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Isolement et différenciation des cellules souches adipeuses de porcines sous-cutanée des tissus adipeux

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DOI :

10.3791/53886

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31 mars 2016

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1Institute of Biotechnology, National Taiwan University, 2Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University, 3Department of Surgery, National Taiwan University Hospital and College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement de cellules souches dérivées du tissu adipeux de porc (pADSC) dans des tissus adipeux sous-cutanés avec examen de la multipotence. Les pADSC multipotents sont utilisés pour délimiter les processus de différenciation des adipocytes et étudier la transdifférenciation en plusieurs lignées cellulaires de mésenchyme mésodermique ou d’autres lignées d’ectoderme et d’endoderme pour des études régénératives.

Résumé

L’obésité est une épidémie mondiale sans contrainte. La mise au point des contrôles moléculaires dans le développement du tissu adipeux est prometteuse pour traiter l’obésité ou le diabète. Bien que de nombreuses lignées cellulaires adipogéniques immortalisées aient été établies, les cellules souches dérivées du tissu adipeux adipeux de la fraction vasculaire stromale des tissus adipeux blancs sous-cutanés fournissent un système cellulaire fiable ex vivo beaucoup plus proche du développement adipeux in vivo. Les cellules souches dérivées du tissu adipeux de porc (pADSC) sont isolées chez des porcelets âgés de 7 à 9 jours. Le dépôt de graisse blanche dorsale des tissus adipeux sous-cutanés porcins est tranché, haché et la collagénase digérée. Ces pADSC présentent un fort potentiel de différenciation en adipocytes. De plus, les pADSC possèdent également une multipotence, évaluée par des marqueurs sélectifs de cellules souches, pour se différencier en divers types de cellules mésenchymateuses, notamment les adipocytes, les ostéocytes et les chondrocytes. Ces pADSC peuvent être utilisés pour la clarification des commutateurs moléculaires dans la régulation de la différenciation adipocytaire classique ou en direction vers d’autres types de cellules mésenchymateuses d’origine mésodermique. De plus, des lignées étendues dans des cellules d’origine ectodermique et endodermique ont récemment été réalisées. Par conséquent, les pADSC dérivées dans ce protocole fournissent une source abondante et évaluable de cellules souches mésenchymateuses adultes avec une multipuissance complète pour l’étude du développement adipeux et de l’application à l’ingénierie tissulaire de la médecine régénérative.

Introduction

L' obésité, présente dans environ 30% de la population aux Etats - Unis, avec un indice de masse corporelle supérieur à 30, a émergé comme un phénomène mondial répandu 1. L' obésité a tendance à conduire à des complications connexes , y compris les maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2 et le cancer 2-4. Par conséquent, face à l'obésité est une priorité importante. L'obésité se manifeste par une expansion massive des tissus adipeux, et est attribuée à la consommation excessive de nourriture et d'un style de vie sédentaire dans la société moderne. Par conséquent, déchiffrant la régulation transcriptionnelle de l' adipogenèse et la lipogenèse pourrait tenir la promesse pour traiter l' obésité ou le diabète 5.

3T3-L1, 3T3-F442A et d'autres lignées cellulaires de souris ont été appliquées adipogène pour étudier l'adipogenèse ou lipogénèse au cours du développement du tissu adipeux. Cependant, il existe des différences dans les mécanismes de régulation entre les lignées cellulaires in vitro et in vivo des animaux 6. Primary adipeuse-deriLes cellules souches cb (ADSC) dans la fraction de cellules stroma-vasculaire peuvent être isolés directement à partir de tissus adipeux blancs et induites à se différencier. Différenciation des ADSC en adipocytes récapitule très probablement le processus de l' adipogenèse et la lipogenèse dans le développement du tissu adipeux in vivo 7.

Les porcs sont un modèle animal approprié pour l'étude de l'adipogenèse et la lipogenèse dans le développement du tissu adipeux. Nos études porcines précédentes 8-10 démontrent que l' expression de la stérol de régulation du facteur de transcription 1c élément de liaison (de SREBP1c), un important facteur de transcription connu pour moduler la transcription lipogénique synthase d'acide gras, est inhibée par des acides gras poly - insaturés (PUFA) dans le foie porcin et les tissus adipeux. L'expression de SREBP1c porcin a diminué de PUFA in vivo et in vitro est similaire à d' autres espèces telles que les humains et les souris 11-13. Ces études de porc in vitro sont principalement dans diffadipocytes erentiated dérivés de ADSC porcin (pADSC). Par conséquent, cette culture de cellules primaires de pADSC peut être utilisé pour servir de système cellulaire fiable pour étudier le développement du tissu adipeux ou d'autres applications de cellules souches.

Protocole

Note: Cette méthode a été établie et utilisée dans la recherche indiqué précédemment 14-17 de ce laboratoire; au fil du temps la méthodologie a été modifiée. La procédure en cours a été effectuée en utilisant une moyenne de 60 g de tissu adipeux sous-cutané de porc d'un porcelet (âgés de 7 à 9 jours) avec ensemencement sur des plaques à 6 puits de culture tissulaire. Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante sauf indication contraire. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnels (IACUC) à l'Université nationale de Taiwan.

