vers la purification FACS et devraient être exclues de la population triée.
  15. Humidifiez la crépine 35 um cellulaire plafonné FACS tube avec un tampon FACS de 20 pi. Ajouter les cellules à la crépine et de recueillir par gravité. Stocker sur la glace.

4. FACS Enrichissement

  1. Utilisez FACS pour enrichir unique, Des cellules vivantes exprimant le marqueur fluorescent.
    1. Définir une porte de distinguer les cellules des débris sur un nuage de points de diffusion vers l'avant (FSC-A) amplitude vs diffusion latérale amplitude (SSC-A), les deux avec mise à l'échelle linéaire.
      Attention! Cellules Zebrafish sont généralement plus petits que la souris ou des cellules humaines. Cela se traduit par une séparation de base plus faible entre les cellules et les débris.
    2. De la porte définie dans 4.1.1, définir une grille pour enrichir des cellules individuelles et d'exclure multimères l'aide d'un diagramme de dispersion de la hauteur avant de dispersion (FSC-H) et une faible hauteur de diffusion latérale (SSC-H), les deux avec mise à l'échelle linéaire.
      NOTE: Les cellules avec disproportionné FSC-H et une faible SSC-H sont multimères probables et sont exclus du tri.
    3. De l'ensemble de grille dans 4.1.2, en utilisant des commandes de couleur unique, définir une grille pour inclure uniquement les cellules vivantes en utilisant un diagramme de dispersion de FSA-A avec mise à l'échelle linéaire et l'amplitude du canal utilisé pour détecter L / D tache avec journal mise à l'échelle. Inclure les cellules L / D négatives.
    4. Dela porte définie dans 4.1.3, en utilisant les commandes de couleur unique, définir une grille pour inclure uniquement les cellules vivantes avec une fluorescence positive en utilisant un diagramme de dispersion de la FSA-A avec mise à l'échelle linéaire et l'amplitude du canal utilisé pour détecter le marqueur de cellule de la protéine fluorescente avec log échelle . Inclure des cellules positives.
    5. Définissez les contrôles de compensation, le cas échéant, pour tenir compte des interférences entre le L / tache D et le spectre de la protéine fluorescente.
  2. Ensemble logique de tri à des cellules qui entrent dans toutes les portes prévues à l'étape 4.1.
    1. En utilisant des cellules à double marquées, vérifier gating pour le tri cellulaire.
      NOTE: Les cellules de tri seront des cellules plutôt que des débris, des cellules individuelles plutôt que des multimères, L / cellules positives et négatives fluorescence D.
  3. Trier 2,000-4,000 cellules de la population d'intérêt dans 5 pi de tampon FACS à froid dans un tube à centrifuger sur la glace. Pour réduire au minimum le cisaillement et la tension sur les cellules pendant le tri, utiliser les pressions les plus bas possible pour la celluletrieur.
    NOTE: La gouttelette 5 pi de tampon FACS sert de coussin pour les cellules sortant de la machine FACS. La collecte 2,000-4,000 cellules directement dans le tampon FACS élimine la nécessité d'une centrifugation avant de charger sur les puces IFC. Cette stratégie est recommandée, car la centrifugation peut conduire à la formation de multimères si les cellules adhèrent les unes aux autres dans le culot.
  4. Évaluer l'analyse de la viabilité post-tri.
    1. Transfert 1 pl triées cellules à un tube FACS frais avec 100 pi FACS tampon et 1 tri: 1000 dilution de L / D tache. Passez les cellules à travers le trieur FACS avec la stratégie de déclenchement à l'étape 4.1. Utilisez la proportion de L / D négatif au positif pour estimer la viabilité des cellules triées.

