Article de méthode

Un tissu combiné 3D Conçu

9.6K vues

⸱

DOI :

10.3791/53885

⸱

6 avril 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un modèle tridimensionnel (3D) de cancer du poumon basé sur un échafaudage biologique de collagène pour étudier la sensibilité aux thérapies ciblant le cancer du poumon à petites cellules (NSCLC). Nous démontrons différentes techniques de lecture pour déterminer l’indice de prolifération, l’apoptose et l’état de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Les données collectées sont intégrées dans un modèle in silico pour la prédiction de la sensibilité aux médicaments.

Résumé

Dans la présente étude, nous avons combiné un modèle de tumeur in vitro 3D poumon avec un modèle in silico pour optimiser les prévisions de la réponse aux médicaments basés sur un fond mutationnel spécifique. Le modèle est généré sur un échafaudage porcin décellularisé qui reproduit les caractéristiques spécifiques du tissu en ce qui concerne la composition de la matrice extracellulaire et de l'architecture comprenant la membrane basale. Nous avons standardisé un protocole qui permet la production d'un tissu tumoral artificiel dans les 14 jours, y compris trois jours de traitement médicamenteux. Notre article fournit plusieurs descriptions détaillées de 3D ​​en lecture sur les techniques de dépistage , comme la détermination de l'apoptose de la prolifération index Ki67 coloration à partir de surnageants par M30-ELISA et l' évaluation de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), qui sont des outils utiles pour évaluer l'efficacité des des composés thérapeutiques. Nous avons pu montrer par rapport à la culture 2D une réduction de la prolifération dans notre modèle de tumeur 3D qui est related à la situation clinique. En dépit de cette prolifération inférieure, le modèle prédit EGFR -targeted réactions aux médicaments correctement en fonction de l'état des biomarqueurs comme le montre la comparaison des lignées de cellules de carcinome du poumon HCC827 (EGFR -mutated, KRAS-type sauvage) et A549 (EGFR de type sauvage, KRAS - muté) traité avec le gefitinib inhibiteur de la tyrosine-kinase (TKI). Pour étudier la réponse aux médicaments de cellules tumorales plus avancées, nous avons provoqué EMT par un traitement à long terme avec le TGF-bêta-1 évaluée par vimentine / pan-cytokératine coloration par immunofluorescence. Un débit-bioréacteur a été utilisé pour ajuster la culture à des conditions physiologiques, ce qui a amélioré la production de tissus. De plus, nous montrons l'intégration des réponses aux médicaments lors du traitement par le géfitinib ou de TGF-bêta-1 de stimulation - l' apoptose, l' indice de prolifération et EMT - en un booléen dans le modèle in silico. En outre, nous expliquons comment les réactions médicamenteuses de cellules tumorales avec un fond mutationnel précis et le nombreerstrategies contre la résistance peut être prédite. Nous sommes convaincus que notre approche 3D dans vitro en particulier avec son expansion en silico fournit une valeur supplémentaire pour le dépistage des drogues préclinique dans des conditions plus réalistes que dans la culture cellulaire 2D.

Introduction

L'industrie pharmaceutique est confrontée à des taux d'attrition élevés allant jusqu'à 95% dans le domaine du traitement du cancer en phase clinique entraînant des coûts énormes 1-5. Une des raisons de ce manque réside dans le fait qu'à l'heure actuelle l'efficacité des nouveaux composés potentiels est évaluée dans des projections à grande échelle sur des cultures de cellules 2D de lignées cellulaires de cancer ou chez des modèles animaux. Les modèles animaux ont une plus grande complexité , mais il existe des différences cruciales entre les souris et les hommes 6,7. Dans la dernière décennie, des modèles de cancer 3D en utilisant des approches différentes ont été générées pour combler le fossé entre la culture 2D de lignées de cellules cancéreuses et un complexe dans 6,8,9 de la tumeur in vivo. L'impact de l' environnement 3D sur la différenciation cellulaire et sur ​​la signalisation a été démontré dans plusieurs études il y a des années (par exemple., Par Mina Bissell) 10,11. Aujourd'hui, de nombreux modèles de culture cellulaire 3D sont disponibles , telles que les cultures sphéroïdes, des hydrogels ou des puces microfluidiques 12-16. Même si thesmodèles e améliorent la complexité par rapport aux systèmes de culture 2D classiques, ils manquent la plupart du temps un microenvironnement de tissu qui est connu pour avoir des effets tumeur soutien et influe également sur l'efficacité des médicaments.