1. Préparer Digestion Medium

  1. Obtenir les tissus adipeux sous-cutané de la nuque et du dos; 40 à 80 g par porcelet (7 à 9 jours old), selon la taille des porcs. Ici, utiliser 60 g de tissus adipeux sous-cutanés obtenus à partir d'un porc.
  2. Préparer le milieu de digestion: peser la poudre collagénase II avec un total de 54.000 unités et le dissoudre dans 90 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM,pour 60 g de matières grasses) dans un flacon de 100 ml sérologique (900 unités de collagénase / 1,5 ml de DMEM / g de matière grasse).
  3. Agiter doucement le milieu de la digestion sur une table d'agitation (100 rpm) pendant au moins 15 min pour dissoudre et ensuite passer le milieu de digestion à travers un filtre de 0,22 um pour la stérilisation. Conserver à 4 ° C avant utilisation.

2. Disséquer sous-cutanée des tissus adipeux de porcs

  1. Stériliser tous les instruments, le verre et articles en plastique et chaud tous les médias à 37 ° C avant utilisation.
  2. Sacrifiez le porcelet avec étourdissement électrique et exsanguination ou en utilisant une méthode en conformité avec les réglementations locales IACUC. Effectuer la dissection soigneusement et immédiatement après les porcelets sont sacrifiés.
  3. Poser le porcelet sur une table chirurgicale propre (retour vers le haut et le ventre vers le bas). Raser les cheveux de la porcelet arrière enlever tous les cheveux de la nuque à la queue et sur les deux côtés vers le bas de la ligne médiane.
  4. Frotter dorsale la peau du cochon avec 7,5% povidoneiode permet trois fois (avec trois nouveaux indépendants-scrubs), puis l'iode pour reposer sur la surface de la peau pendant environ 10 min.
  5. Retirez le povidone-iode avec plusieurs sprays de 70% d'éthanol. Utilisez des tampons de gaze ou de papiers tissu contenant 70% d'éthanol pour essuyer la peau dans une direction, en répétant jusqu'à ce qu'aucune couleur évidente de povidone-iode est observée.
  6. Utilisation d'un scalpel pour séparer la couche de graisse de porc dorsale du tissu adipeux sous-cutané le long de la couche de peau attachée à partir des muscles tout en maintenant la graisse et la peau à l'aide de pinces.
  7. immerger immédiatement la couche de tissus adipeux sous-cutané avec la peau attachée de graisse dans un bêcher stérilisé (200 ml) contenant du DMEM sans sérum.
  8. Vaporiser l'extérieur du récipient contenant la couche de graisse à 70% d'éthanol et dans un écoulement laminaire hotte de culture cellulaire. Placer un grand (40 cm x 30 cm) stérilisée triple couche feuille de couverture dans la hotte. [Une triple couche est utilisée pour assurer l'intégrité continue.]
  9. Placer letissu avec la peau vers le bas sur la feuille de couverture.
  10. Couper le tissu musculaire restant hors du tissu adipeux à l'aide des pinces et des ciseaux pour éviter toute contamination avec le tissu musculaire.
  11. Couper la graisse en morceaux carrés (~ 7 cm X 7 cm) avec un scalpel ou des ciseaux. Placer ces morceaux de la couche de graisse dans un nouveau récipient stérilisé (200 ml) contenant du DMEM exempt de sérum.
  12. Fixer un support de tranche personnalisé sur la feuille de recouvrement assemblé avec une lame de trancheuse en acier au carbone (figure 1). Prenez un morceau de gras sur le bécher et le placer sur la trancheuse (couche de peau sur le dessus et la graisse couche ci-dessous).
  13. Trancher la couche de tissus adipeux sous-cutané de la graisse dans environ 1 mm d'épaisseur de pièces. Trancher la couche de la peau le plus près possible de la graisse, mais éviter de couper la peau.
  14. Hacher tranché tissus adipeux avec des ciseaux aussi fins que possible.
  15. Ajouter milieu de digestion filtrée contenant de la collagénase à un Erlenmeyer de 250 ml ou une bouteille sérologique avec émincéles tissus adipeux (54.000 unités de collagénase / 90 ml de DMEM / 60 g de matières grasses).
  16. Incuber et agiter le flacon d'Erlenmeyer à 45 tours par minute dans un agitateur orbital pendant 90 minutes à 37 ° C pour permettre la collagénase à digérer les tissus.
    Remarque: Vérifiez toutes les 15 à 30 minutes pour éviter la digestion. Le processus de digestion est terminée si le milieu de digestion est une suspension sans amas de tissus importants.
  17. Ajouter un volume égal (égaux au milieu de digestion) du milieu de culture contenant du DMEM / F12 avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) pour arrêter la digestion par la collagénase.

