Identification des conditions critiques pour Immunocoloration dans le puceron du pois embryons: L'augmentation de la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond

Résumé

Un protocole d’immunomarquage complet sur des embryons de pucerons est présenté, dans lequel les conditions critiques pour diminuer la coloration de fond et augmenter la perméabilité tissulaire sont abordées. Ces conditions sont spécifiquement développées pour la détection efficace de l’expression des protéines dans les tissus embryonnaires des pucerons.

Résumé

Le Acyrthosiphon pisum du puceron, avec un génome séquencé et la plasticité phénotypique abondante, est devenue un modèle émergent des études de génomique et de développement. Comme d'autres pucerons, A. Pisum propager rapidement par reproduction vivipare parthénogénétique, où les embryons se développent dans des chambres d'œufs dans une chaîne de montage dans le ovariole. Auparavant, nous avons établi une plate-forme robuste de l'ensemble de montage hybridation in situ permettant la détection de l'expression des ARNm dans les embryons de pucerons. Pour l'analyse de l'expression de la protéine, cependant, les protocoles établis pour immunocoloration les ovarioles de pucerons vivipares asexués n'a pas produit de résultats satisfaisants. Nous rapportons ici des conditions optimisées pour augmenter la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond, qui étaient tous deux des problèmes lors de l'application des approches établies. Optimisations incluent: (1) l'incubation de la protéinase K (1 pg / ml, 10 min), qui a été trouvé f essentielleou la pénétration d'anticorps dans les embryons à moyen et pucerons en fin de ligne; (2) le remplacement de sérum-albumine de sérum de chèvre / bovin normal avec un réactif de blocage fourni par un Digoxigénine (DIG) à base de jeu de tampons et (3) l'application de méthanol au lieu du peroxyde d'hydrogène (H _{2 O 2)} pour le blanchiment de peroxydase endogène; qui réduit de manière significative le bruit de fond dans les tissus de pucerons. Ces conditions critiques optimisés pour un marquage permettra une détection efficace des produits de gènes dans les embryons de A. Pisum et autres pucerons.

Introduction

Les pucerons sont des insectes hémiptères avec des petits (1-10 mm) corps mous. Ils se nourrissent de plantes en suçant la sève de phloème pièces buccales perçants. En outre, ils comptent sur ​​une bactérie endosymbiotique obligatoire, Buchnera aphidicola, pour synthétiser des acides aminés essentiels qui sont déficients dans le régime alimentaire de la sève du phloème. Les pucerons ont une histoire de vie complexe qui comprend la reproduction vivipare parthénogénétique au printemps et en photopériode longue journée d'été et la reproduction ovipare sexuelle déclenchée par une photopériode de jours courts pendant laquelle ils pondent un ....

Protocole

1. Culture de pucerons

NOTE:. La souche de laboratoire de l'parthénogénétique vivipare puceron du pois A pisum été initialement collectées dans le centre de Taiwan et a été élevé sur les plantes hôtes (le sativum jardin pois Pisum ou la fève Vicia faba) sous photopériode de jours longs pour plus de 300 générations (une génération: ~ 10 jours).

1. Germination des graines
   1. Faire tremper les graines de plantes hôtes dans l'eau du robinet pendant 3-5 jours à température ambiante. Remplir avec de l'eau fraîche une fois par jour.
      NOTE: Vous pouvez également mettre des graines de plantes....

Résultats

Dans cette étude, nous avons effectué tout le montage immunocoloration sur des embryons de pucerons du pois asexuées (figure 1A). Ces femelles produisent progéniture par parthénogenèse et vivipares. Ces embryons femelles se développent dans des chambres d'œufs des tubules ovariens (de ovarioles) (figure 1B et figure 2A). Avant la microscopie, les ovarioles disséqués sont les cibles de coloration; Toutefois, la séparation des chambres.......