5. Charger des cellules sur la microfluidique Chip

  1. L'utilisation d'un hémocytomètre, mesurer à la fois la concentration et la taille des cellules triées.
    1. Diluer les cellules triées à au moins 10 pi. Diluer une aliquote de 5 μ; L cellules avec 5 ul bleu trypan. Chargez sur hémocytomètre et appliquer la lamelle.
    2. Collecter des images lumineuses de toutes les cellules de terrain en 4 x 4 grilles de hémocytomètre. Compter le nombre de cellules vivantes et calculer vivantes cellules / ml. Les cellules vivantes ne prennent pas en bleu trypan.
      REMARQUE: Utiliser un logiciel d'analyse d'image standard pour mesurer le diamètre de toutes les cellules vivantes. Calculer la moyenne et l'écart-type de la taille de la cellule, puis sélectionnez une plaque d'IFC adapté à la gamme de taille de cellule d'intérêt. Si gamme de taille de la cellule chevauche une plaque IFC gamme de la taille des cellules, utiliser plusieurs plaques pour capturer la gamme complète des cellules d'intérêt.
  2. Les cellules de charge sur la plaque IFC selon les instructions du fabricant (voir Matériaux).
    1. Diluer cellules à 1x10 6 cellules / ml et effectuer l' optimisation de la flottabilité selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE: l'optimisation de la flottabilité assure que les cellules ne coulent au fond, ni flottent à la surface de l'wel de chargementl pour le chargement optimal sur puce IFC. Le rapport du tampon à des cellules peut varier selon le type de cellule, mais se situe typiquement 6: 4-7: 3 de cellules: tampon.
    2. Ajouter les cellules à apprêté-IFC plaque. Plaque de chargement dans fluidics machine compatible, et exécuter un script cellule de charge pour pousser les cellules à travers le circuit de microfluidique et en voies de capture.
  3. Confirmer que les cellules sont déposées dans des sites de capture sur plaque IFC.
    1. Retirer la plaque IFC de fluidics machine. Monter la plaque IFC sur un microscope équipé d'un adaptateur de plaque.
    2. Recueillir des instantanés de champ lumineux et la fluorescence pour chaque site de capture à un grossissement de 10X.
      REMARQUE: Les temps Brightfield de capture peuvent varier de 10-50 ms, en fonction de l'intensité de la lampe. fois la fluorescence de capture peuvent varier de 250-750 ms, en fonction de la luminosité fluorophore. Évitez surexposer cellules pour prévenir le photovieillissement.

6. Synthèse d'ADNc

  1. Effectuer la lyse des cellules in situ selon Iles instructions du FC fabricant de plaque.
    1. Ajouter des tampons de lyse aux puits sur la plaque IFC. Plaque de chargement sur fluidiques compatibles machine et script de lyse cellulaire d'exécution selon les instructions du fabricant.
  2. Effectuer la transcription inverse selon les instructions de l'IFC fabricant de plaque.
    1. Ajouter les réactifs de transcription inverse à la plaque IFC. Plaque de chargement sur fluidiques compatibles machine. Exécutez le script de transcription inverse. Exemples de conditions de cyclisme: 1 cycle à 25 ° C pendant 10 min, 1 cycle à 42 ° C pendant 1 heure, puis 1 cycle à 85 ° C pendant 5 min.
  3. Effectuer pré-amplification avec des sondes spécifiques du gène selon les instructions de l'IFC fabricant de plaque.
    NOTE: En raison de leur plus grande spécificité avec un nombre faible nombre de copies, utiliser des sondes fluorogènes marqués plutôt que des sondes optimisées pour une utilisation avec des colorants intercalants.
    1. amorces Piscine et diluer à la finale de 180 nM chacune. Ajouter amorces regroupées à la plaque IFC. plaque de charge sur FLUIDI compatibleMachine cs. script préamplification Exécuter.
  4. Effectuer le pré-amplification avec les conditions de cycle suivantes: 1 cycle à 95 ° C pendant 10 min, puis 18 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 15 secondes, puis recuit et extension à 60 ° C pendant 4 min. Magasin de pré-amplifié l'ADNc à 4 ° C jusqu'à la récolte. Récolte d'ADNc de la plaque microfluidique selon les instructions du fabricant et magasin à -20 ° C jusqu'à utilisation.

