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Différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes Utilisation de la BMP Antagonist Grem2

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DOI :

10.3791/53919

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10 mars 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University, 3Department of Cell & Developmental Biology, Vanderbilt University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

La génération de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes in vitro permet d’accéder à de grandes quantités de tissu cardiaque in vitro pour la science fondamentale et les applications cliniques. Ce protocole utilise le facteur d’essai Grem2 pour augmenter le nombre de cardiomyocytes obtenus et pour générer des cardiomyocytes avec un phénotype auriculaire.

Résumé

Les protocoles pour produire des populations de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes ont été développés, mais ceux-ci donnent généralement des cellules de phénotypes mixtes. Les chercheurs intéressés à poursuivre des études impliquant des sous-types de myocytes spécifiques nécessitent une approche de différenciation plus dirigée. Par traitement de souris souches embryonnaires (ES) avec des cellules Grem2, un antagoniste de BMP sécrétées qui est nécessaire pour la formation de la chambre auriculaire in vivo, un grand nombre de cellules cardiaques avec un phénotype auriculaire peut être généré. L'utilisation de la lignée de cellules souches conçu Myh6-DsRed-NUC pluripotentes permet l'identification, la sélection et la purification des cardiomyocytes. Dans ce protocole corps embryoïdes sont générés à partir de cellules Myh6-DsRed-NUC selon la méthode de goutte suspendue et maintenues en suspension jusqu'à ce jour de différenciation 4 (d4). A cellules d4 sont traités avec Grem2 et étalées sur des plaques de gélatine revêtues. Entre d8-d10 grandes surfaces contractantes sont observées dans les cultures et continuent de se développer et mature par d14. Moléculaire, des analyses histologiques et electrophysiogical indiquent les cellules dans les cellules Grem2 traitées acquièrent des caractéristiques atriaux comme fournissant un modèle in vitro pour étudier la biologie des cardiomyocytes auriculaires et leur réponse à divers agents pharmacologiques.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes sont un outil puissant pour générer et étudier les cellules à partir d' une multitude de tissus difficiles à l'accès à des études de recherche et pré-cliniques de base, en particulier chez les humains 1-5. la modulation appropriée des voies de signalisation de développement peut diriger la différenciation des cellules souches pluripotentes au sort phénotypique souhaitée. De nombreux protocoles ont été développés pour générer des cardiomyocytes (SGC) à partir de cellules souches pluripotentes 6-14. Ces protocoles comportent généralement une modulation de la superfamille TFGβ (activine, BMP et TGF) et les voies Wnt par addition temporisée de facteurs de croissance exogènes et / ou des petites molécules 10,12-15. Ces protocoles sont généralement efficaces pour augmenter le pourcentage de cellules qui deviennent CMme, mais manquent de spécificité, la génération d'une population mixte de cellules de lignées représentant auriculaire, ventriculaire et nodal du système / de conduction. Afin d'étudier cardiaque spécifique sous-types d'un appro de différenciation plus orientéeach est nécessaire.

Gremlin2 (Grem2, également appelée protéine apparentée à Dan et Cerberus ou PRDC pour faire court) est un antagoniste BMP sécrétée qui est nécessaire pour la différenciation cardiaque adéquate et la formation de chambre auriculaire au cours du développement cardiaque chez le poisson zèbre 16. Le traitement de différenciation des cellules souches embryonnaires avec Grem2 à la différenciation jour 4, juste après expression pic de marqueurs mésodermiques T-brachyury et Cerberus comme 1, augmente le rendement de la CMS et génère un pool de cellules principalement de la lignée auriculaire 14.

Grem2 recombinant est utilisé pour traiter les cellules différenciées et peut être effectuée en utilisant des techniques 17 de production de protéines standard ou peuvent être achetés dans le commerce. Il est très soluble dans les solutions aqueuses et peut être ajoutée de manière exogène à la culture au point de temps souhaité.

Différenciation peut être suivi par RT-qPCR pour quantifier l'expression des marqueurs représentantdes progéniteurs cardiovasculaires, progéniteurs cardiaques, et engagés Cms. Immunofluorescence peut également être utilisée pour identifier et visualiser la répartition spatiale des types de cellules cardiaques.