Discussion

Nous avons identifié des conditions optimales critiques immunocoloration succès dans le puceron du pois A. Pisum, un organisme modèle émergent des études de génomique et de développement ^3,15. Des conditions optimisées pour augmenter la perméabilité du tissu et réduire la coloration de fond amélioré l'intensité et la spécificité des signaux. Ils diffèrent des protocoles standard pour immunocoloration dans d'autres modèles animaux dans les étapes de création de pores dans les membrane.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
30 % d’hydrogène perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	Pour le blanchiment de la peroxydase endogène des embryons.
4' 6-diamidino-2-phényl-indole dichlorhydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Pour le marquage de l’ADN double brin. TOXIQUE. Porter des gants, distribuer dans de petites aliquotes et feeze pour minimiser l’exposition
4D9 anticorps monoclonal de souris anti-engrêlée/invectivée Études	de développement banque d’hybridomes	AB_528224	Pour l’étiquetage des segments en développement de l’embryon.
Anticorps polyclonal de lapin ApVas1	Notre laboratoire	N/A	Pour le marquage de la protéine Vas1 spécifique de la lignée germinale du puceron dans les embryons. Cet anticorps a été fabriqué par notre laboratoire.
Austerlitz Épingles à insectes	ENTOMORAVIA	N/A	Pour séparer chaque chambre d’œuf d’un ovariole. Taille 000, ÉMAILLÉ NOIR.  ;
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps.
Appareil photo connecté au microscope composé	Canon	EOS 5D	Pour la photographie d’embryons de pucerons.
Plateau colorimétrique à 8 cellules	Kartell Labware	357	Pour développer le signal de coloration des embryons de pucerons. Diamètre 95 x 57 mm, profondeur de la cellule 2 mm.
Microscope composé avec optique DIC	Leica Microsystems	DMR	Pour la photographie d’embryons de pucerons montés sur les lames.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche 11585762001		Pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps. Nous avons dilué la solution de blocage 10x en 1x comme réactif de blocage.
Pince	Ideal-tek	N/A	Pour la dissection des ovaires des pucerons. Pièce du fabricant n° 5 : 5 SA.
Compte-gouttes en verre	N/A	N/A	Pour le transfert des ovaires des pucerons de la plaque à splot aux tubes. 150 mm de longueur totale et 5 3/4" de longueur de pointe.
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516	Pour l’élimination des embryons de pucerons et le montage.
Glycine	Bioshop	N/A	Pour bloquer l’activité enzymatique de la protéinase K (PK).
Chèvre anti-souris IgG conjuguée Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	Pour la détection de l’anticorps primaire de la souris.
Chèvre anti-lapin IgG conjuguée Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	Pour la détection de l’anticorps primaire du lapin.
Mélangeur Intelli	ELMI équipement de laboratoire	RM-2M	Pour améliorer la réaction globale des réactifs avec les ovaires.
Microscopie confocale à balayage laser	Leica Microsystems	SP5	Pour la photographie d’embryons de pucerons montés sur les lames avec étiquette florécente.
méthanol  ;	Burdick et Jackson	AH2304	Pour le blanchiment de la peroxydase endogène des embryons.
Lames de microscope	Thermo scientific	10143560	Pour le montage des embryons. Chants rectifiés SUPERFROST, env. 76 x 26 millimètres.
Microscope Lunettes de protection	Marienfeld	0101030	Pour le montage des embryons sur les lames. Taille 18 x 18 mm. Epaisseur n° 1 (0,13 à 0,16 mm)
Microscope Lunettes de protection	Marienfeld	0101050	Pour le montage des embryons sur les lames. Taille 22 x 22 mm. Epaisseur n° 1 (0,13 à 0,16 mm)
monoclonal anti-alphatubuline de souris (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	Pour le marquage de la distribution de l’alpha-tubuline des cellules.
Vernis à ongles	N/A	N/A	Pour sceller les lamelles sur les lames.
Sérum normal de chèvre (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	Pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps.
Paraformaldéhyde (PFA)	VWR	MK262159	Pour la fixation des ovaires des pucerons.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	Pour le marquage de la distribution de l’actine F sur les embryons.
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	N/A	N/A	Comme solution isotonique pour les ovaires de pucerons.
Compte-gouttes en plastique	N/A	N/A	Pour le transfert des ovaires des pucerons du tube au plateau cellulaire. Contenance 3 ml.
Protéinase K	Merck	124678	Pour créer des pores (poinçonnage) sur la membrane cellulaire et faciliter l’accès des anticorps.
Plaque spot en pyrex	N/A	N/A	Pour la dissection et les réactions de couleur des ovaires des pucerons sous microscopie. Chaque cavité d’un diamètre de 22 mm et  ; profondeur 7 mm.
SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzidine (DAB) comprimés  ;	Sigma-Aldrich	D4168	Pour le développement de signaux substrats. Aussi appelé ensemble de comprimés de substrat de peroxydase DAB.
Stéréomicroscope	Leica Microsystems	EZ4	Pour la dissection et l’observation des ovaires de pucerons.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	Pour créer des pores (poinçonnage) sur la membrane cellulaire.  ;
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Laboratoires vectoriels	PK-6101	Pour l’amélioration du signal. Y compris d’anticorps secondaires IgG anti-lapin de chèvre biotinylés, de réactifs A et B.
VECTASHIELD Support de montage	Laboratoires vectoriels	H1000	Pour l’élimination des embryons de pucerons et le montage.

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