Article de méthode

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

DOI :

10.3791/53909

⸱

27 mars 2016

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

Dans cet article

Résumé

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Le désassemblage des noyaux du virus de la grippe A lors de l’entrée du virus dans les cellules hôtes est un processus en plusieurs étapes. Nous décrivons une méthode in vitro pour analyser les premiers stades du désenrobage viral. Dans cette approche, la centrifugation par gradient de vitesse est utilisée pour disséquer biochimiquement les étapes qui initient le dévoilement dans des conditions définies.

Résumé

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Les processus moléculaires déclenchés par l’acide contrôlent étroitement l’entrée cellulaire de nombreux virus qui pénètrent par le système endocytaire. Dans le cas du virus de la grippe A (IAV), la fusion du virus avec la membrane endosomale ainsi que le désassemblage ultérieur de la capside virale, appelé désenrobage, sont régis par les conditions ioniques à l’intérieur des vésicules endocytaires. Les premières étapes du cycle de vie du virus sont difficiles à étudier car les endosomes ne sont pas directement accessibles expérimentalement, d’où la nécessité d’une approche in vitro. Nous décrivons ici une méthode basée sur la centrifugation par gradient de vitesse de virions purifiés à travers un gradient de glycérol à deux couches, qui permet d’analyser le noyau de l’IAV et sa stabilité. Le gradient contient un détergent non ionique (NP-40) dans sa couche inférieure pour éliminer la membrane virale par solubilisation lorsque le virus se sédimente vers le fond. À pH neutre, les carottes virales sont granulées sous forme de structures stables. Les principaux composants de base, la protéine matricielle (M1) et les ribonucléoprotéines virales (vRNP), peuvent être clairement identifiés dans la fraction granulaire par SDS-PAGE. La diminution du pH à 6,0 ou moins dans la couche inférieure élimine sélectivement M1 de la pastille, suivie de la libération de vRNP dans des conditions plus acides. Les bandes de protéines virales sur les gels colorés à Coomassie peuvent être soumises à une quantification densitométrique pour surveiller les états intermédiaires de désassemblage de l’IAV. Outre le pH, d’autres facteurs qui influencent la stabilité du noyau viral peuvent être évalués, tels que la concentration en sel et les facteurs de désenrobage viraux présumés, simplement en modifiant la couche de glycérol contenant du détergent en conséquence. L’ensemble de la technique présentée permet une analyse quantitative et hautement reproductible du déshabillage viral in vitro. Il peut être appliqué à d’autres virus enveloppés qui subissent des processus de désenrobage complexes.

Introduction

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Le virus grippal A (IAV) est un virus enveloppé et appartient à la famille des Orthomyxoviridae. Ses gènes sont codés sur une, de sens négatif, segmenté et de génome à ARN simple brin. Chez l' homme, l' IAV provoque des infections respiratoires, qui se produisent dans les flambées épidémiques saisonnières et porte le potentiel de pandémies mondiales 1. Lors de la liaison à des résidus d'acide sialique sur la surface de la cellule hôte 2, IAV est internalisée par endocytose dépendante de la clathrine et indépendante de la clathrine voies 3-8. Le milieu acide (pH <5,5) dans les vacuoles d' endocytose déclenche un changement conformationnel dans la majeure IAV pic glycoprotéine hémagglutinine (HA), qui se traduit par la fusion du virus et la fin de la membrane endosomique 9. Une fois que la capside IAV (ici aussi appelé "core" virale) a échappé de endosomes tardifs (les), il est non couché dans le cytosol suivi par le transport des ribonucléoprotéines virales (vRNPs) dans le noyau - le site ola réplication virale et la transcription f 13/10. Avant l'activation de l' acide de HA du virus subit une diminution progressive du pH dans le système d'endocytose, ce qui amorce le noyau pour son démontage ultérieur 14-16. Dans ce "amorçage" étape les canaux ioniques M2 dans la membrane virale médier l'afflux de protons et K +10,14,16. La variation de la concentration ionique à l'intérieur du virus perturbe les interactions accumulent par la protéine virale de la matrice M1 et les huit vRNP faisceau, et facilite IAV déshabillage dans le cytoplasme suivant la fusion membranaire 10,14-17.

analyse directe et quantitative de l'étape d'amorçage a été entravée par le fait que les endosomes sont difficiles d'accès expérimentalement. Le processus d'entrée est, par ailleurs, fortement non-synchrone. En outre, point final des essais, tels que qRT-PCR d'ARN ou d'infectivité virales mesures publiées, ne fournissent pas une image détaillée de l'état biochimique de la capsi viraled à une étape donnée d'entrée. Alors que la perturbation des endosomes par siRNA ou un traitement médicamenteux a contribué de manière significative à la compréhension de l' IAV entrée 18-20, réglage fin est difficile et sujette à des effets secondaires non spécifiques dans le programme endosome de maturation étroitement contrôlé.

