Article de méthode

Identification de MyoD Interactome Utilisation Tandem Affinity Purification couplée à la spectrométrie de masse

DOI :

10.3791/53924

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17 mai 2016

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1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

Dans cet article

Résumé

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MyoD est un facteur de transcription myogénique avec une forte capacité à induire la transdifférenciation myogénique de nombreuses lignées cellulaires non musculaires entièrement différenciées. Les mécanismes épigénétiques impliqués dans cette transdifférenciation sont largement inconnus. Nous décrivons ici une méthode de purification à double affinité suivie d’une spectrométrie de masse pour caractériser de manière exhaustive les partenaires MyoD.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

différenciation terminale du muscle squelettique commence par l'engagement des cellules précurseurs mésodermiques pluripotentes à myoblastes. Ces cellules ont encore la capacité de proliférer ou ils peuvent se différencier et fusionnent en myotubes multinucléés, qui maturate encore pour former des myofibres. différenciation terminale du muscle squelettique est orchestré par l'action coordonnée des différents facteurs de transcription, en particulier les membres des facteurs ou des CTMR réglementaires musculaires (MyoD, Myogenin, Myf5 et MRF4), aussi appelé le bHLH myogéniques facteurs de transcription famille. Ces facteurs coopèrent avec des complexes de remodelage de la chromatine au sein complexe réseau de régulation transcriptionnelle pour atteindre myogenèse squelettique. En cela, MyoD est considéré comme le maître myogénique facteur de transcription dans le déclenchement de la différenciation terminale musculaire. Cette notion est renforcée par la possibilité de MyoD pour convertir les cellules non musculaires dans les cellules musculaires squelettiques. Nous décrivons ici une approche utilisée pour identifier MyoDpartenaires protéiques d'une manière exhaustive dans le but d'élucider les différents facteurs impliqués dans la différenciation terminale des muscles squelettiques. L'objectif à long terme est de comprendre les mécanismes épigénétiques impliqués dans la régulation des gènes du muscle squelettique, à savoir., Les cibles MyoD. Les partenaires MyoD sont identifiés à l'aide de purification d'affinité en tandem (TAP-Tag) à partir d'un système hétérologue couplée à la spectrométrie de masse (MS), la caractérisation, suivie de la validation du rôle des partenaires appropriés au cours de la différenciation terminale du muscle squelettique. des formes aberrantes de facteurs myogènes, ou leur régulation aberrante, sont associés à un certain nombre de troubles musculaires: myasthénie congénitale, la dystrophie myotonique, le rhabdomyosarcome et les défauts dans la régénération musculaire. En tant que tel, les facteurs myogéniques constituent un bassin de cibles thérapeutiques potentielles dans les troubles musculaires, à la fois en ce qui concerne les mécanismes qui causent la maladie elle-même et des mécanismes de régénération qui peut améliorer le traitement de la maladie. Ainsi, la understan détailléeding des interactions intermoléculaires et les programmes génétiques contrôlés par les facteurs myogéniques est essentiel pour la conception rationnelle de thérapies efficaces.

Introduction

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organismes multicellulaires eucaryotes sont composés de différents organes et tissus. Chaque tissu fonctionnel présente un motif d'expression de gène spécifique qui est déterminé à chaque étape de la différenciation. la différenciation cellulaire implique l'activation de gènes spécifiques, l'entretien de leur expression et, en général, réduisant au silence d'un ensemble de gènes tels ceux impliqués dans la prolifération cellulaire. la différenciation des muscles squelettiques, ou la myogenèse est donc un procédé à plusieurs étapes, qui commence par la détermination des cellules souches mésodermiques en myoblastes, puis conduit à la différenciation terminale des myoblastes en premier mononuclées, puis multi nucléées, les myotubes . Ainsi, les myoblastes sont "déterminés" cellules, qui sont encore capables de proliférer, mais ils se sont engagés à la lignée du muscle squelettique, et peut donc se différencier uniquement dans les cellules musculaires squelettiques, soit au cours du développement embryonnaire ou chez les adultes la régénération musculaire. Le processus de terminal de muscle squelettique diffèrentciation est orchestrée par un programme génétique spécifique qui commence par la sortie définitive du cycle des cellules précurseurs de cellules de myoblastes qui conduit à une extinction définitive de la prolifération des gènes associés, tels que E2F gènes cibles 1. En effet, au cours du processus de différenciation terminale, myoblastes prolifération arrestation est une étape cruciale qui précède l'expression de gènes spécifiques du muscle squelettique et la fusion des myoblastes en myotubes 2. Un tel programme permet à des cellules souches musculaires adultes, également appelées cellules satellites, pour différencier au cours du processus de régénération suite à une lésion du muscle squelettique.