Les applications qui requièrent des populations pures sont plus facilement réalisées en utilisant un système rapporteur pour identifier et isoler Cms. A cet effet, nous avons introduit la αMHC-DsRedNuc construire dans la lignée de cellules de souris CGR8 ES 14. Cellules CGR8 grandissent et restent pluripotentes sans cellules nourricières, ce qui facilite l' expansion et la différenciation des essais 18. La lignée cellulaire ES contient une protéine fluorescente DsRed séquence codante avec un signal de localisation nucléaire sous l'alpha cardiaque spécifique chaîne myosine lourd (a Mhc ou Myh6) promoteur du gène. L'utilisation de ces cellules, CMs peut être facilement identifié et isolé pour la quantification, le tri cellulaire, électrophysiologie, écrans de drogue, et les mécanismes de différenciation auriculaire étudier.

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Protocole

1. Préparation de la cellule Culture Media, Solutions et réactifs.

  1. Préparer 500 ml de souris les cellules souches embryonnaires (Mesc) supports par mélange et filtration stérile (0,2 um de taille des pores) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml inactivé par la chaleur du sérum de fœtus bovin (FBS), 5 ml 100X concentrée L- remplacement de la glutamine, 5 ul de souris recombinante leucémie facteur inhibiteur (LIF) à 1 x 10 7 unités par ml et 1,43 ul de ß-mercaptoéthanol (concentration finale 50 uM). Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
  2. Préparer 500 ml de embryoïdes Body (EB) médias de différenciation par mélange et stérile filtrage 391 ml Iscove modifié Dulbecco (IMDM), 100 ml de chaleur FBS inactivé, 5 ml 100X concentré remplacement de L-glutamine, 5 ml 100X concentré acides aminés non essentiels (NEAA), et 2,86 ul de ß-mercaptoéthanol (concentration finale est de 100 uM). Entreposer à 4˚ C jusqu'à utilisation.
  3. Préparer 0,2% en poids/ volume de gélatine en mélangeant 1 g de gélatine de porc en poudre de peau avec 500 ml de filtration, l' eau distillée 2 O. Stériliser par autoclavage. Notez que la gélatine peut ne pas être complètement soluble dans l'eau à température ambiante. Après autoclavage la gélatine doit être complètement dissous. Stocker à température ambiante jusqu'à utilisation.
  4. Préparer Grem2 aliquotes de protéine recombinante en dissolvant 50 ug pastille de lyophilisé Grem2 dans 100 phosphate ul solution saline tamponnée (PBS) additionné de 0,1% de BSA pour faire un / ul solution mère à 0,5 pg. Aliquoter 20 pi de cette solution mère en cinq stériles tubes de 1,5 ml de centrifugeuse et stocker à -80˚ C jusqu'à utilisation.
  5. Préparer PBS selon des protocoles ou d' achat publiés comme un stock 10X et diluer 1:10 avec de filtre, H 2 O distillée pour faire une 1X dilution 19 de travail. Stériliser PBS par autoclavage avant de les utiliser. Stocker à température ambiante jusqu'à utilisation. Dans certaines étapes, DPBS sans Ca 2+ et Mg 2+ est utilisé. Ceci est purchased comme une solution 1X. Informations de commande est inclus dans la table des réactifs.

2. Préparation de Gelatin Coated 10 cm Tissue Culture Plats

  1. Dans une hotte de culture tissulaire stérile ajouter 5 ml d'une solution de gélatine à 0,2% à chaque boîte de 10 cm pour culture de tissus pour le revêtement. Placer la vaisselle dans l'incubateur à 37 ° C pendant au moins 30 minutes ou jusqu'à 4 jours.

3. Préparation de Gelatin Coated 6 puits de culture de tissu Plaques

  1. Dans une hotte de culture tissulaire stérile ajouter 1 ml de gélatine à 0,2% à chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 6 puits. La place des plaques dans l'incubateur à 37 ° C pendant au moins 30 minutes ou jusqu'à 4 jours.