figure-protocol-1
Figure 1. Un trancheur adapté utilisé pour l' isolement de pADSC. Disséqué les tissus adipeux provenant de tissus adipeux sous - cutanés dorsaux de porc sont composées de la couche de graisse avec des couches jointes de la peau. Une trancheuse est nécessaire pour couper la couche d'environ 1 mm d'épaisseur avec l'évitement de surmonter de graissedécouper dans les couches cutanées. De gauche à droite: support de tranche, pad trancheuse, lame de trancheuse en acier au carbone, et les vis. Lame de Slicer est inséré entre le support de tranche et le tampon de trancheuse lorsqu'il est assemblé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Collecte de pADSC de la fraction stroma-vasculaires

  1. Passez le milieu de digestion contenant les tissus adipeux digérés par une seule couche de mousseline dans un stérilisée Erlenmeyer de 250 ml propre ou une bouteille de 250 ml sérologique. Utilisez une pince pour enfoncer le milieu de la mousseline pour guider et aider le passage de la digestion.
  2. Égoutter et tordre le chiffon avec une pince pour terminer le passage.
  3. Distribuer le milieu de digestion en quatre 50 ml coniques des tubes de centrifugeuse (~ moyennes de 40 ml par tube).
  4. Centrifuger à 700 g pendant 10 minutes pour recueillir le culot de cellules stromales-vasculaires.
  5. Décanter le surnageant sans déranger les pastilles pour éliminer la majeure partie de la couche supérieure de matière grasse contenant des adipocytes matures. Laver le culot par addition de 10 ml de DMEM dans chaque tube pour remettre en suspension le culot avec pipetage et agitation douce du tube.
  6. Centrifuger à 700 g pendant 6 min. Décanter le surnageant.
  7. Ajouter 10 ml de tampon de lyse ACK puis resuspendre le culot par pipetage. Laisser reposer pendant 7 minutes (5 à 10 min) à température ambiante pour lyser les globules rouges dans la fraction stroma-vasculaire.
  8. Ajouter des quantités égales de DMEM (10 ml) pour arrêter la réaction en agitant doucement du tube et puis centrifuger à 700 g pendant 10 min.
  9. Décanter le surnageant, on ajoute 10 ml de DMEM dans chaque tube, la remise en suspension du culot avec pipetage répété, et centrifuger à 700 g pendant 6 min. Répéter deux fois.
  10. Recueillir et passer le DMEM (total de 40 ml de DMEM à partir de 4 tubes représentant 60 g de gras) avec des cellules en suspension à travers un tamis de 100 um dans un nouveau 50 ml tube conique.
  11. Doucement pipette medium à plusieurs reprises pour bien et aliquote mélanger 20 pi de milieu contenant des cellules mélangées avec 180 pi de solution de bleu de trypan 0,4% (dilution 1:10) dans un nouveau 1,5 ml Eppendorf tube.
  12. Compter les cellules avec un pADSC de semences hémocytomètre puis à une densité de 60.000 cellules / cm2 sur une taille désirée de boîte de culture ou d'une plaque avec un milieu de culture contenant DMEM / F12, 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% d' antibiotiques de pénicilline solution B -streptomycin-amphotéricine (P / S / A). Généralement, ensemencer le pADSC sur les 6 puits des plaques de culture de tissus pour adipocyte ou la différenciation des ostéocytes. Graine du pADSC sur des plats de 10 cm pour le marqueur de surface coloration des cellules souches ou la différenciation des chondrocytes.
  13. Incuber les plaques ou les plats de la couveuse 37 ° C dans l' air avec 5% de CO 2 pour permettre la fixation des cellules sur les plaques.

4. Identification des marqueurs de cellules souches Surface de pADSC par cytométrie de flux

  1. Après 24 heures, retirer le support complètement, laver ee 10 cm plat à deux reprises avec un tampon phosphate salin (PBS) et des cellules de récolte avec 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C.
  2. Neutraliser trypsine-EDTA avec des quantités égales de milieu de culture (1 ml), de recueillir les cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml, puis centrifuger à 400 x g pendant 7 min.
  3. Décanter le surnageant. Laver le culot deux fois dans 3 ml de tampon de FCS lavage glacé (PBS contenant du FBS à 10%) en utilisant la remise en suspension par pipetage couplée à une centrifugation à 400 g pendant 7 min.
  4. Resuspendre, compter, et ajuster pADSC 10 6 cellules / ml dans un tampon FCS-lavage glacé. les cellules place (100 ul / chaque tube) dans de nouveaux tubes coniques de 15 ml multiples et incuber les tubes contenant pADSC à 4 ° C pendant 30 minutes avec des anticorps dirigés contre l'une ou l'autre CD4a conjugués à la phycoérythrine (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE ou MHC II-PE pour la coloration directe. Arrêter la réaction par lavage des cellules deux fois dans 10 ml de tampon FCS-lavage couplé avec 400 × g centrifugation pendant 7 min.
  5. Fixer et resuspendre les cellules dans un tampon de fixation (PBS avec 0,01% de FBS et 1% de formaldéhyde) pour cytométrie en flux selon les instructions du fabricant et de notre publication précédente 18.