Myogenesis Mammalian dépend de manière critique sur une famille de l' hélice-boucle-hélice basique myogénique (bHLH) facteurs de transcription MyoD, Myf5, MRF4 et Myogenin, souvent appelé la famille de squelette facteurs de détermination musculaire ou MRF (Facteurs réglementaires musculaires) 3. Chacun d'eux joue un rôle essentiel dans la spécification et difrenciation des cellules musculaires squelettiques et a un motif d'expression spécifique 4 5-7. L'activation de MyoD et Myf5 constitue l'étape déterminante qui engage les cellules de la lignée myogénique, et l'expression subséquente de Myogenin déclenche myogenèse avec l'activation de gènes spécifiques du muscle squelettique, comme MCK (Muscle Creatine Kinase). Les facteurs de transcription bHLH myogéniques coopèrent avec les membres de la famille MEF2 dans l'activation des gènes musculaires de loci silencieux 8 précédemment. Elles stimulent également la transcription du gène du squelette musculaire hétérodimères avec des protéines bHLH omniprésentes, E12 et E47, appelées protéines qui se lient à E, que l' on appelle E-boîtes dans les différentes régions des gènes de régulation 8. Twist, Id (inhibiteur de la différenciation) et d' autres facteurs à réguler négativement ce processus, en compétition avec MyoD pour E protéines de liaison 8.

MyoD est considéré comme l'acteur majeur dans le déclenchement de la différenciation terminale musculaire 9 car il a la capacité d'induire une détermination myogénique / différenciation (trans-différenciation) programme dans de nombreux systèmes non-musculaires complètement différenciées 10-13. En effet, l' expression forcée de MyoD induit la trans-différenciation des différents types cellulaires , même ceux provenant d' une autre origine embryologique 12. Par exemple, MyoD peut convertir les hépatocytes, les fibroblastes, les mélanocytes, les neuroblastes et les adipocytes en cellules musculaires analogue. L'action trans-différenciation de MyoD implique une activation anormale du programme génétique myogénique (notamment ses gènes cibles) dans un environnement non-musculaire, concomitante à la réduction au silence du programme génétique d'origine (notamment, les gènes de prolifération).

Dans la prolifération des myoblastes, MyoD est exprimé , mais est incapable d'activer ses gènes cibles , même quand il se lie à leurs promoteurs 14-16. Par conséquent, l'exigence de MyoD soient exprimées en continu dans des myoblastes non différenciés reste assez elusive. MyoD pouvait réprimer ses gènes cibles en raison de recrutement d'enzymes de chromatine modifiant répressives dans la prolifération des myoblastes avant le chargement d'activer remodelage de la chromatine enzymes 14,17. Par exemple, dans la prolifération des myoblastes, MyoD est associée avec le co-répresseur de la transcription KAP-1, histone désacétylases (HDAC) et les méthyltransférases de la lysine répressive (Kmts), dont l'histone H3 lysine 9 ou H3K9 et H3K27 Kmts et suppriment activement l'expression des gènes cibles en établissant une structure chromatine localement répressive 14,17. Surtout, un rapport récent a indiqué que MyoD est lui - même directement méthylé par le H3K9 KMT G9a entraînant l'inhibition de son activité de transactivation 16.

Les mécanismes épigénétiques impliqués dans cette trans-différenciation des cellules non musculaires par MyoD sont largement inconnues. Notamment, certaines lignées cellulaires sont résistantes à l'induit MyoD-trans-différenciation. Ainsi, dans les cellules HeLa, MyoD est inactif oumême pourrait fonctionner comme répresseur plutôt que activateur de la transcription en raison du manque d'expression de la sous - unité BAF60C du remodelage de la chromatine complexe SWI / SNF 18. Ce modèle peut donc être de choix pour mieux caractériser les mécanismes de répression génique induite par MyoD. Il est également approprié pour tester la capacité de MyoD pour induire l' environnement de la chromatine répressive à sa loci cible avec ses partenaires associés et donc découvrir les mécanismes répressifs MyoD-dépendants dans la prolifération des myoblastes pour affiner la différenciation terminale.

