In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

Sarah Stauffer; Firat Nebioglu; Ari Helenius

doi:10.3791/53909

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Article de méthode

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

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DOI :

10.3791/53909

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27 mars 2016

Sarah Stauffer¹^,² , Firat Nebioglu³ , Ari Helenius¹

¹Institute of Biochemistry, ETH Zurich, ²Department of Biochemistry, University of Zurich, ³Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

Dans cet article

Résumé

Le désassemblage des noyaux du virus de la grippe A lors de l’entrée du virus dans les cellules hôtes est un processus en plusieurs étapes. Nous décrivons une méthode in vitro pour analyser les premiers stades du désenrobage viral. Dans cette approche, la centrifugation par gradient de vitesse est utilisée pour disséquer biochimiquement les étapes qui initient le dévoilement dans des conditions définies.

Résumé

Les processus moléculaires déclenchés par l’acide contrôlent étroitement l’entrée cellulaire de nombreux virus qui pénètrent par le système endocytaire. Dans le cas du virus de la grippe A (IAV), la fusion du virus avec la membrane endosomale ainsi que le désassemblage ultérieur de la capside virale, appelé désenrobage, sont régis par les conditions ioniques à l’intérieur des vésicules endocytaires. Les premières étapes du cycle de vie du virus sont difficiles à étudier car les endosomes ne sont pas directement accessibles expérimentalement, d’où la nécessité d’une approche in vitro. Nous décrivons ici une méthode basée sur la centrifugation par gradient de vitesse de virions purifiés à travers un gradient de glycérol à deux couches, qui permet d’analyser le noyau de l’IAV et sa stabilité. Le gradient contient un détergent non ionique (NP-40) dans sa couche inférieure pour éliminer la membrane virale par solubilisation lorsque le virus se sédimente vers le fond. À pH neutre, les carottes virales sont granulées sous forme de structures stables. Les principaux composants de base, la protéine matricielle (M1) et les ribonucléoprotéines virales (vRNP), peuvent être clairement identifiés dans la fraction granulaire par SDS-PAGE. La diminution du pH à 6,0 ou moins dans la couche inférieure élimine sélectivement M1 de la pastille, suivie de la libération de vRNP dans des conditions plus acides. Les bandes de protéines virales sur les gels colorés à Coomassie peuvent être soumises à une quantification densitométrique pour surveiller les états intermédiaires de désassemblage de l’IAV. Outre le pH, d’autres facteurs qui influencent la stabilité du noyau viral peuvent être évalués, tels que la concentration en sel et les facteurs de désenrobage viraux présumés, simplement en modifiant la couche de glycérol contenant du détergent en conséquence. L’ensemble de la technique présentée permet une analyse quantitative et hautement reproductible du déshabillage viral in vitro. Il peut être appliqué à d’autres virus enveloppés qui subissent des processus de désenrobage complexes.

Introduction

Le virus grippal A (IAV) est un virus enveloppé et appartient à la famille des Orthomyxoviridae. Ses gènes sont codés sur une, de sens négatif, segmenté et de génome à ARN simple brin. Chez l' homme, l' IAV provoque des infections respiratoires, qui se produisent dans les flambées épidémiques saisonnières et porte le potentiel de pandémies mondiales ^1. Lors de la liaison à des résidus d'acide sialique sur la surface de la cellule hôte ^2, IAV est internalisée par endocytose dépendante de la clathrine et indépendante de la clathrine voies ^3-8. Le milieu acide (pH <5,5) dans les vacuoles d' endocytose déclenche u....