Pour résoudre ce problème, nous avons généré un modèle de tumeur 3D basé sur un échafaudage biologique appelé SISmuc (intestin grêle-muqueuse + muqueuse) qui est dérivé d'un jéjunum porcin décellularisé. De ce fait, l'architecture tissulaire et des composants importants de la MEC telles que les collagènes différentes, ainsi que la structure de la membrane basale sont conservées 17. Cette caractéristique unique est crucial pour la génération de modèle de tumeur de carcinome de l'épithélium qui se posent et constituent environ 80% des tumeurs solides. En outre, le taux de prolifération dans notre modèle de tumeur génie tissulaire est réduite par rapport aux taux artificiellement élevés obtenus dans la culture 2D. Comme la prolifération est un paramètre important dans l'évaluation de l'efficacité des médicaments, le dépistage des drogues est activé dans notre modèle plus procheconditions in vivo à des tumeurs 17.

Afin d'évaluer le potentiel de notre modèle pour prédire les biomarqueurs dépendant l' efficacité des médicaments correctement, nous les données ici présentes pour deux lignées différentes de cellules du cancer du poumon qui diffèrent par leur statut EGFR -biomarker. Ce statut mutationnel a commencé à déterminer systématiquement chez les patients atteints de CPNPC. Traitements ciblés avec ITK tels que l'EGFR -inhibitor gefitinib contre les tumeurs portant un activant l' EGFR mutation montrent des résultats supérieurs par rapport à ceux avec une chimiothérapie à base de platine 18-21.

Nous avons établi plusieurs techniques de lecture qui sont pertinents pour l'évaluation de l'efficacité du composé. En outre, après TGF-bêta-1 stimulation , nous sommes en mesure d'enquêter sur les actions de composés dans les cellules tumorales qui ont commencé le processus d'EMT, qui est considéré comme une étape importante dans la transformation maligne 22,23 et qui est relié à la drogue resistanCE 24.

Le modèle de tumeur 3D permettent le suivi des réponses spécifiques des cellules à des traitements ciblés, la chimiothérapie, ou des combinaisons de médicaments avec de bons contrastes. Pour améliorer et accélérer la drogue de dépistage et de rencontrer de la résistance, ceci est complété par une simulation de silico. Sur la base de quelques expériences, la réponse de la tumeur peut être prédit in silico quant à l'issue d'une gamme complète de médicaments et de leurs combinaisons.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. bidimensionnelle (2D) Culture Cellulaire

  1. obtenir commercialement lignée cellulaire tumorale HCC827 (DSMZ). Culture de la lignée cellulaire d'adénocarcinome du poumon HCC827 (EGFR muté, de type sauvage KRAS) dans RPMI-1640 complété avec 20% de FCS. Changer le milieu tous les 2 - 3 jours. Diviser les cellules deux fois par semaine. Les cellules sont utilisées jusqu'à ce passage 20 est atteint.
  2. obtenir commercialement tumeur lignée cellulaire A549 (DSMZ). Culture du carcinome du poumon lignée cellulaire A549 (EGFR de type sauvage, KRAS muté) dans RPMI-1640 complété avec 10% de FCS. Effectuer la culture comme indiqué ci-dessus. Les cellules sont utilisées jusqu'à ce passage 20 est atteint.
  3. Testez les cellules régulièrement (tous les 4 - 6 semaines) pour les contaminations telles que les contaminations de mycoplasmes.
  4. La mise en culture des cellules A549 ou HCC827 sur des lamelles en verre
    1. Placer 1 lamelle de verre stérile dans chaque puits d'une plaque de 24 puits en utilisant une pince à épiler.
    2. les cellules tumorales de semences 50000 des deux lignées cellulaires dans un volume de 500 ul dans les puits avecles lamelles de verre, respectivement.
    3. La culture des cellules jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 70% dans des conditions standard de culture (37 ° C; 5% CO 2). Pendant ce temps, aspirer l'ancien milieu à l'aide d'une pipette Pasteur et ajouter 500 pi de milieu frais tous les 2 - 3 jours de culture.