5. Différenciation des pADSC en adipocytes, Ostéocytes et chondrocytes

  1. Différenciation des pADSC en adipocytes
    1. Préparer adipocyte milieu d'induction et de milieu d'entretien adipocytaire
      1. Pour un milieu d'induction de l'adipocyte, préparer 1 L de sans sérum DMEM / F12 (avec des antibiotiques de 1% P / S / A) contenant les éléments suivants: 1 ml d'insuline stock (10 mg / ml de tampon HEPES, pH 8), conc = 10 pg / ml; 1 pi T3 stock (3,3 ', 5-Triiodo-L-thyronine, 1 mM dans du DMSO), conc = 1 nM; 200 pl transferrine stock (50 mg / ml à double H 2 O distillée), conc = 10 pg / ml; 100 dexaméthasone pi stock (10 mM dans de l'éthanol), conc = 1 uM; 100 rosiglitazone pi stock (10 mM dans du DMSO), conc= 1 pm.
      2. Préparer un milieu d'entretien des adipocytes avec les mêmes additifs que le milieu d'induction, mais avec omission de la dexaméthasone.
    2. processus de différenciation des adipocytes
      Remarque: après l'ensemencement pADSC sur des plaques à 6 puits, pADSC sera confluentes dans les 72 heures.
      1. Après 3 jours, retirez le support complètement, puis ajouter 3 ml de milieu adipocyte d'induction dans chaque puits. Remettre les plaques dans l'incubateur. Ceci est le jour zéro de la différenciation.
      2. Après 3 jours, retirez le support adipocyte d'induction complètement et remplacer par 3 ml de milieu d'entretien adipocytaire tous les trois jours. adipocytes matures seront différenciés en phase terminale par environ 9 jours. Plus de 90% des adipocytes sont bien différenciés en utilisant ce protocole. Ces adipocytes sont prêts pour Oil Red O coloration.
  2. Différenciation des pADSC en ostéocytes
    1. Préparer le milieu ostéocytes d'induction: toutes mediu de culturem (DMEM / F12 avec 10% de FBS et 1% de P / S / A) contenant 1 uM de dexaméthasone, 10 mM de β-glycérophosphate et 50 pg / ml d'ascorbate-2-phosphate.
    2. processus de différenciation des ostéocytes
      Remarque: après l'ensemencement pADSC sur des plaques à 6 puits, pADSC sera confluentes dans les 72 heures.
      1. Après 3 jours, retirez le support complètement et ajouter 3 ml de milieu ostéocytes d'induction dans chaque puits. Remettre les plaques à 37 ° C incubateur. Ceci est le jour zéro de la différenciation.
      2. Remplacer avec le milieu ostéocytes d'induction tous les trois jours. ostéocytes matures formeront par 14 jours de différenciation. Ces ostéocytes sont prêts pour Alizarine Red S coloration.
  3. Différenciation des pADSC en chondrocytes
    1. Préparer un milieu d'induction de chondrocytes: aMEM contenant 1% de FBS, 6,25 pg / ml d'insuline, 50 ng / ml d'ascorbate-2-phosphate, et 10 ng / ml de facteur de croissance transformant β1.
    2. processus de différenciation des chondrocytes
      1. Après l'ensemencement pADSC sur des boîtes de culture de 10 cm pour 24 h, éliminer le milieu de culture complètement et laver la vaisselle deux fois avec PBS.
      2. Trypsiniser pADSC avec 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA pendant 5 min, puis on neutralise avec 1 ml de milieu de culture. Recueillir, compter et ajuster pADSC dans 15 ml tubes coniques avec une densité de 2,5 x 10 5 cellules par tube. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.
      3. Après centrifugation à 400 x g pendant 7 minutes, jeter le surnageant sans perturber le culot et ajouter 1 ml de milieu chondrocytes d'induction dans un tube de 15 ml. Le tube est retourné à l'incubateur à 37 °. Ceci est le jour zéro de la différenciation.
      4. Remplacer le milieu d'induction de chondrocytes tous les trois jours sans enlever les cellules sur le fond. chondrocytes matures se formeront dans environ 14 jours. Ces chondrocytes sont prêts pour le bleu de toluidine O coloration.