4. Embryonic Culture de cellules souches

  1. mESCs dégel
    1. Préparer des milieux Mesc en réchauffant à la température ambiante dans une hotte de culture tissulaire stérile. Ajouter 10 ml de milieu RT à une boîte de 10 cm revêtu de gélatine.
    2. Retirer 1 flacon de mESCs contenant environ 1 x 10 6 cellules decryoconservation. Tenir cryovial avec des pinces, placer dans un bain d'eau à 37 ° C. Remuer doucement jusqu'à ce que la suspension cellulaire a décongelé et seulement un petit cristal de glace reste dans le centre du flacon. Sécher avec un flacon non pelucheux lingette jetable et stériliser avec 70% EtOH.
    3. Dans une hotte de culture de tissus stériles éliminer les cellules décongelés en utilisant une pointe de P1000 de cryovial et transfert à 10 cm plat préparé au point 4.1.1).
    4. Placez boîte de 10 cm en 37 ˚C culture cellulaire incubateur humidifié avec 5% de CO 2 et de répartir uniformément les cellules en déplaçant doucement l'avant de la plaque à l' arrière, puis côté à l' autre. Permettre aux cellules de se fixer à la plaque O / N ou au moins 6 heures.
    5. La première chose que les prochaines cellules de contrôle du matin pour la fixation à l'aide d'un microscope à champ lumineux. Certains débris cellulaires et les cellules mortes seront observées dans les médias. C'est normal. Aspirer le milieu de la vaisselle et les remplacer par 10 ml de milieu Mesc frais.
    6. Continuer à changer de support sur les cellules chaque jour pour prévenir la différenciation.
  2. mESCs de repiquage
    1. des cellules de passage lorsque 60 à 70% confluentes. Préparer les cellules pour repiquage par aspiration médias et rinçage avec 5 ml stérile 1X DPBS sans MgCl2 et CaCl2. Ajouter une solution de trypsine-EDTA 2 ml 0,05%. Placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min.
    2. Alors que les cellules sont en incubation, préparer une nouvelle boîte de 10 cm par aspiration solution de gélatine et en ajoutant 10 ml de RT MESC médias. Après 5 min de vérifier les cellules du détachement. Si les cellules restent attachés, continuer à incuber à 37 ° C pendant 2 minutes à la fois jusqu'à complètement détaché.
    3. Quench trypsine-EDTA en ajoutant 3 ml de MESC médias. Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml de centrifugeuse et de spin à 200 xg pendant 5 min pour sédimenter. Aspirer le milieu de culot et remettre en suspension dans 10 ml de milieu Mesc.
    4. Selon le rapport de division désiré, ajouter 0,5-1,0 ml de suspension cellulaire à chaque plat préparé à l'étape 4.2.2). Placez plat dans l'incubateur et répartir uniformément les cellules en déplaçant doucement vers l'avant puis côté à l'autre. Toutcellules ow pour fixer O / N ou pendant au moins 12 heures.
      NOTE: Un rapport de division de 1 heures 10-à-1:20 est commun pour la plupart des lignes Mesc. Ce rapport peut varier en fonction de la ligne utilisée, le numéro de passage et la confluence souhaité sur la nouvelle antenne. Pour un transfert 1:10 split rapport 1 ml de suspension cellulaire dans 9 ml de milieu Mesc et de la plaque dans une boîte de 10 cm revêtu de gélatine fraîchement préparée.

5. Préparation de corps embryoïdes

NOTE: Toutes les étapes sauf centrifugation sont effectuées dans une hotte de culture tissulaire stérile.