2. génération de systèmes de tumeur de test sur un collagène biologique Échafaudages

  1. Statique Conditions de culture
    1. Générer l'intestin grêle-muqueuse décellularisé + muqueuse (SISmuc) et le fixer entre deux anneaux métalliques, les couronnes dites cellules, comme décrit dans une publication précédente 25.
    2. 100 000 cellules de semence, soit HCC827 ou des cellules A549 dans un volume total de 500 pi sur le côté de l'ancienne lumière de l'intestin fixé dans les couronnes de cellules.
    3. Laisser les cellules tumorales à adhérer pendant 2 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Ajouter 1 ml de milieu intérieur de la couronne cellulaire et 1 ml à l'extérieur.
    4. Culture de la tumeurmodèle dans des conditions statiques à 37 ° C, 5% de CO 2 dans l'incubateur pendant 14 jours. Changer le milieu de culture tous les 2 - 3 jours. Par conséquent, aspirer le milieu à l'aide d'une pipette Pasteur et la pipette 1 ml RPMI frais avec la quantité appropriée de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) à l'intérieur de la couronne de cellules et 1,5 ml du même milieu extérieur.
  2. Dynamique Conditions de culture
    1. Mettre en place le système de test de la tumeur avec la matrice décellularisé à l'intérieur des couronnes de cellules et l'ensemencement des cellules comme décrit au paragraphe 2.1.1 à 2.1.3.
    2. La culture le modèle de tumeur dans des conditions statiques à 37 ° C, 5% de CO 2 dans l'incubateur pendant 3 jours.
    3. Assembler le bioréacteur autoclavé et insérez le SISmuc ensemencée tel que publié antérieurement 25.
    4. Pipette 45 ml RPMI avec la quantité appropriée de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) dans le flacon et connecter le dispositif d'échantillonnage sans aiguille au système de tuyau entre le bioréacteur et leflacon moyen.
    5. Placer le bioréacteur dans l'incubateur, le raccorder à la pompe et de la culture le modèle de tumeur pendant 14 jours supplémentaires avec un flux moyen constant (3 ml / min) à 37 ° C, 5% de CO 2.
    6. Changer le milieu de culture entière après 7 jours. Pour cela, déplacer le bioréacteur de l'incubateur sous une hotte à flux laminaire. Aspirer le milieu dans le flacon de support à l'aide d'une pipette Pasteur. Soulevez le bioréacteur tout en aspirant à se débarrasser du milieu dans le système de tuyauterie. Pipette 45 ml de milieu frais dans le ballon. Placez le bioréacteur de nouveau dans l'incubateur et le connecter à la pompe.

3. Le traitement du modèle de tumeur statique avec le géfitinib

  1. Culture du modèle de tumeur tel que décrit dans la section 2.1.
  2. Au jour 11 de la culture, de préparer RPMI / FCS avec 1 uM gefitinib (2,5 ml pour chaque couronne cellulaire). Aspirer l'ancien milieu des puits à l'aide d'une pipette Pasteur et ajouter 1 ml de prêt RPMI / FCS / gefitinib intérieur til couronne de cellules et 1,5 ml du même milieu extérieur.
    NOTE: La solution gefitinib stock décongelé peut être conservé à 4 ° C pendant une semaine.
  3. Changer le support au jour 13 comme décrit au paragraphe 3.2.

4. La stimulation du modèle de tumeur statique avec le TGF-bêta-1 pour l'induction EMT

  1. Culture du modèle de tumeur tel que décrit dans la section 2.1.
  2. Au jour 3 de la culture, la préparation RPMI / FCS avec 2 ng / ml de TGF-bêta-1 avec un véhicule (2,5 ml pour chaque couronne cellulaire). Aspirer le milieu ancien des puits en utilisant une pipette Pasteur et ajouter 1 ml de RPMI préparé / FCS / TGF-bêta 1 à l'intérieur de la couronne de cellules et 1,5 ml du même milieu extérieur. Changement de milieu additionné de TGF-bêta-1 toutes les 2 - 3 jours jusqu'au jour 14, comme décrit sous 4.2.