6. Coloration de Différenciation adipocytes, Osteocytes et chondrocytes

  1. Oil Red O pour la coloration adipocytes différenciés
    1. Au jour 9, éliminer le milieu d'entretien des adipocytes dans 6 puits des plaques de culture avec des adipocytes différenciés et puis laver la plaque deux fois avec PBS. [Dans les étapes suivantes, ajouter des réactifs désignés assez pour couvrir chaque puits de la plaque de 6 puits.]
    2. Fixer les adipocytes avec une solution de formol à 10% pendant au moins 10 min.
    3. Retirer la solution de formol à 10% et laver la plaque deux fois avec de l'eau distillée deux fois.
    4. Après deux lavages, ajouter 100% de propylène glycol à la plaque de culture et laisser reposer pendant 1 min.
    5. Enlever le propylène-glycol 100%, puis on ajoute une solution d'huile rouge O (0,5% dans du propylène glycol) à la plaque de culture. Laisser reposer pendant au moins 10 min sur un agitateur à bascule avec une légère agitation (100 rpm).
    6. Retirer la solution Oil Red O, puis remplacer par 60% de propylène glycol. Laisser reposer pendant 1 min.
    7. Retirez le propylène glycol 60%, puis laver la plaque deux fois avec deau ouble-distillée.
    8. Remplacer par une solution de formol à 10%. Les gouttelettes lipidiques colorées à l'intérieur des adipocytes sont prêts pour l'observation par microscopie optique.
    9. Quantification intracellulaire Oil Red O (des étapes facultatives ci-dessous): après l'observation microscopique, supprimer 10% de solution de formaline et laver la plaque deux fois avec de l'eau distillée deux fois.
    10. Égoutter la plaque complètement et ajouter 500 pi d'isopropanol à la plaque de 6 puits.
    11. Laissez reposer l'isopropanol dans la plaque de 6 puits sur un agitateur à bascule douce (100 rpm) pendant au moins 10 minutes pour dissoudre le colorant de Oil Red O.
    12. Aspirer l'isopropanol contenant Oil Red O et distribuer sur une plaque de 96 puits. Quantifier le Red O L'huile extraite à l'aide d'une lecture spectrophotométrique à 510 nm.
  2. Alizarine Red S coloration pour ostéocytes différenciée
    1. Au jour 14, éliminer le milieu ostéocytes d'induction à partir de plaques de 6 puits avec ostéocytes différenciés et laver les plaques deux fois avec PBS. [Dans les following étapes, ajouter des réactifs désignés assez pour couvrir chaque puits de la plaque de 6 puits.]
    2. Fixer ostéocytes dans une solution de formol à 10% pendant au moins 10 min.
    3. Retirer la solution de formol à 10% de chaque puits et laver la plaque deux fois avec de l'eau distillée deux fois.
    4. Après deux lavages, ajouter la solution Alizarine Red S 2% (pH = 4,1-4,3) à la plaque de 6 puits et laisser reposer pendant au moins 15 min sur un agitateur à bascule douce (100 rpm).
    5. Retirer la solution Alizarine Red S, puis laver la plaque deux fois avec de l'eau distillée deux fois.
    6. Remplacer par une solution de formol à 10%. Ostéocytes sont prêts pour l'observation par microscopie optique.
  3. Bleu de Toluidine O coloration pour chondrocytes différenciés
    1. Au jour 14, Aspirer le milieu des chondrocytes à induction à partir du tube de 15 ml conique sans enlever les sédiments de chondrocytes différenciés dans le fond du tube et on lave le tuyau à deux reprises avec du PBS. [Dans les étapes suivantes, ajouter des réactifs désignés assez pour cover chondrocytes dans la partie inférieure du tube ou sur la lame de coupe.]
    2. Fixer les chondrocytes dans une solution de formol à 10% pendant au moins 10 min.
    3. Retirer la solution de formol à 10% de chaque tube et laver le tube deux fois avec de l'eau distillée deux fois.
    4. Après deux lavages, incorporer des granulés dans le composé octobre et la section d'un cryostat à une épaisseur de 5 um.
    5. Colorer la lame des sections de cryostat avec une solution de bleu de toluidine O (0,1% avec un pH de 4,1).
    6. Retirer la solution bleu de toluidine O, puis laver la section deux fois avec de l'eau distillée deux fois.
      Remarque: Les chondrocytes sur des lames sont prêts pour l'observation par microscopie optique.

Résultats

Le pADSC dérivé de la graisse sous - cutanée dorsale de porc ont été ensemencées sur des plaques de culture ou de la vaisselle et représenté sur la figure 2. La morphologie de la pADSC dérivée de la fraction stroma-vasculaire est similaire à la souris ou ADSC humaine. Vingt-quatre heures après l' ensemencement, subconfluent pADSC sont respectées et ont une étendue fibroblaste morphologie (figure 2A). Le pADSC deviendra confluentes dans les 72 h et sont prêts pour adipocyte ou une autre différenciation de type mésenchymateuses (figure 2B). pADSC présentent un fort potentiel adipogénique après induction chimique et adipocytes matures peuvent être observés après 9 jours de différenciation avec plus de 90% des pADSCs montrant la différenciation adipocytaire (figure 2C).

Pour répondre aux caractéristiques de pADSC dérivée dans ce protocole, les marqueurs de surface de pADSC ont été évalués par cytométrie en flux analyse. Comme on le voit sur ​​la figure 3, les marqueurs de surface des cellules souches mésenchymateuses, y compris CD29, CD44, CD90 et CMH I (ou HLA I), ont été fortement exprimés. Marqueurs de surface négatifs, tels que CD4a, CD31, CD45 et CMH II (ou HLA II) étaient à peine détectable dans pADSC dérivé dans le protocole (Figure 3). Ces résultats démontrent que ces caractéristiques de cellules souches de type mésenchymateuses pADSC d'exposition sans endothéliale significative ou la contamination de cellules souches hématopoïétiques, y compris myéloïdes ou lymphoïdes progéniteurs.