  1. Préparation de la suspension cellulaire dans EB médias
    1. À 70% de confluence (généralement 24-48 h post-passage), utiliser les cellules pour la formation EB. Préparer les cellules pour la formation EB en détachant et pastillage selon les sections 4.2.1) - 4.2.3).
      Note: (. Par exemple, très peu de la mort cellulaire, pas de contamination, de la morphologie correcte) Il est préférable de cellules de passage au moins un temps de post-dégel et vérifier pour la santé et la croissance robuste (e.g., doublements de population se produisent chaque 24-48 h) avant d'utiliser pour la fabrication de ballasts électroniques.
    2. Re-suspendre le culot dans 5 ml EB médias. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé.
    3. Diluer la suspension de cellules dans le volume requis de milieu EB pour obtenir une concentration finale de 25 cellules / ul (ou 2,5 x 10 3 cellules / ml). A noter que chaque couvercle d'une boîte de pétri contient environ 60 ballasts électroniques et nécessite environ 1,3 ml de suspension cellulaire. A ce stade, préparer un volume suffisant de suspension de cellules pour générer le nombre voulu de ballasts électroniques. Par exemple, si 240 ballasts électroniques sont nécessaires pour l' expérience, préparer 5,2 ml à 2,5 x 10 3 cellules / ml.
      NOTE: mESCs qui ne sont pas utilisés pour la formation EB peuvent être utilisés pour des expériences futures en faisant tourner vers le bas, remise en suspension dans des milieux Mesc et placage comme décrit dans la section 4.2.
  2. Création de corps embryoïdes
    1. Préparer stériles de 10 cm des boîtes de Pétri bactériennes pour suspendre la formation de gouttes par addition de 2 ml de 1 x PBS au fond de l'each.
    2. Transfert EB suspension de l'étape 5.1) à un bassin de solution stérile.
    3. Retirer le couvercle de boîte de Pétri préparée et déposer soigneusement soixante, 20 gouttes ul de EB suspension sur la surface intérieure. Accomplir ceci efficacement à l'aide d'une pipette multi-canaux équipé de 6 conseils. Chaque goutte de 20 pi a maintenant 500 cellules.
    4. Replacez délicatement le couvercle sur la moitié inférieure de la boîte de Pétri bactérienne, en faisant attention à ne pas déloger gouttes pendaison. Placez les plats dans la culture cellulaire incubateur à 37˚ C. Après 2 jours, les cellules sont prêtes pour laver comme décrit en 5.3).
  3. Wash-down de corps embryoïdes
    Note: Toutes les étapes de lavage vers le bas sont réalisées dans une hotte de culture tissulaire stérile.
    1. Après 2 jours EB de sont prêts pour le lavage et le transfert de boîtes de 6 cm de Pétri bactériennes. Pré-chaud 3 ml de EB médias par boîte de Pétri à la température ambiante. Chaque boîte de Pétri de 6 cm bactérienne peut effectivement contenir 2 couvercles d'une valeur de gouttes pendaison.
      Remarque: Veillez à utiliser une boîte de Pétri f non couchéou cette étape (voir le tableau des matériaux). Ne pas utiliser une boîte de culture de tissu ou toute autre surface qui favorise l'adhésion cellulaire. EB devraient rester en suspension dans les médias avant d'être prêt à plaquer comme décrit dans la section 6.
    2. Enlever 10 cm boîtes de pétri de l'incubateur et la placer dans la hotte stérile de culture tissulaire. Retirez délicatement le couvercle avec EBS et incliner à un angle de 45 degrés.
    3. En utilisant une pipette sérologique de 5 ml contenant 3 ml de milieu RT EB, lavez doucement EBs dans une piscine au fond du couvercle. Inspectez soigneusement le couvercle pour EB qui sont collées à la surface et re-rinçage si nécessaire.
    4. Après avoir lavé tout EBs transfert à une boîte de Pétri de 6 cm.
    5. Répétez les étapes 5.3.2) -5.3.4) pour tous les ballasts électroniques. Chaque boîte de Pétri de 6 cm doit contenir EBs de deux 10 cm couvercles. Placez tous les plats de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C pendant deux jours.
      NOTE: EB qui sont trop rapprochées en suspension peuvent rester ensemble et former de grands agrégats. Cela peut avoir un impact négatif sur l'efficacité de la différenciation cardiaqueainsi que de réduire de manière significative le nombre de disponibles EB. Pour éviter l'agrégation, EB doit être vérifié chaque jour et séparé en déplaçant doucement d'avant en arrière, puis côté à l'autre. L'utilisation de plats bactériens dans les étapes précoces de différenciation est nécessaire pour empêcher la fixation EB au plat et laisser EBs de croître en suspension.