7. Sélectionnez l'ADNc à partir de cellules uniques pour cible unique qRT-PCR

  1. Diluer ADNc dans 25 ul de réactif de dilution selon les instructions du fabricant.
    NOTE: le rendement final approximatif est de 28 pi d'ADNc pré-amplifiée par cellule. Réserver une partie aliquote du diluant destiné à être utilisé en tant que témoin sans matrice dans la qRT-PCR.
    1. Se référant au champ lumineux et des images fluorescentes enregistrées à l'étape 5.3.2, marquer chaque site de capture. compter manuellement et enregistrer le nombre de cellules. Évaluer et enregistrer si chaque cellule est la grippeorescent.
      NOTE: Chaque site individuel peut contenir 0, 1, ou> 1 cellule, où> 1 cellule comprend des sites de capture qui contiennent des cellules multiples et / ou des débris non identifiables. Si les images sont de qualité suffisante, une valeur de pixel peut aussi être affectée à quantifier l'intensité du signal de fluorescence.
  2. Sélectionnez échantillons pour analyse qRT-PCR.
    1. Sélectionnez échantillons d'ADNc à partir de sites de capture identifiés à l'étape 7.2 qui contiennent exactement 1 cellule avec une fluorescence positive. Piscine 1 ul aliquotes de l'ADNc à partir de chaque échantillon.
      NOTE: Ceci est le "Pool" contrôle positif utilisé pour déterminer si les gènes d'intérêt sont exprimés dans l'une des cellules sélectionnées.
    2. Sélectionner un ADNc à partir d'au moins un site de capture qui contient exactement 0 cellules en tant que témoin négatif. Utilisez le diluant de l'étape 7.1.2 comme témoin sans matrice.
  3. Exécutez dosage qRT-PCR.
    1. Utilisez uniquement des sondes utilisées pour la pré-amplification à l'étape 6.4.1. Charger tous les échantillons en triplicate. Les conditions de cyclage pour une réaction de 10 pl sur une plaque à 384 puits: 1 cycle 50 ° C 2 min, 1 cycle de 95 ° C pendant 10 min, 40 cycles avec une dénaturation à 95 ° C 15 sec, puis recuit et extension à 60 ° C pendant 1 min.