Nous décrivons ici le protocole pour l'identification des partenaires MyoD en utilisant Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) couplée à la spectrométrie de masse (MS) la caractérisation. L'utilisation de cellules HeLa exprimant de manière stable S3 Flag-HA MyoD permis d'obtenir suffisamment de matériel pour purifier les complexes de MyoD à partir d'extraits nucléaires fractionnées. L'identification des partenaires de MyoD dans le système hétérologue a été suivie par validatidans un système pertinent.

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Protocole

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1. Préparation des Fractions HeLa-S3 nucléaire Salt-extractibles et chromatine-liés

  1. La collecte des cellules
    1. Cultiver les cellules HeLa-S3 Flag-HA-MyoD et HeLa-S3 Flag-HA (lignée cellulaire témoin) dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine (croissance milieu) à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur humide.
      Remarque: les cellules HeLa-S3 exprimant de manière stable les cellules transduites avec le vecteur vide (HeLa-S3 Flag-HA) Drapeau-HA-MyoD et HeLa-S3 pourraient être soit mis en place en utilisant le protocole décrit dans: 19,20, ou fournis par les auteurs.
    2. Amplifier les cellules jusqu'à 10 complètement confluentes de 150 mm plats de chaque lignée cellulaire HeLa-S3 (Flag-HA-MyoD et HeLa-S3 Flag-HA cellules).
    3. Recueillir le surnageant (contiennent sous-population non-adhérent) dans 5 L spinner.
    4. Laver la sous-population adhérente avec 10 ml de PBS par 150 mm plat, trypsiniser cellules pendant 1 min à temtempérature (solution de trypsine-EDTA à 0,05%, 2 ml pour une boîte de 15 cm).
    5. Ajouter 4 ml du milieu par 150 mm plat et de recueillir les cellules dans 50 ml tubes.
    6. Combinez le surnageant de l'étape 1.1.3 (dans le 5 L spinner) et les cellules de l'étape 1.1.5, ajouter 500 ml de milieu de croissance préchauffé frais pour chaque lignée cellulaire.
    7. Transférer la suspension cellulaire dans 5 L centrifugeuse et faire croître les cellules pendant au moins 60 heures à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur humide.
    8. Ajouter 500 ml de milieu de croissance frais et faire croître les cellules pendant 24 heures.
    9. Ajouter 1 L de milieu de croissance frais et faire croître les cellules pendant 24 heures.
    10. Sortez 1 ml de la suspension cellulaire pour compter les cellules et vérifier la viabilité des cellules. Couleur 30 pl de suspension cellulaire avec 30 ul de 0,4% de bleu trypan et compter les cellules vivantes (non bleus) au microscope en utilisant hémocytomètre.
    11. Gardez la densité cellulaire à 2 - 6 x 10 5 cellules / ml en ajoutant du milieu de croissance frais tous les jours; ne dépasse pas 1 x 10 6 cellules / ml. Le maximumvolume pour un 5 L spinner est de 2,5 L.
      Remarque: Pour les étapes suivantes, procéder par lots de 2 à 2,5 L de la culture à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml. Répétez les étapes 1.1.12 - 1.1.14 pour recueillir environ 20 L (≈ 20 g de granulés de bois sec) de chaque lignée cellulaire avant de passer à l'étape suivante.
    12. cellules à pellets par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
    13. Resuspendre les cellules dans 100 ml de PBS glacé par pipetage et centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C et laver le culot.
    14. Répétez le lavage en remettant en suspension les cellules avec 25 ml de PBS glacé, transfert de la suspension dans 50 ml tube et centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C.
      Nota: Les culots cellulaires peuvent être soit utilisées immédiatement ou congelées dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C pendant plusieurs jours.
  2. L'isolement des noyaux
    Remarque: Effectuer les étapes 1.2.1 - 1.4.3 dans la chambre froide.
    1. Pré-froid buffers et homogénéisateurs.
    2. En cas d'utilisation de matériel congelé, décongeler rapidement les culots cellulaires dans un bain d'eau à 37 ° C.