Pour confirmer en outre que pADSC représentent des cellules souches mésenchymateuses, la pluripotence de pADSC a été examinée par la différenciation en adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Ces adipocytes, ostéocytes et chondrocytes ont été colorées par des colorants spécifiques, Oil Red O, Alizarine Red S, et le bleu de toluidine O, respectivement (figure 4). Ces données indiquent que ce protocole généré pADSC qui a retenu multipotency avec des caractéristiques complètes ressemblant à des progéniteurs de type mésenchymateuses.

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Figure 2. Morphologie des pADSC de porc région arrière de graisse. (A) subconfluentes pADSC adhéré et élargis après 24 h ensemencement sur ​​une plaque de culture à 6 puits. (B) pADSC est devenue confluente après l' ensemencement 72 heures sur une plaque de culture 6 puits. Adipocytes (C) matures ont été observés au bout de 9 jours de différenciation adipocytaire à partir pADSC. Les images ont été prises à 100 x grossissement en utilisant la microscopie à contraste de phase. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Identification des cellules souchesdes marqueurs de surface pour pADSC. 1 x 10 5 On a fait réagir de pADSC avec des anticorps spécifiques et analysés pour déterminer les marqueurs de cellules souches par cytométrie de flux. Les chiffres indiquent le pourcentage de cellules colorées dans la population (rouge) par rapport au témoin non coloré. L'axe des abscisses représente l'intensité relative de fluorescence. L'axe des ordonnées représente la population de cellules. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4. différenciation multipotentes de pADSC. Multipotence de pADSC a été déterminée par la différenciation pADSC en (A) adipocytes, (B) ostéocytes (C) chondrocytes et colorées par des colorants représentatifs, Oil Red O, Alizarine Red S, et le bleu de toluidine O, respectivement . Imagements ont été prises à (A) 100 x (B) 200 x, et (C) 100 x grossissement en utilisant la microscopie à contraste de phase, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Nous présentons ici un système cellulaire fiable pour étudier le développement du tissu adipeux dans la culture de cellules primaires de pADSC. Par rapport à d' autres lignées cellulaires immortalisées, ce procédé fournit un moyen commode pour isoler de grandes quantités de cellules souches mésenchymateuses adulte de haute qualité qui peuvent être appliqués à l' étude des processus de différenciation des adipocytes ou d' autres lignées mésenchymateuses liées au développement des animaux in vivo. L'étape modifiée critique dans ce protocole est que nous tirons pADSC l' aide d' un ancien porcelet de 7 à 9 jours , car il est facile à manipuler le petit porcelet par rapport aux porcs plus âgés et aux autres espèces de 19,20, le rendement et la multipotence de pADSC diminue à mesure que les âges de porc 21.

les sources de cellules souches potentielles comprennent des cellules souches embryonnaires (CSE), des cellules souches pluripotentes induites (CISP), et des cellules souches adultes post-natales. La contrainte de ADSC, classées en tant que cellules souches multipotentes adultes, est que multipotence de cellules souches adultesdans la différenciation des lignées divergentes est relativement limitée par rapport à ESC ou iPSC. Cependant, les questions éthiques concernant la dérivation des ESC et oncogènes propriétés de iPSC restreignent l'application de l' ESC et iPSC 22,23. Par conséquent, de nombreux chercheurs se sont concentrés sur les cellules souches adultes avec des efforts pour améliorer la pluripotence. La source la plus commune des adultes des cellules souches mésenchymateuses (MSC), qui a longtemps été étudié, est l' os cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle 24. Cependant, la récolte de la moelle osseuse est considérée comme une procédure relativement douloureuse. Une autre préoccupation est que le rendement des cellules souches de la moelle osseuse est finie. Aspirats de moelle osseuse donnent une moyenne de 6 x 10 6 cellules nucléées par ml, et le MSC ne représentent% 0,001 à 0,01 de toutes les cellules nucléées. Après avoir examiné ces inconvénients, ADSC est proposé comme une source moins gênante pour obtenir des cellules souches multipotentes 25,26.

Limitations sur l'utilisation des ADSC dans Regenerala médecine tion dépendent, dans une large mesure sur le rendement de la cellule et la qualité. Par conséquent, l'importance d'employer des porcs pour isoler ADSC dans ce protocole est de produire une grande quantité de cellules souches adultes de haute qualité. Le porc est un modèle animal utile représentant l' homme en raison de la taille des organes comparables et de nombreuses similitudes physiologiques et biochimiques entre les espèces 27-30. L'acquisition de hADSC de sociétés commerciales est coûteux et dans de nombreux cas, les cellules ont été manipulées, ou à des passages cryoconservés. L'acquisition d'échantillons cliniques humains est relativement difficile en raison des questions éthiques et la production de ADSC est limitée. Nous obtenons environ 6 x 10 5 hADSC par gramme de graisse après digestion par la collagénase. 100 g de tissu adipeux mammaire féminin (un échantillonnage moyenne), un total de 6 x 10 7 cellules peuvent être récoltées. L'utilisation d'une souris individuelle, le rendement est encore plus limitée. Un total de 1 x 10 6 cellules peuvent être récoltées à partir de 0,4 g de i de la souris sous - cutanéetissu adipeux nguinal des deux jambes d'une souris FVB des adultes (âgées de 6-8 semaines). Cependant , dans un porc individuel (7 à 9 jours), soit un total de 2 x 10 8 cellules peuvent être facilement récoltées à partir de 60 g de tissu adipeux sous - cutané dorsal obtenu à partir du dépôt de graisse. Le pADSC dérivé dans ce protocole ont pleinement multipotence type mésenchymateuses et des marqueurs de cellules souches mésenchymateuses appropriées. Par conséquent, pADSC sont une source favorable pour obtenir de grandes quantités de cellules souches adultes sans compromettre la qualité des cellules souches.

