Une méthode pour cibler et Isoler Airway-innervant neurones sensoriels chez la souris

Résumé

Les neurones sensoriels spécifiques à un organe sont difficiles à identifier. Le traçage Fast Blue est utilisé pour identifier les neurones nodoses qui innervent les voies respiratoires pour le tri cellulaire. Les neurones nodoses triés sont utilisés pour extraire de l’acide ribonucléique (ARN) de haute qualité pour le séquençage. À l’aide de ce protocole, l’expression génique de neurones spécifiques des voies respiratoires est déterminée.

Résumé

nerfs somatosensoriels transduction des stimuli nocifs causés par les deux agents endogènes et environnementaux thermiques, mécaniques, chimiques et. Les corps cellulaires de ces neurones afférents se trouvent à l'intérieur des ganglions sensoriels. ganglions sensoriels innervent un organe ou une partie spécifique du corps. Par exemple, les ganglions rachidiens (DRG) sont situés dans la colonne vertébrale et d'étendre les processus à travers le corps et les membres. Le ganglion de Gasser sont situés dans le crâne et innervent la face, et des voies respiratoires supérieures. afférences vagales des ganglions noueux prolongent tout au long de l'intestin, le cœur et les poumons. Les neurones noueux contrôlent un large éventail de fonctions telles que: la fréquence respiratoire, irritation des voies respiratoires, et les réflexes de toux. Ainsi, de comprendre et de manipuler leur fonction, il est essentiel d'identifier et d'isoler des sous-populations neuronales spécifiques des voies respiratoires. Chez la souris, les voies respiratoires sont exposés à un colorant traceur fluorescent, bleu rapide, pour le traçage rétrograde spécifique des voies aériennes noueux neurones. Les ganglions noueux sont dissociés et cellules activées par fluorescence (FAC) tri est utilisé pour recueillir des cellules positives de colorant. Ensuite, l'acide ribonucléique de haute qualité (ARN) est extrait à partir des cellules positives de colorants pour le séquençage de la prochaine génération. En utilisant cette méthode intubation expression spécifique du gène neuronal est déterminé.

Introduction

nerfs somatosensoriels transduction des stimuli nocifs causés par les deux agents endogènes et environnementaux thermiques, mécaniques, chimiques et. Les corps cellulaires de ces nerfs afférents sont situés dans les ganglions sensoriels, comme la racine dorsale, du trijumeau ou des ganglions noueux. Chaque ganglions sensitifs innerve régions spécifiques du corps et contient des cellules qui innervent les organes et tissus séparés dans cette région. Par exemple, les ganglions de la racine dorsale (DRG) sont situés dans la colonne vertébrale et d' étendre les processus à travers le corps et les membres, tandis que les ganglions trigéminés sont situés dans le crâne,....

Protocole

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université Duke.

1. intranasale administration de Fast Blue

Pour Fast Blue, administrer le colorant au moins 2 jours avant euthanasier la souris. Le colorant va persister pendant un maximum de huit semaines.

1. Anesthetize la souris avec l'anesthésie par inhalation de lumière (2,5% de sévoflurane) jusqu'à ce que la respiration commence à ralentir.
2. Utiliser une pipette de 200 pi avec des conseils filtrés pour instiller lentement 40 pl de solution de colorant (0,4 mM bleu rapide, 1% ....

Résultats

En utilisant cette méthode, les neurones des voies aériennes innervant sont marquées par voie intranasale instillant Fast Blue (figure 1A). Au bout de deux jours, les cellules marquées bleu rapide apparaissent dans les ganglions noueux (figure 1C). Ces cellules représentent 3 à 5% de la population neuronale totale des ganglions noueux. D'autres colorants rétrogrades qui ont été utilisés à cet effet comprennent Dil (1,1'-dioctadécyl-3,3,3 ', 3.......

Discussion

Ce protocole décrit un procédé pour cibler des neurones innervant des voies aériennes dans les ganglions noueux du nerf vague. Une fois marqué, les ganglions sont doucement dissociés pour préserver de manière optimale le nombre de cellules et la viabilité. Ces neurones sont ensuite triés FAC directement dans le tampon de lyse et l'ARN est extrait. L'importance de ce protocole est la capacité de cibler, d'isoler et de préserver la qualité d'une population spécifique de cellules sensorielles. L'express.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fast Blue	Polysciences, Inc.	17740-2	stock 2 mg/ml dans l’eau
NeuroTrace 530/615 coloration rouge Nissle	Technologies	N21482
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) sans Ca et Mg	Gibco	14190-144
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
glutamine ( Glutamax)	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
N2	Gibco	17502-048
B27 (sans vitamine A)	Gibco	12587-010
Facteur de croissance nerveuse (NGF)	Sigma	N6009	stock 50 µ ; g/ml dans l’enzyme de digestion PBS/10 % FBS
, Liberase DH Research Grade	Roche	5401054001	stock 2,5 mg/ml dans
une solution aqueuse de particules (Percoll)	Sigma	P1644-25ML
Bloc chauffant	LabNet
70 µ ; Filtre à cellules m	Falcon	352350
Éthanol absolu (200 proof)	Fisher Scientific	BP2818-500
Eau libre RNase	Fisher Scientific	BP2484-100
Réactif de décontamination RNase, RNase AWAY	invitrogen	10328-011
2-mercaptoéthanol	VWR	EM-6010
Kit d’extraction d’ARN, RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Kit DNase, Kit DNase sans RNase	Qiagen	79254
DNase	Sigma	D5025-15KU	stock 10 mg/ml en 0,15 M NaCl
Propidium Iodide	Sigma	P4170-10MG	stock 10 µ ; g/ml dans le
système d’électrophorèse microfluidique PBS (TapeStation 2200)	Agilent

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