5. Lire-outs

  1. Prélèvement d' échantillons pour les mesures ELISA
    1. Prélever des échantillons à partir des surnageants de statique (section 2.1) et (section 2.2) culture dynamique au cours detraitement par gefitinib (section 3) aux jours 11-14 de la culture comme indiqué dans la figure 2. En outre, prélever un échantillon avant le traitement (T0).
    2. Dans des conditions de culture statique, prendre 100 ul d'échantillon de l'intérieur de la couronne de la cellule. Dans des conditions de culture dynamique, visser la seringue sur le dispositif d'échantillonnage et de prendre 1 ml de milieu sur le système de bioréacteur. Stocker tous les surnageants recueillis à -80 ° C jusqu'à ce que le test ELISA est effectuée.
  2. M30-ELISA pour la quantification Apoptose
    1. Afin de quantifier l'apoptose dans les surnageants effectuer le test de la mort des cellules selon les instructions du fabricant. Laisser tous les réactifs atteindre RT avant d'effectuer le test.
    2. Vortex tous les réactifs. Dissoudre le comprimé de lavage dans 500 d'eau désionisée fraîche. Diluer HRP Conjugué avec 9,2 ml de Conjugate Dilution Buffer et mélanger. Pipette 25 ul d'étalon ou d'échantillon par puits.
    3. Ajouter 75 ul de la HRP Conju diluéesolution de porte par puits. Couvrir la plaque et incuber sur un agitateur pendant 4 heures à température ambiante. Laver la plaque manuellement, 5 fois avec 250 pi de solution de lavage préparée.
    4. Ajouter 200 ul de 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) à chaque puits. Incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 20 min. Ajouter 50 ul de solution d'arrêt à chaque puits. Agiter la microplaque pendant 10 secondes et laisser la microplaque pendant 5 minutes avant de lire l'absorbance. Déterminer l'absorbance à 450 nm dans un lecteur de microplaques. Calculer la courbe standard et les concentrations dans les échantillons à l'aide d'un programme approprié pour le traitement des données de type ELISA, comme origine.
  3. Coloration de l' échantillon
    1. Fixation, Paraffin-enrobage et de la section Préparation du modèle 3D
      1. Fixer le SISmuc ensemencée en utilisant 2,5 ml de 4% paraformaldéhyde (PFA) par couronne cellulaire pendant 2 heures et l'intégrer dans la paraffine
      2. Préparer 3 um coupes de tissus pour la coloration telle que publiée précédemment25.
    2. Fixation des cellules cultivées en 2D conditions de culture
      1. Lorsque 70% de confluence est atteinte, laver les cellules cultivées sur des lamelles de verre en plaque de 24 puits une fois avec du PBS et les fixer avec 500 pi 4% PFA / puits pendant 10 min.
      2. Supprimer PFA et stocker les lamelles de verre dans les plaques à puits recouverte avec du PBS à 4 ° C jusqu'à ce que la coloration est effectuée.
    3. H & E Coloration
      1. Colorer les sections réhydratés avec hématoxyline / éosine comme une coloration aperçu selon les protocoles standards.
    4. Immunofluorescence du modèle 3D
      1. Pour immunofluorescence, effectuer une récupération d'antigène en plaçant les lames déparaffinées et réhydratées dans un cuiseur à vapeur avec un tampon citrate préchauffé (pH 6,0) pendant 20 min.
        NOTE: Voir le tableau de matériel et d'équipement de la préparation du tampon citrate.
      2. Transférer les lamesdans le tampon de lavage (tampon 0,5 M de PBS + 0,5% de Tween), des sections de cercle avec un stylo PAP pour minimiser le volume requis pour les solutions de coloration et de placer les lames dans une chambre d'humidité.
      3. Bloquer les coupes de tissu avec 5% de sérum de l'espèce hôte des anticorps secondaires utilisés dans le paragraphe 5.3.4.6 pendant 20 min à température ambiante.