Pour éviter ces problèmes, nous avons adapté le protocole précédemment développé in vitro basée sur l'utilisation de la vitesse de centrifugation en gradient de 17. Contrairement à d' autres tentatives 21,22, 23,24, qui sont principalement basés sur des combinaisons de clivage protéolytique et un traitement détergent , suivi d' une analyse EM, cette approche a permis un résultat facilement quantifiables. Centrifugation à travers les différentes couches de gradient permet aux particules sédimentent à être exposée et réagissent avec les conditions changeantes de façon contrôlée. Dans le protocole présenté, IAV dérivé de liquide allantoïdien clarifié ou de particules virales purifiées sont sédimentées dans un glycérol à deux couchesgradient dans lequel la couche inférieure contient le détergent non ionique NP-40 (figure 1). Comme le virus pénètre dans la deuxième couche, contenant un détergent, l'enveloppe lipidique et glycoprotéines d'enveloppe virale sont doucement solubilisés et laissé derrière. Le noyau, composée de huit vRNP faisceau et entourés par une couche de matrice, des sédiments comme une structure stable dans la fraction de culot. protéines de nucléocapside virale, telles que M1 et nucléoprotéine vRNP associée (NP), peuvent être identifiés dans le culot par SDS-PAGE et une coloration de Coomassie. En particulier, en profitant de disponibles dans le commerce des gels de gradient et la coloration avec le colloïdale très sensible Coomassie 25, permet une grande précision et la détection de petites quantités de protéines de base associées virales.

Ceci définit la base pour tester si des conditions différentes telles que le pH, la concentration en sel, et les facteurs déshabillage putatifs ont des effets sur le comportement de sédimentation des composants de base et le noyau stabil lité. A cet effet, seule la couche inférieure contenant un détergent dans le gradient de glycérol est modifiée par l'introduction d'un facteur ou d'une condition d'intérêt. La technique a été particulièrement utile pour étudier l'effet des différentes valeurs de pH et des concentrations de sel sur l'intégrité du noyau IAV 16. IAV étapes intermédiaires de déshabillage pourraient être surveillées , y compris la dissociation de la couche de matrice à un pH légèrement acide (<6,5) , suivie par une dissociation vRNP à pH 5,5 et inférieure 16,17 (figure 1). Cette dernière étape a été encore amélioré par la présence d' une forte concentration de K + dans la couche de glycérol, ce qui reflète un milieu endocytic retard 16. Ainsi, comme le virus et le noyau sédimentés à travers le gradient ils ont connu un milieu changeant qui imite les conditions dans les endosomes. Le résultat était un démontage par étapes du noyau viral in vitro, en complément des résultats provenant de tests de biologie cellulaire.

t "> La méthode présentée ici a permis rapide et une analyse hautement reproductible des IAV (X31 et A / WSN / 33) et IBV (B / Lee / 40) déshabillage déclenchée par un pH acide et l' augmentation de K +16,17 ainsi que le démontage des noyaux paramyxovirus sur un pH alcalin exposition 17. Il est concevable que l'approche peut être adaptée à d' autres virus enveloppés pour mieux comprendre les propriétés biochimiques de la structure de la capside virale et capside démontage lors de l' entrée de la cellule.

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Protocole

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1. Préparation de Tampons et Solutions mères

  1. Préparer tampon TMN (MES 20 mM, Tris 30 mM et NaCl 100 mM) en dissolvant 470 mg Tris Hydrochloride, 390 mg MES hydrate et 580 mg de NaCl dans 80 ml ​​ddH 2 O. Régler le tampon à pH 7,4 et l' amener à un volume final de 100 ml avec ddH 2 O.
  2. Préparer trois solutions identiques de tampon 500 mM MES en dissolvant 9,76 g MES hydrate dans 80 ml ​​dH 2 O chacun. Ajuster les tampons à pH 5,8, 5,4 et 5,0 respectivement par titrage avec du NaOH concentré. Amener chaque tampon jusqu'à un volume final de 100 ml avec dH 2 O.
  3. Préparer deux solutions identiques de tampon 500 mM Tris en dissolvant 7,88 g de chlorhydrate de Tris dans 80 ml ​​de dH2Û chacun et ajuster le pH à 7,4 et 6,4 respectivement par titrage avec du HCl concentré. Amener le tampon jusqu'à un volume final de 100 ml avec dH 2 O.
  4. Préparer la solution de glycérol à 50% dans dH 2 O et bien mélanger jusqu'à ce que le glycerol est mélangé de façon homogène. Filtrer la solution à travers une unité de filtration Steritop (0,22 um de taille des pores) dans une bouteille en verre.
  5. Préparer 10% de NP-40 et une solution 1 M de NaCl dans dH 2 O.
  6. Préparer 25x inhibiteur de la protéase concentrée en dissolvant deux comprimés dans 4 ml ddH 2 O.