6. Placage et le traitement des EBs Avec Grem2

  1. Préparer le milieu de traitement Grem2 en ajoutant un volume suffisant de stock (0,5 pg / pl) Grem2 à moyenne RT EB pour une dilution finale de 1-5 pg / ml.
    REMARQUE: La concentration efficace pour le traitement des ballasts électroniques varie en fonction de la lignée cellulaire et l'activité spécifique du lot actuel de Grem2. Il est recommandé que, avant d'utiliser la dose est titré pour trouver une efficacité maximale. Pour la ligne CGR8 MESC nous utilisons régulièrement 3-5 pg / ml de Grem2. Les concentrations efficaces de Grem2 pour la production d'myocytes auriculaire va produire des cellules adjudicatrices rapidement entrejours 7-8 qui sont répandues dans chaque puits. Si contractant phénotype est pas observée dans les cultures traitées, il est recommandé que la dose soit Grem2 titrée dans la fourchette indiquée.
  2. Préparer des plaques à 6 puits de culture tissulaire en aspirant la solution de revêtement de gélatine dans chaque puits et en ajoutant 2 ml de milieu de RT Grem2 traitement. Retirer EB de l'incubateur et le placer dans la hotte stérile de culture tissulaire.
  3. L'utilisation d'un P1000 réglé à 100 pi de transfert 30 à partir de 6 cm EBs Pétri plats à chaque puits. La place dans EBs incubateur et disperser uniformément par doucement déplacer la plaque arrière vers l'avant, puis côté à l'autre.
    1. Après avoir attaché à EBs gélatine puits revêtus, remplacer les médias Grem2 tous les deux jours jusqu'au jour 10. Après 10 jours, interrompre le traitement Grem2 et ajouter des médias EB frais tous les deux jours pour maintenir les cellules saines.
      NOTE: Après avoir fixé, EbS aplatir le long de la surface de la plaque revêtue.

7. Cellule Dissociation pour RT-qPCR Analysis

  1. Cellule Dissociation avec trypsine-EDTA
    1. Aspirer le milieu de chaque puits et rincer deux fois avec 1 ml par puits de DPBS stérile moins Ca 2+ et Mg 2+.
    2. Ajouter 0,5 ml de 0,25% de solution de trypsine-EDTA stérile pour chaque puits à partir de laquelle les cellules seront recueillies.
    3. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min.
    4. Après 5 min cellules de contrôle pour la dissociation. Si les cellules restent encore attachés au fond du robinet bien doucement pour desserrer. Si taraudage ne se desserre pas les cellules, placer de nouveau dans l'incubateur et de surveiller toutes les 2 min jusqu'à ce que les cellules sont complètement détachés.
    5. Neutraliser solution trypsine-EDTA en ajoutant 0,5 ml de milieu EB à chaque puits.
    6. Transférer l'intégralité de 1 ml de suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml de micro-ondes.
    7. cellules à granules par filage dans une centrifugeuse de table pendant 5 min à 300 x g.
    8. Aspirer le milieu de culot et passer à la lyse immédiatement ou conserver culot à -70 ° C jusqu'au moment de la lyse. Long term stockage des pellets est déconseillée car cela peut conduire à la dégradation de l'ARN.
  2. Lyse des cellules et analyse moléculaire
    1. A ce stade, les cellules sont prêtes pour l'isolement d'ARN en utilisant un kit d'extraction sur colonne en utilisant un réactif commercial ou d'extraction d'ARN selon les protocoles fournis par le fabricant (voir le tableau des matériaux). Une fois isolé, inverser l' ARN transcrit et utiliser ADNc pour une analyse par RT-qPCR en utilisant des techniques standard de 20, 21.
      NOTE: Amorces utilisées par ce laboratoire pour RT-qPCR sont énumérés dans le tableau 1. identité atriale est confirmée en utilisant une combinaison de RT-qPCR à regarder l'expression de gènes auriculaires et ventriculaires et l'électrophysiologie à l'action record durée du potentiel (voir la section 8). Une sélection de gènes est inclus dans ce protocole, par exemple, des marqueurs fiables auriculaire et ventriculaire. De plus amples informations à propos de l' oreillette et l' expression du gène ventriculaire dans le contexte de la différenciation des cellules souches pluripotentes se trouve dans la référence 14.