Analyse 8. Données

  1. Validez produits qRT-PCR par électrophorèse sur gel standard. Confirmer produit est une bande unique à poids moléculaire attendu (varie pour chaque sonde).
    NOTE: Si une sonde produit de multiples bandes ou une seule bande à une taille inappropriée, alors la spécificité est discutable, ce qui exclut le gène de l'analyse.
  2. Examinez toutes les courbes d'amplification et compte pour d' éventuelles anomalies 14. Calculer la valeur CT moyenne pour chaque combinaison échantillon / gène 15.
    NOTE: Les valeurs de CT pour les contrôles positifs varient généralement de 10 à 30. valeurs CT pour les contrôles négatifs varient généralement de 35 à 40 (pas d'amplification). Valeurs CT 30-35 sont considérés comme très faible expressionet doivent être interprétées avec prudence 14.
  3. Rapport de données
    1. Si les échantillons tombent dans la CT = 10-30, les données peuvent également être signalés comme facteur de changement de l'abondance des transcrits par rapport à un échantillon témoin.
      REMARQUE: Plier le changement est égal à 2 ^ (- ΔΔCT) où ACt est relative à un gène de ménage en soustrayant la CT moyenne de l'échantillon à partir du gène de ménage et ΔΔCT est les différences de ACt entre l'échantillon et un contrôle positif 15.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Comme preuve de principe, l'expression des gènes a été évaluée pour explorer la dynamique de différenciation au cours du développement cardiaque. Chez le poisson zèbre, les progéniteurs cardiaques proviennent d'une population mésodermique de cellules qui migrent vers la plaque latérale mésoderme antérieure où ils fusionnent pour former le tube cardiaque linéaire. Avant la fusion, les progéniteurs cardiaques commencent à exprimer le Nkx2.5 facteur de transcription (NK2 ho...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Le procédé décrit ici utilise l'expression d'une protéine fluorescente sous le contrôle d'un promoteur spécifique de type cellulaire pour enrichir une population de cellules souches cardiaques à partir d'embryons de poisson zèbre pour une utilisation dans microfluidique système assisté de capture de cellule unique pour évaluer l'expression d'un sous-ensemble de gènes cardiaques en simple cellules. À condition que FACS excitation laser et d'émission de capacités sont compatibles avec le fluoro...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr C. Geoffrey Burns pour le stock de poissons. Les auteurs sont reconnaissants à l’UNC Flow Cytometry Core Facility, à l’UNC-CGIBD AAC pour les ressources qui ont permis ce projet, et à l’installation ZAC pour les soins aux animaux. L.S. est soutenu par la subvention NIH T32 HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. est soutenu par la bourse de recherche supérieure NSF NSF-DGE-1144081. Cette étude a été financée par la subvention P30DK034987 des NIH (à UNC Advanced Analytics Core), la subvention de développement scientifique 13SDG17060010 de l’American Heart Association et la subvention de New Scholar de la Fondation Ellison Medical AG-NS-1064-13 (au Dr Qian) et la subvention HL109079 R00 du NIH (au Dr Liu).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Supplies
Dumont #5 PinceFine Science Tools11254-20Pour l’ablation du chorion des embryons Tube de
microcentrifugation 2 mlGeneMateC-3261-1
Passoire à cellules de 40 umBiobasicSP104151
Boîte de culture de 35 mmFalcon351008
Tubes FACS surmontés d’une crépine de cellule de 35 umFalcon352235
P20 et pointesRainin17005091
protocole du fabricant de la puce IFCFluidigm100-6117Version 100-6117 E1 a été utilisé dans une expérience représentative
Verre pastuer à large alésage pippetteVWR14673-010Pour transfert d’embryons
Poisson zèbre sauvage adulteN/ANous avons utilisé la lignée AB
Poisson zèbre transgénique adulteN/ANous avons utilisé Tg(nkx2.5 :ZsYellow)
NameCompanyCatalog NumberComments
Réactifs pour la dissociation cellulaire
Double distilled waterN/A
Instant Ocean Sea SaltInstantSS15-10
NaClFisherScientificS271-3faire du stock dans l’eau et l’utiliser pour le tampon de déjoutage
KClSigma AldrichP5405faire du stock dans l’eau et l’utiliser pour le tampon de déjoutage
NaHCO3Sigma AldrichS6014faire stock dans l’eau et utiliser pour le tampon de déjoutage
Leibovitz’s L-15Gibco21083-027
FBSFisherScientific03-600-511Chaleur inactivée ; toute marque de FBS doit être fine
Réactif de dissociation cellulaire 1 -TrypLELife Technologies12605-010Conserver à température ambiante.
Réactif de dissociation cellulaire 2 - FACSmaxGenlantisT200100Stocker -20 ; décongeler sur de la glace ; amener à température ambiante avant utilisation
pronase (facultatif)SigmaP5147
L/D Dye - Sytox BlueLife TechnologiesS34857Toute coloration vivante/morte adaptée à la cytométrie en flux fonctionnera
Trypan BlueGibco15250-061
Name CompanyNuméro de catalogueComments
réactifs pour l’utilisation de plaques IFC et de sondes
Genesondes varieront selon l’expérience
TaqMan Probe gata4Life TechnologiesDr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5Life TechnologiesDr03074126_m1
TaqMan Probe myl7Life TechnologiesDr03105700_m1
TaqMan Probe vmhcLife TechnologiesDr03431136_m1
TaqMan Probe isl1Life TechnologiesDr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master MixLife Technologies4369016
Réactifs répertoriés dans le protocole
C1 Kit de réactifsFluidigm100-5319Réactifs pour le chargement de cellules sur une plaque IFC
Ambion Single Cell-to-CTTMLife Technologies4458237Réactifs pour les étapes de transcription inverse et de préamplification
Biologie moléculaire Qualité EauCorning46-000CM
C1 IFC pour PréAmpli (5-10 um)Fluidigm100-5757Plaque IFC pour petites cellules
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
>Equipment
C1 Machine AutoPrepFluidigm100-5477Pour l’utilisation d’un hémocytomètre sur plaque IFC
.Sigma AldrichZ359629Pour le comptage des cellules et l’évaluation
des cellules MicroscopePour le prélèvement d’embryons du chorion
MicroscopePour l’évaluation de la digestion de cellules uniques
MachinePour l’isolement des cellules d’intérêt
P1000 et pointes Rainin 17005089 Ocean spécifiques à qRT-PCR Les TaqMan Probe ef1a Life Technologies Dr03432748_m1 IFC du fabricant de la taille de dissection de culture tissulaire FACS

Références

  1. Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
  2. Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126(2014).
  3. Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
  4. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
  5. Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
  6. Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
  7. Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
  8. Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
  9. Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
  10. Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
  11. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
  12. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
  13. Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644(2014).
  14. McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
  15. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
  16. Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
  17. Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
  18. Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
  19. Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
  20. McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102(2008).
  21. Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
  22. Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
  23. de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
  24. Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
  25. Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
  26. Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Isolement de cellules uniquespuce microfluidiquetri par FACSdissociation cellulaireanalyse de l expression g niquemarqueurs fluorescentsexclusion au bleu trypancircuit fluidique int grqRT PCR
Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d'embryons de poisson zèbre
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.