      4. Retirer le sérum de blocage en tapotant doucement les lames dans un mouchoir en papier et appliquer l'anticorps primaire aux sections encerclées dans une dilution selon les instructions du fabricant (de lapin anti Ki67 1: 100, lapin anti vimentine 1: 100, souris anti pan-cytokératine 1 : 100). Incuber O / N à 4 ° C. Pour double coloration, des anticorps primaires de différentes espèces hôtes doivent être utilisés.
      5. Laver soigneusement hors anticorps non lié avec le tampon de lavage trois fois pendant 5 min.
      6. Pour la détection des liaisons antigène-anticorps spécifiques, appliquer des anticorps secondaires dans la dilution 1: 400 pour les sections et incuber à température ambiante pendant 1 h.
      7. Laver unbolide anticorps avec un tampon de lavage à trois reprises pendant 5 min.
      8. Monter les lames avec un milieu aqueux contenant DAPI à noyaux et laisser contre-colorer les O sec / N.
    5. Immunofluorescence des cellules cultivées en 2D
      1. Retirer du PBS et couvrir les têtes de série des lamelles de verre avec 0,2% de Triton-X100 dans du PBS pendant 5 min pour perméabilisation. Laver les lamelles de verre avec un tampon de lavage (tampon 0,5 M PBS + 0,5% de Tween) pendant 5 min.
      2. Effectuer les étapes 5.3.4.3 à 5.3.4.7. Exécuter toutes les étapes du bien-plaque sur une plate-forme à bascule et éliminer les réactifs en inversant la plaque.
      3. Pour le montage, repérer une goutte de milieu aqueux contenant DAPI à noyaux sur une contre-colorer lame de verre revêtue et transférer la lamelle à elle avec les cellules face au milieu de montage en utilisant une pince. Laissez sécher avant l'imagerie.
  4. Détermination de l' indice de prolifération
    1. Effectuer immunofluorescencecoloration contre Ki67 conformément à l'article 5.3.4. ou 5,3 5.
    2. Prendre des images fluorescentes des sections de tissus ou de cellules cultivées en 2D avec un microscope inversé. Utilisez des filtres différents pour prendre des images de colorations DAPI et de colorations Ki67. Pour la quantification, utiliser 10 images de sections 3D ou 5 images de 2D cultures (grossissement 20X) de chaque état des parties ne se chevauchent pas de l'échantillon.
    3. Déterminer le nombre de noyaux et le nombre de noyaux positifs pour Ki67 en 2D
      1. Comptez Ki67 noyaux positifs manuellement à l' aide du compteur de cellules de plugin du logiciel Fidji 26. Par conséquent, ouvrez l'image et cliquez sur "Plugins" → "Analyser" → "Cell Counter". Appuyez sur "Initialiser" et sélectionnez un type de compteur. Cliquez sur chaque noyau positif Ki67. Le nombre de clics est affiché à côté du type de compteur sélectionné.
      2. Pour le comptage automatique des cellules du nombre total de noyaux créer une macro en utilisant Fidji 27,28. Adjust la macro pour chaque ligne de coloration et de la cellule. Après, voir un exemple comment créer une macro.
        1. Lancer enregistreur de macros. Ouvrez un DAPI-image et de le convertir au format 8 bits en cliquant sur "Image" → "Type" → "8 bits". Cliquez sur "Améliorer le contraste", set 'saturé' «1» et «normaliser».
        2. Set "masque flou" pour affiner l'image. Utilisez un «rayon» de «1» et un «masque» de «0,60». Cliquez sur "seuil d'auto", choisir la méthode "RenyiEntropy" avec des «objets blancs sur fond noir» pour binariser l'image.
        3. Cliquez sur "Plugins" → "BioVoxxel" → "traits irréguliers du bassin versant» avec un rayon d'érosion de "5" pour séparer les cellules. Cliquez sur "Analyser" → "Analyser particules" et définir la «taille» à «0,02-Infinity".
          REMARQUE: Le nombre de particules / cellules estindiqué dans le tableau sommaire en compte.
        4. Cliquez sur "Créer" pour enregistrer macro pour l'analyse d'images supplémentaires.
    4. Déterminer le nombre de noyaux et le nombre de noyaux positifs pour Ki67 en 3D manuellement comme décrit au paragraphe 5.4.3.1.
    5. Calculer l'indice de prolifération moyenne (PI) selon la formule suivante:
      figure-protocol-1
      n = nombre d'images (3D: 10, 2D: 5)