8. Analyse électrophysiologique

  1. Dissociation cellulaire avec de la collagénase
    1. Aspirer le milieu de chaque puits et rincer deux fois avec 1 ml par puits de PBS stérile.
    2. Ajouter 0,5 ml de 1 mg / ml de solution de collagénase à chaque puits.
    3. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 10 min.
    4. Après 5 min cellules de contrôle pour la dissociation. Si les cellules encore restent attachées les unes aux autres ou le fond du robinet de bien doucement pour desserrer. De plus dissocier les cellules par trituration douce avec un P1000.
      NOTE: Pour faciliter brassage des cellules enregistrements de serrage doit être trituré jusqu'à ce qu'une suspension à cellule unique est obtenue.
    5. Ajouter 0,5 ml de milieu EB chaque puits et mélanger par pipetage.
    6. Transférer l'intégralité de 1 ml de suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml de micro-ondes.
    7. cellules à granules par filage dans une centrifugeuse de table pendant 5 min à 300 x g.
    8. Aspirer le milieu de culots cellulaires.
    9. cellules dans 500 Re-suspendreul de PBS avec 10% de FBS, en étant sûr de triturer dans une suspension cellulaire unique.
  2. Caractérisation électrophysiologique.
    NOTE: Beaucoup d'excellents protocoles ont été publiés dans cette revue sur l'utilisation unique patch clamp de la cellule pour mesurer les potentiels de membrane cellulaire. Pour des informations détaillées sur la façon d'effectuer patch cellule unique pince le lecteur novice est fait référence à ces protocoles 21-24. Ce qui suit contient des informations spécifiques pour ce protocole qui aidera le électrophysiologue expérimenté préparer et gérer MESC dérivé CMs pour le sous-type de caractérisation.
    1. Préparer une solution d'enregistrement intracellulaire constitué des éléments suivants: 10 mM de tampon HEPES 5 mM MgATP, 2 mM d'EGTA, 110 mM de glutamate de potassium, 10 mM de KCl et 10 mM de NaCl. Ajuster la solution à un pH de 7,2 en utilisant du NaOH.
    2. Préparer l' enregistrement extracellulaire (bain) en solution composée comme suit: 2 mM de HEPES, 10 mM de glucose, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 5,4 mM de KCl et 137MM de NaCl. Ajuster la solution à un pH de 7,4 en utilisant du NaOH.
    3. Préparer une pipette en verre qui mesure 2-5 résistance à la MQ lorsque remblayé avec une solution d'enregistrement en utilisant le verre borosilicate standard avec filament.
    4. Transfert 100 ul de cellules en suspension dans la chambre d'enregistrement contenant une solution d'enregistrement extracellulaire en utilisant un P200.
      REMARQUE: Les cellules peuvent être corrigées en suspension ou, pour faciliter la manipulation et l'utilisation pour le traitement médicamenteux et / ou des essais de perfusion, peut être ensemencé sur une lamelle de gélatine appliquée comme indiqué dans 8.2.5).
    5. Préparer la gélatine revêtu des lamelles de verre en plaçant un diamètre lamelle de verre de 10 mm dans chaque puits d'une plaque à 6 puits et couvrant avec une solution de gélatine comme décrit dans la section 3.1) de ce protocole.
      1. Après solution aspirée de gélatine au moins 30 minutes et ajouter 100 pi de cellules en suspension directement à lamelle et placer toute la plaque de 6 puits dans l'incubateur pendant au moins 2 heures ou jusqu'à ce que les cellules ont attaché. Après que les cellules ont attaché, remove lamelle et place dans la chambre d'enregistrement avec une solution d'enregistrement extracellulaire.
        NOTE: Si vous utilisez la ligne de MESC reporter cardiaque fluorescent αMHC-DsRed, CMs peuvent être identifiés par leurs noyaux fluorescents rouges. Si ne pas utiliser une ligne de journaliste cardiaque, les cellules adjudicatrices spontanément peuvent être observés et isolés pour les mesures. les cellules souches pluripotentes dérivées CMs sont généralement plus petites et plus arrondi, manquant la morphologie rectangulaire caractéristique des myocytes cardiaques adultes complètement formé.
    6. Faire tous les enregistrements à 37 ° C. Le patch clamp en utilisant des cellules individuelles de cellules entières en mode courant-clamp avec une pipette en verre de borosilicate de résistance à 05/02 MQ. Utiliser une pression négative douce pour atteindre joint gigaohm avant d'obtenir l'accès à cellules entières. Appliquer une pression négative rapide à la rupture membrane et avoir accès cellule entière avant l'enregistrement des potentiels de membrane.
    7. Évocation potentiels d'action à l'aide de 4 msec dépolarisants injections de courant.
      REMARQUE:Pour CMs PSC dérivé la quantité de courant nécessaire pour déclencher de façon reproductible des potentiels d'action peuvent varier. Afin de trouver courant optimal de seuil, commencer à une relativement faible amplitude du courant actuel et augmentation de déclenchement de manière progressive jusqu'à ce que les potentiels d'action reproductibles sont obtenus.
      NOTE: Action durées possibles pour myocytes auriculaires Grem2 induites sont habituellement dans la gamme de 20-40 ms et manquent une phase de plateau (figure 6B).