2. Préparation de Glycérine Dégradés

  1. Préparer 5 ml de détergent maître tampon mélange (300 mM de NaCl, 2% de NP-40, 2x concentré inhibiteur de protéase) solution pour chaque condition de pH à l'essai (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 et 5,0). A cet effet, mélanger 9 ml de 1 M de NaCl, 6 ml de 10% de NP-40, 2,4 ml de l'inhibiteur de la protéase 25x actions, et 9 ml ddH 2 0.
  2. Pour chaque condition de pH pipette 4,4 ml de mélange maître dans un tube conique de 50 ml.
  3. Pour les valeurs de pH supérieures à 5,8 ajouter 0,6 ml de 500 mM de Tris solution mère à pH ajusté respectif au tube. Pour un pH de 5,8 et inférieure ajouter 0,6 ml de la mM MES 500 solution mère à pH ajusté respectif.
  4. Faire 5ml d' une solution tampon contenant du NaCl 300 mM, inhibiteur de protéase 2x, de Tris 60 mM ajusté à pH 7,4 et ddH 2 O. Cela servira de tampon de gradient de commande sans détergent.
  5. Si nécessaire, bien ajuster le pH des solutions à pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, et 5,0 en ajoutant des solutions de HCl ou de NaOH concentré, respectivement.
  6. Ajouter 5 ml de glycerol à 50% à 5 ml des mélanges tampons détergents contenant et sans détergent résultant en six solutions de glycérol 25% différents. Vérifier les valeurs de pH à l'aide de l'indicateur de pH bandes.
    NOTE: Dans le cas où le pH mesuré diffère sensiblement de la valeur souhaitée, les solutions respectives doivent être préparées à nouveau.
  7. Préparer la solution de glycérol à 15% en mélangeant 50% du stock de glycérol avec dH 2 O dans un rapport de 3: 7.

3. ultracentrifugation de IAV

  1. Ajouter 3 ml de solution de glycerol à 15% dans des tubes de centrifugation ultra claires (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) en utilisant une seringue de 5 ml et une needle (21 G, 9 cm de long). Ne pas laisser des gouttes sur la paroi intérieure du tube, car cela pourrait perturber l'intégrité du gradient. Répéter cette opération pour un total de six tubes de centrifugation, une pour chacune des cinq conditions de pH pour tester et un pour l'échantillon témoin.
  2. Placez délicatement la solution de glycérol 3,4 ml de 25% sous la couche de glycérol de 15% en utilisant une seringue de 5 ml et une longue aiguille. Prenez soin de ne pas mélanger les deux couches. Répétez cette opération pour les six conditions pour tester les solutions de glycérol à pH ajusté respectifs.
    NOTE: Le travail en classe II biosécurité cabinet pour les étapes suivantes.
  3. superposer délicatement les gradients de glycérol avec 30 ul clarifié liquide allantoïdien contenant IAV (X31, H3N2) dilué dans 1 ml de tampon TMN (correspond à environ 20-30 ug de protéine virale totale) pour chaque gradient.
  4. Solde opposés tubes et les placer dans un ultracentrifugation rotor SW41. Centrifugeuse pour 150 min, à 55.000 xg, et 12 ° C.
  5. Après la centrifugation, soigneusementéliminer le surnageant, à savoir, les deux couches de glycérol en utilisant une pipette propre Pasteur et un aspirateur. Remettre en suspension le culot dans 40 ul (1x) non réductrices tampon d'échantillon LDS. Il est important de pipeter monter et descendre plusieurs fois pour dissoudre le culot complètement. Transférer l'échantillon dans un tube de 1,5 ml.