6. In Silico Tumor Modèle Génération et simulation de la thérapie EGFR Anti- dans les cellules HCC827

  1. Generation Network en utilisant un logiciel d' analyse de réseau
    1. Utilisez différentes bases de données connues pour générer le réseau de la tumeur sur la base des importants expérimentaux paramètres de lecture et de l'arrière-plan mutationnelle de la lignée cellulaire de HCC827.
    2. Ouvrir le logiciel d'analyse de réseau 21 pour visualiser leréseau.
      1. Cliquez sur "Fichier" → "Nouveau" type → 'modèles' JoVE_tumor → cliquez sur "OK" pour générer un nouveau réseau. Cliquez sur "Square Gros plan Nord" → "OK" pour visualiser le récepteur dans une double membrane. Cliquez sur "Protein générique" pour visualiser les nœuds (= protéines) que des rectangles → type 'EGFR' → cliquez sur "OK"; répéter cette opération pour chaque nœud du réseau.
      2. Etiqueter les noeuds du réseau: clic droit → "Changer la couleur & Shape ..." → sélectionner pour les noeuds EGFR et (EGF-EGFR) code couleur "255,0,0" (couleur rouge); pour les noeuds c-MET et (c-MET) code couleur "0,255,0" (couleur verte); pour gefitinib code couleur "255,255,0" (couleur jaune); pour PI3K-Inh code couleur "204204204" (couleur gris clair); pour MEK-Inh code couleur "102102102" (couleur gris foncé); pour tous les autres nœuds du code de sélection de couleur réseau4; 255,255,255 "(couleur blanche).
      3. Cliquez sur "Phénotype" pour visualiser les paramètres de lecture comme hexagones → type 'prolifération' → cliquez sur "OK" → clic droit → → code couleur sélectionnez "255204204" (couleur saumon) "... Changer la couleur & Shape"; répéter cette opération pour le paramètre apoptose → sélectionnez la couleur code "255,51,204" (couleur violet).
      4. Visualisez Edges (= interactions): Cliquez sur "Transition Etat" pour les activations (flèches), cliquez sur "Inhibition" pour inhibitions (flèches émoussées); répéter cette opération pour chaque interaction dans le réseau.
    3. Cliquez sur "Fichier" → "Enregistrer sous ..." → type 'JoVE_tumor models.xml' → cliquez sur "Enregistrer" pour enregistrer le réseau de signalisation généré comme .xml le format.
  2. In Silico Simulation utilisant SQUAD
    NOTE: SQUAD représente ee la topologie du réseau en tant que système discret logique booléenne (AND, OR, NOT) et effectue une analyse régulière de l'Etat. L'analyse d'état stable reflète l'équilibre du système et la responsabilité sur des stimuli de signalisation (par ex., L' application de la drogue ou de mutation).
    1. Ouvrez le logiciel SQUAD 17, Cliquez sur "Network Load" → upload 'JoVE_tumor models.xml' du fichier. Cliquez sur "Exécuter l'analyse":
      NOTE: Ensuite, SQUAD applique la fonction exponentielle pour interpoler la connectivité réseau booléenne, qui permet la simulation dynamique du comportement du réseau au fil du temps (courbes d'activité sigmoïde de couleur).
    2. Cliquez sur "Avancé" → "perturbateur" pour écrire un protocole de simulation. Simuler la résistance de l' EGFR anti: Cliquez sur "Modifier Protocole"
      1. Cliquez sur "perturbation" → utiliser standard "InitialState = SS-4" (état stable 4) → Cliquez sur "Ajouter" pour ajouter "nouvelle impulsion constante '→ Select paramètre "état" → Sélectionner cible "FLIP" → Choisir le temps "0" → Sélectionner la valeur "0,4" → Cliquez sur "OK".