L'application de pADSC ne se limite pas à déchiffrer la différenciation des adipocytes, y compris l'adipogenèse et la lipogenèse. Récemment, ADSC sont devenus une source populaire de cellules souches dans le domaine de la médecine régénérative 22,31,32. Par rapport à d'autres sources de cellules souches, ADSC conservent un avantage unique d'être facilement accessible et abondante, et leur multipotence robuste a été démontré être une source prometteuse pour la thérapie de cellules souches et les tissus eNGÉNIERIE 22,33,34. L'accessibilité du tissu adipeux fait ADSC l'un des moyens les moins intrusifs pour obtenir progéniteurs multipotentes. Récemment, nous avons différencié pADSC en grappes sécrétrices d'insuline en réponse au glucose, ce qui indique que pADSC ne se limitent pas à la différenciation mésenchymateuses (données non publiées). D' autres ont également été démontré que ADSC peut être différencié dans de nombreux types cellulaires dérivées d'autres couches de germe telles que les hépatocytes endodermiques ( à partir hADSC 35 ou pADSC 36) ou ectodermiques neurones ( à partir hADSC 37 ou 38 pADSC). Ainsi, pADSC pourrait être utilisé pour médicament à haut rendement ou le criblage biomatériau en orientant les cellules à des processus de différenciation pour obtenir des lignées divergentes souhaitées. Par conséquent, pADSC dérivé dans ce protocole ont une application potentielle dans la thérapie de cellules souches et la transplantation de tissus pour la recherche en médecine régénérative.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude à tous les membres du laboratoire pour la discussion approfondie et technique soutient dans ce protocole. La recherche effectuée dans le laboratoire a été soutenu par des subventions du ministère de la Science et de la Technologie (MOST 103-2314-B-002-126 et MOST 102-2313-B-002-026-MY3) et par des subventions de But pour le Plan University Haut (104R350144) de l'Université nationale, Taiwan.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
collagénase, type IISigma-AldrichC6885
DMEM, glycémie élevée, pyruvateLife Technologies11995-040
DMEM/F-12, HEPESLife Technologies11330-032
Sérum fœtal bovin (FBS)  ;Industries biologiques04-001-1  ;   ;
Pénicilline-Streptomycine-Amphotéricine B (P/S/A) solutionBiological Industries03-033-1Pour l’utilisation d’antibiotiques et d’antimycosiques
&alpha ; MEM, sans nucléosides  ;Life Technologies12561-049
Tampon de lyse ACK  ;Life TechnologiesA10492-01
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge phénolLife Technologies25200072
CD4a-PESigma-AldrichSAB4700063
CD29-PESigma-AldrichSAB4700398
CD31-PESigma-AldrichSAB4700467
CD44-PESigma-AldrichSAB4700183
CD45-PESigma-AldrichSAB4700483
CD90-PESigma-AldrichSAB4700686
HLA Classe I-PE (MHC I)  ;Sigma-AldrichSAB4700640
HLA-DR-PE (MHC II)  ;Sigma-AldrichSAB4700662
Insuline  ;Sigma-AldrichI9278
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)Sigma-AldrichT6397
Transferrin  ;Sigma-AldrichT2036
3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX)Sigma-AldrichI7018
Dexaméthasone  ;Sigma-AldrichD4902
RosiglitazoneCayman71740
&beta ;-Glycérophosphate  ;Sigma-AldrichG9422
Acide 2-phospho-L-ascorbique  ;Sigma-Aldrich49752
TGFB1 Protéine humaine recombinante  ;R& D Systems  ;240-B-002
Rouge Huile O  ;Sigma-AldrichO0625
Rouge Alizarine SSigma-AldrichA5533
Bleu Toluidine OSigma-Aldrich198161
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Equipment
Lames en acier au carboneThomas Scientific6727C18
Falcon 100 & micro ; crépine à cellules mCorning  ;352360
Falcon Plaque 6 puitsCorning  ;
Falcon 100 mm  ; paraboleCorning  ;
353046353003