4. SDS-PAGE des granules Fractions et Coomassie

  1. Chauffer tous les échantillons à 95 ° C pendant 10 min. A ce stade, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à ce qu'elles soient analysées par SDS-PAGE.
  2. 20 ul de charge des granulés dissous sur un gradient de pré-coulée (12.04%) du gel de mini-Bis-Tris et exécutés pendant 1 heure à 200 V dans 1 x MOPS SDS tampon en cours d'exécution.
  3. Faire une solution de fixation avec 40% de méthanol et de l' acide acétique à 10% glaciaire ddH 2 O.
  4. Incuber le gel dans une solution de fixation pendant 1 heure et tacher la nuit dans une boîte de culture cellulaire de 15 cm avec un volume suffisant de solution de Coomassie colloïdal tout en douceuragitation à température ambiante.
    NOTE: Il est important de fermer le plat afin d'éviter l'évaporation de la solution de coloration.
  5. Destain le gel dans ddH 2 O. Remplacez le ddH 2 O toutes les 15-20 minutes jusqu'à ce que le fond de gel devient clair. Conserver le gel dans ddH 2 O à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit analysé pour la bande de quantification.
  6. Scannez le gel à haute résolution et utiliser des logiciels disponibles ou sur mesure dans le commerce pour la quantification des intensités des bandes de protéines. Soustraire le signal d'arrière-plan dans une région proche des bandes respectives et à normaliser ces valeurs pour les échantillons témoins sans détergent (à pH 7,4).

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Résultats

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Comme déjà discuté, l'amorçage dans les endosomes est nécessaire pour rendre le noyau IAV décapsidation compétente. Protonation du noyau affaiblit l'interaction de M1 et vRNPs (composé de l'ARN viral, NP, et la polymérase PB1 complexe / PB2 / PA). Ce processus est lancé lorsque le virus entrant est exposé à un pH de 6,5 (ou inférieur) au début des endosomes (SEE) et continue jusqu'à ce que les fusibles de virus à un pH d'environ 5,0 à LEs.

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Discussion

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capsides virales sont des complexes macromoléculaires métastables. Alors que l'assemblage de virions nécessite l'encapsidation et la condensation du génome du virus, l'initiation du prochain cycle de l'infection dépend de démontage de cette structure de capside compact. Les virus ont évolué pour exploiter divers mécanismes cellulaires pour contrôler le cycle de revêtement décapsidation, y compris des récepteurs cellulaires, des chaperons, des enzymes protéolytiques, des forces physiques fournies par les ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions Yohei Yamauchi et Roberta Mancini pour nous fournir des réactifs. Le laboratoire AH a été soutenue par les réseaux de formation initiale Marie Curie (ITN), le Conseil européen de la recherche (CER), et par le Fonds national suisse (Sinergia).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
cOmplete&trade ;, comprimés inhibiteurs de protéase sans EDTASigma-Aldrich11873580001La solution mère peut être conservée à 2 à 8 ° ; C pendant 1 à 2 semaines
Acide acétique glacialMerck Millipore100063
Glycérol anhydre BioChemicaAppliChemA1123
Acide chlorhydriqueMerck Millipore100317
Aiguille d’injection longue (21  ; G, 9 cm, biseau ou extrémité émoussée)
MES hydrateSigma-AldrichM8250
MéthanolMerck Millipore106009
NP-40Sigma-AldrichI8896Maintenant disponible dans le commerce sous le nom d’IGEPAL® ; CA-630
NuPAGE 4-12 % Bis-Tris mini-gels, 10  ; puits, 1,0 mmLife TechnologiesNP0321
Tampon d’échantillon NuPAGE LDS (4x)Life TechnologiesNP0008
Tampon courant NuPAGE MOPS SDS (20x)Life TechnologiesNP0001
Bandes indicatrices de pH, pH 4,0-7,0Merck Millipore109542
QC Coloration colloïdale CoomassieBIO RAD1610803
Sodium chlorureMerck Millipore106406
hydroxyde de sodiumMerck Millipore106498
unité de filtration SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE
SW41 Ti, ensemble de rotors d’ultracentrifugeuseBeckman Coulter331336
Thinwall, tubes de centrifugation ultra-transparents, 13,2 ml, 14 mm x 89 mmChlorhydrate de Beckman Coulter344059
Tris  ;AppliChemA1087
X31 Virus de la grippe A (H3N2), cultivé dans un œuf, liquide allantoïdien clarifiéVirapurFraîchement décongelé le 4 ° ; L

Références

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Mots-clés

Centrifugation sur gradient de vitessed sassemblage de la capside viralegradient de glyc rolsolubilisation au NP 40d shabillage d pendant du pHanalyse par SDS PAGEstabilit du c ur viralprot ine de matrice M1ribonucl oprot ines virales

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