      2. Répétez ceci: Cliquez sur "Ajouter" → Sélectionner le paramètre "Etat" → Sélectionner cible "c-MET" → Choisir le temps "0" → Sélectionner la valeur "0,4" → Cliquez sur "OK"; Cliquez sur "Ajouter" → Sélectionner le paramètre "Etat" → Sélectionner cible "gefitinib" → Choisir le temps "0" → Sélectionner la valeur "1" → Cliquez sur "OK".
      3. Définir une valeur d'état de nœud actif (EGF-EGFR): Cliquez sur "activenode" → Cliquez sur "Edit" → Choisir le "0.8" → Cliquez sur "OK"; pour tous les autres nœuds: Cliquez sur "Edit" → Sélectionnez l'état "0" → Cliquez sur "OK". Cliquez sur "OK" pour enregistrer le protocole.
      4. Afficher les courbes spécifiques: Accédez au panneau "Options" → Sélectionnez "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "caspases", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "apoptose", "prolifération", "MEK-Inh" et "PI3K-Inh" pour la représentation graphique. Cliquez sur "Initialisation" → "Exécuter" pour lancer une simulation complète de la réponse du système. Cliquez sur "Reset" pour démarrer une nouvelle simulation.
    3. Simuler PI3K combiné et le traitement de l'inhibiteur MEK: Cliquez sur "Modifier Protocole"
      1. Utiliser le même paramètre de noeud comme décrit sous 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Cliquez sur "perturbation" → Cliquez sur "Ajouter" pour ajouter "nouvelle impulsion constante '→ Sélectionner le paramètre" Etat "→ Sélectionner cible" PI3K-Inh "→ Choisir le temps" 0 "→ Sélectionner la valeur" 1 "→ Cliquez sur" OK "; Cliquez sur "Ajouter"d'ajouter «nouvelle impulsion constante '→ Sélectionner le paramètre" Etat "→ Sélectionner cible" MEK-Inh "→ Choisir le temps" 0 "→ Sélectionner la valeur" 1 "→ Cliquez sur" OK ".
      2. Cliquez sur "OK" pour enregistrer le protocole. Accédez au panneau "Options": Utiliser les mêmes nœuds pour la représentation graphique comme décrit sous 6.2.2.4. Cliquez sur "Initialisation" → "Exécuter" pour lancer une simulation complète de la réponse du système. Cliquez sur "Reset" pour terminer la simulation.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Sur la base de l'échafaudage SISmuc (figure 2A à C), nous avons établi un protocole opératoire normalisé pour la génération, la stimulation et le traitement d'un système de test de la tumeur 3D (figure 2D). Ce modèle permet la détermination de l'index de prolifération et la quantification de l' apoptose en utilisant M30-ELISA comme représenté sur la figure 1 et à la figure 3, respectivement. La fi...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Nous avons établi un combiné in vitro / in silico système de test de la tumeur pour les prédictions de traitement biomarqueurs guidée. Le modèle in vitro évalue les différents aspects importants de l' action de composés tels que des modifications de la prolifération des cellules tumorales et de l' apoptose sur un fond mutationnelle spécifique qui peut également être simulé in silico 17. Ici, nous présentons le protocole standardisé pour la 3D génération de modèle de tumeur e...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ont rien à révéler.