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Résultats

Avant la différenciation, les cellules souches pluripotentes doivent être compact et sans différenciation spontanée. Les cellules représentées sur la figure 1A sont prêts à être utilisés singularisé et pour accrocher des gouttes , comme décrit dans la section 5.1 du protocole. Les cellules représentées sur la figure 1B sont spontanément différenciation et ne doivent pas être utilisés pour la préparation des gouttes suspendues.

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Discussion

Ce protocole produit régulièrement des cultures avec un pourcentage élevé de CMs qui sont caractéristiques de la lignée auriculaire. Comme avec n'importe quel protocole de différenciation, la qualité des mESCs avant la différenciation méritent une attention particulière. mESCs doivent être surveillés régulièrement pour la morphologie correcte (figure 1A). Toute différenciation spontanée qui se produit avant la formation de EbS limiter sévèrement l'efficacité des cardiogenèse et doit être enlevé ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs de ce manuscrit n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le NIH subventions HL083958 et HL100398 (AKH) et 2T32HL007411-33 "Programme en cardiovasculaires Mécanismes: Formation en Investigation" (JB).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
GMEMLife Technologies11710
FBSLife Technologies10082
GlutamaxLife Technologies35050
LIFEMD MilliporeESG1107
ß ;-MercaptoethanolSigmaM3148
IMDMSigmaI3390
Acides aminés non essentielsSigmaM7145
10 cm Plaques de culture tissulaireSarstedt83.3902
10 cm Boîtes de Pétri bactériennesVWR25384-342
6 cm Boîtes de Pétri bactériennesVWR25384-092
Plaques de culture tissulaire 6 puitsSarstedt83.3920
Gremlin 2 protéine recombinanteR& ampère; D Systems2069-PR-050
Unités de filtration stérilesThermo Fisher09-741-02
Gélatine (à partir de peau de porc)SigmaG1890
10X PBS, StérileSigmaP5493
BSA  ;Sigma5470
0,05 % Trypsine-EDTA solutionLife Technologies25300054
DPBS, sans calcium, sans magnésiumLife Technologies14200

Références

  1. Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
  2. Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
  3. Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  4. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  5. Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
  6. Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  8. Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
  9. Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734(2011).
  10. Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
  11. Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  12. Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  13. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  14. Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
  15. Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  16. Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
  17. Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
  18. Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804(2009).
  19. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
  22. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  23. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  24. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  25. Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
  26. Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
  27. Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
  28. Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  29. Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
  30. Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).

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