Références

  1. Farese, R. V., Zechner, R., Newgard, C. B., Walther, T. C. The Problem of Establishing Relationships between Hepatic Steatosis and Hepatic Insulin Resistance. Cell Metab. 15, 570-573 (2012).
  2. Taubes, G. Cancer research. Unraveling the obesity-cancer connection. Science. 335 (28), 30-32 (2012).
  3. Apovian, C. M., Gokce, N. Obesity and cardiovascular disease. Circulation. 125, 1178-1182 (2012).
  4. Glass, C. K., Olefsky, J. M. Inflammation and lipid signaling in the etiology of insulin resistance. Cell Metab. 15, 635-645 (2012).
  5. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444, 847-853 (2006).
  6. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4, 263-273 (2006).
  7. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J Vis Exp. , (2013).
  8. Hsu, J. M., Ding, S. T. Effect of polyunsaturated fatty acids on the expression of transcription factor adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 and of lipogenic and fatty acid oxidation enzymes in porcine differentiating adipocytes. Brit J Nutr. 90, 507-513 (2003).
  9. Hsu, J. M., Wang, P. H., Liu, B. H., Ding, S. T. The effect of dietary docosahexaenoic acid on the expression of porcine lipid metabolism-related genes. J Anim Sci. 82, 683-689 (2004).
  10. Liu, B. H., Kuo, C. F., Wang, Y. C., Ding, S. T. Effect of docosahexaenoic acid and arachidonic acid on the expression of adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 in differentiating porcine adipocytes. J Anim Sci. 83, 1516-1525 (2005).
  11. Ou, J. F., et al. Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR. P Natl Acad Sci USA. 98, 6027-6032 (2001).
  12. Sekiya, M., et al. Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression. Hepatology. 38, 1529-1539 (2003).
  13. Xu, J., Nakamura, M. T., Cho, H. P., Clarke, S. D. Sterol regulatory element binding protein-1 expression is suppressed by dietary polyunsaturated fatty acids - A mechanism for the coordinate suppression of lipogenic genes by polyunsaturated fats. J Biol Chem. 274, 23577-23583 (1999).
  14. Ding, S. T., McNeel, R. L., Mersmann, H. J. Conjugated linoleic acid increases the differentiation of porcine adipocytes in vitro. Nutr Res. 20, 1569-1580 (2000).
  15. Ding, S., Mersmann, H. J. Fatty acids modulate porcine adipocyte differentiation and transcripts for transcription factors and adipocyte-characteristic proteins. J Nutr Biochem. 12, 101-108 (2001).
  16. Liu, L. R., et al. Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways. Obesity (Silver Spring. 19, 2301-2309 (2011).
  17. Chen, Y. J., et al. Docosahexaenoic acid suppresses the expression of FoxO and its target genes. J Nutr Biochem. 23, 1609-1616 (2012).
  18. Lin, Y. Y., et al. Modulation of glucose and lipid metabolism by porcine adiponectin receptor 1-transgenic mesenchymal stromal cells in diet-induced obese mice. Cytotherapy. 15, 971-978 (2013).
  19. Schipper, B. M., Marra, K. G., Zhang, W., Donnenberg, A. D., Rubin, J. P. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 60, 538-544 (2008).
  20. Efimenko, A., et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells From Aged Patients With Coronary Artery Disease Keep Mesenchymal Stromal Cell Properties but Exhibit Characteristics of Aging and Have Impaired Angiogenic Potential. Stem Cell Transl Med. 3, 32-41 (2014).
  21. Akanbi, K. A., Brodie, A. E., Suryawan, A., Hu, C. Y. Effect of age on the differentiation of porcine adipose stromal-vascular cells in culture. J Anim Sci. 72, 2828-2835 (1994).
  22. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise Review: Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine. Stem Cells. 30, 804-810 (2012).
  23. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Cir Res. 100, 1249-1260 (2007).
  24. Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived Stem Cells: Current Findings and Future Perspectives. Discov Med. 57, 160-170 (2011).
  25. Baer, P. C. Adipose-Derived Stem Cells and Their Potential to Differentiate into the Epithelial Lineage. Stem Cell Dev. 20, 1805-1816 (2011).
  26. Kakudo, N., et al. Adipose-derived regenerative cell (ADRC)enriched fat grafting: optimal cell concentration and effects on grafted fat characteristics. J Transl Med. 11, (2013).
  27. Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. Int J Biol Sci. 3, 179-184 (2007).
  28. Prather, R. S., Lorson, M., Ross, J. W., Whyte, J. J., Walters, E. Genetically Engineered Pig Models for Human Diseases. Annu Rev Anim Biosci. 1, 203-219 (2013).
  29. Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann Ny Acad Sci. 1049, 161-171 (2005).
  30. Wolf, E., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Transgenic Res. 20, 1150-1150 (2011).
  31. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 7, 269-291 (2011).
  32. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, 1249-1260 (2007).
  33. Cignarelli, A., et al. Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications. Expert Rev Mol Med. 14, (2012).
  34. Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells: the great WAT hope. Trends Endocrinol Metab. 23, 270-277 (2012).
  35. Banas, A., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 46, 219-228 (2007).
  36. Bruckner, S., et al. A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research. Exp Cell Res. 321, 267-275 (2014).
  37. Anghileri, E., et al. Neuronal Differentiation Potential of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 17, 909-916 (2008).
  38. Huang, T. T., He, D. S., Kleiner, G., Kuluz, J. Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro. J Spinal Cord Med. 30, S35-S40 (2007).

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