Remerciements

Cette recherche a été commanditée par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF, subvention BD247) de l'hôpital universitaire de Würzburg et le programme Bayern Fit (accordé à Heike Walles).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chaire de bioréacteurs en génie tissulaire et médecine régénérative, Wü ; rzburg (GER)Configuration du bioréacteur
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Couronnes cellulairesChaire d’ingénierie tissulaire et de médecine régénérative, Wü ; rzburg (GER)pour la culture 3D statique
CellDesignerhttp://www.celldesigner.org/-Ce logiciel a été utilisé pour dessiner le réseau.
Solution mère tampon de citrate (10x)dans la production42 g/L d’acide citrique monohydraté, 17,6 g/L de granulés d’hydroxyde de sodium dans de l’eau désionisée, pH 6,0, stockés à RT.
Solution de travail tampon de citratedans la production interne 10 % Solution mère de citrate dans l’eau déminéralisée, stockée à RT.
Acide citrique monohydratéVWR, Darmstadt (GER)1002441000utilisé pour le tampon de citrate
CouverclesVWR, Darmstadt (GER)631-1339
DAPI Fluoromount-GTMSouthernBiotech, Birmingham (États-Unis)SBA-0100-20
Bases de données telles que KEGG, HPRD et QIAGEN (Genes & Pathways)http://www.genome.jp/kegg/pathway.html ; http://www.hprd.org/ ; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/-Différentes bases de données de littérature connues ont été utilisées pour générer la topologie du réseau.
Té-t-shirt femelle Luer Lug StyleMednet, Mü ; nster (GER)FTLT-1Configuration du bioréacteur
Style de filetage Luer femelle avec filetage hexagonal 5/16" à filetage UNF 1/4-28Mednet, Mü ; nster (GER)SFTLL-J1A  ;Configuration du bioréacteur
Sérum de veau fœtalBio& SELL, Feucht (GER)FCS. ADD.0500non inactivé
GefitinibAbsource Diagnostics GmbH, Mü ; nchen (GER)S1025-100 mg100 mM solution mère avec DMSO
Fiole en verre (Schott, GER) équipée d’un raccord de tuyau en verreWeckert, Kitzingen (GER)
Histofix 4 % (Paraformaldehyd)Carl Roth, Karlsruhe (GER)P087.1
Raccord de tuyauMednet, Mü ; nster (GER)CC-9Installation d’un bioréacteur
Incubateur pour bioréacteursChaire d’ingénierie tissulaire et de médecine régénérative, Wü ; rzburg (GER)Configuration du bioréacteur
M30 CytoDeathTM ELISAPeviva, Bromma (SWE)10900
Male Luer Integral Lock RingMednet, Mü ; nster (GER)MTLL230-J1AConfiguration du bioréacteur
Chambre d’humiditésur
Anti Pan-Cytokératine de sourisSigma-Aldrich, Munich (GER)  ;   ;C2562-2MLClone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, utilisé 1/100 pour l’immunofluorescence
Valve écouvillonnable sans aiguille Femelle LuerMednet, Mü ; nster (GER)NVFMLLPCConfiguration du bioréacteur, pour l’échantillonnage, stérilisé aux rayons gamma
Joint torique MVQ 10 rouge 37 x 3 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)21444Joint torique grand, Configuration du bioréacteur
Joint torique MVQ 70 rouge 27 x 2,5 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)19170Joint torique petit, Configuration du bioréacteur
Stylo PAPDako, Hambourg (GER)S002
ParaffineCarl Roth, Karlsruhe (GER)6642.6
Pompe péristaltiqueIsmatec, Wertheim-Mondfeld (GER)Configuration du bioréacteur
Phosphate Saline tamponnéSigma-Aldrich, Munich (GER)  ;   ;D8537-6x500ml
Cassette de tubulure de pompeIsmatec, Wertheim (GER)IS 3710Configuration du bioréacteur
Rabbit anti Ki67Abcam, Cambridge (UK)ab16667Clone SP6, utilisé pour 1/100 pour IF
Rabbit anti VimentinAbcam, Cambridge (UK)ab92547utilisé 1/100 pour IF
RPMI-1640 mediumLife technologies, Darmstadt (GER)61870-044chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
Tube en siliconeCarl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)HC66.1Configuration du bioréacteur
Hydroxyde de sodiumSigma-Aldrich, Mü ; nchen (GER)30620-1KG-Rutilisé pour le tampon de citrate
SQUADhttp://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-Celogiciel a été utilisé pour effectuer les simulations semi-quantitatives.
Filtre à air stérile, taille de pores 0,2 & micro ; mSartorius Stedium Biotech, Gö ; ttlingen (GER)16596-HYK Configuration dubioréacteur
Seringue Luer Lok 5 mlBD Biosciences, Heidelberg (GER)309649pour l’échantillonnage du bioréacteur
Plaques d’essai de culture tissulaire : 6-,  ;   ;   ;   ;   ; 12, 24, 96 puitsTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER)92006, 92012, 92024, 92048  ;
Facteur de croissance transformant-bêta 1 (TGF-&beta ; 1) avec supportCell Signaling, Francfort (GER)8915LCsolution mère dans un tampon de citrate stérile pH 3,0
Triton X-100Sigma-Aldrich, Mü ; nchen (GER)X100-1L
Tween-20Sigma-Aldrich, Mü ; nchen (GER)P7949-500mlpour tampon de lavage de coloration immunofluorescente
interne thermiquement mesure

Références

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29(2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87(2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569(2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170(2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92(2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9(2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277(2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Mod le de tumeur pulmonaire 3Dpr diction de la r ponse aux m dicamentscellules avec mutation de l EGFRtraitement au gefitinibindice de prolif ration Ki67apoptose par ELISA M30transition pith lio m senchymateuseculture en bior acteur fluxmod le in silico bool en

Articles connexes