    3. Remettre en suspension 20 g (≈ 20 ml) de cellules dans 20 ml (un volume égal à la taille du culot cellulaire) du tampon hypotonique A (Tableau 3) à l'aide de 10 ml du tampon au début, puis en ajoutant 5 ml, puis en ajoutant encore 5 ml. Laver les pipettes bien avec un tampon frais pour obtenir le maximum de cellules.
    4. Transfert de 40 ml de suspension cellulaire dans le homogénéisateur pré-réfrigéré avec un pilon hermétique.
    5. Homogénéiser les cellules avec 20 coups dans un homogénéiseur (20 et des mouvements) et à transférer la suspension cellulaire dans 50 ml tube.
    6. Laver le homogénéisateur avec 7 ml de tampon de saccharose (1/3 du volume initial de cellules, le tableau 3) pour récupérer le maximum de cellules. Transférer cette suspension rapidement dans le tube de 50 ml à l'étape 1.2.5 pour préserver les noyaux et limiter les fuites.
    7. Colorer une aliquote de 30 pi par 30 pi de 0,4% trYPAN bleu, analyser au microscope pour contrôler l'efficacité de lyse (si la lyse est réussie, tous les noyaux doivent être bleu). Si nécessaire, répétez l'étape d'homogénéisation.
    8. Centrifuger pendant 7 min à 10 000 x g et 4 ° C pour sédimenter les noyaux. Enregistrez le surnageant comme la fraction cytoplasmique.
  3. Préparation de Salt-extractible (SE) Fraction nucléaire
    1. Remettre en suspension le culot de noyaux dans 8 ml de tampon de saccharose (un volume égal à la taille de la pastille de noyaux). Ajouter goutte à goutte tout en mélangeant soigneusement dans un vortex 8 ml de tampon à forte concentration saline (1 volume de culot de noyaux, le tableau 3) pour obtenir une concentration finale de 300 mM de NaCl. Incuber pendant 30 min sur la glace et mélanger toutes les 5 min.
    2. Diminuer la concentration de NaCl à 150 mM par addition de 8 ml (1/3 du volume total) de tampon de saccharose. Centrifugeuse pendant 10 min à 13 000 xg et 4 ° C. Recueillir le surnageant (fraction de sel extractibles nucléaire, SE).
      Remarque: Soit passer à l'étape 1.3.3 ou quitter la SEfraction sur la glace lors de la préparation de la fraction de la chromatine liée et ultra-centrifuge les deux fractions simultanément.
    3. Ultra-centrifuge SE pendant 30 minutes à 85.000 xg à 4 ° C. Prenez surnageant (≈ 26 ml).
    4. Congeler 100 aliquote ul dans de l'azote liquide. Passez à l'étape 2 "Purification des protéines complexes", en utilisant le reste de l'extrait.
      Remarque: L'aliquote est utilisée comme commande d'entrée lors de l'étape 5.1.1.
  4. Préparation de la fraction de la chromatine liée
    1. Remettre en suspension le culot (étape 1.3.5). Méticuleusement dans 7 ml (un volume égal à la taille de la pastille) d'un tampon de saccharose.
    2. Ajouter CaCl 2 à une concentration finale de 1 mM (28 pi de 0,5 M de CaCl2 pour 14 ml de suspension) pour activer la MNase (étape 1.4.4) et mélanger.
    3. suspension Préchauffer pendant 1 min à 37 ° C.
    4. Ajouter 70 ul nucléase micrococcique (MNase) pour obtenir une concentration finale de 0,0025 U / pl (1/200 dilution de 0,5U / ul stock) et mélanger.
    5. Incuber exactement 12 min à 37 ° C. Mélanger toutes les 4 min.
    6. Placer immédiatement la réaction sur la glace.
    7. Pour arrêter l'activité MNase, ajouter 112 ul d'EDTA 0,5 M pH 8,0 (1/125 dilution) à une concentration finale de 4 mM. Incuber pendant 5 min sur la glace.
    8. Soniquez 5 fois pendant 1 min à haute amplitude, entre deux sonications permettent une pause de 1 min (10 min au total).
    9. Ultracentrifugeuse pendant 30 minutes à 85.000 xg et 4 ° C.
    10. Recueillir le surnageant (nucléosome fraction enrichie, NE, ≈ 12 ml).
    11. Congeler 50 aliquote ul dans de l'azote liquide. Passez à l'étape 2 "Purification des protéines complexes", en utilisant le reste de l'extrait.
      Remarque: L'aliquote est utilisée comme commande d'entrée lors de l'étape 5.1.1.

2. Protein Purification Complexes

Remarque: Procéder dans des extraits parallèles de chaque lignée cellulaire (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD et le contrôle, Hela-S3 Flag-HA).

  1. Une purification à base FLAG
    1. Pré-lavage de résine Flag. Utilisez 600 pi de résine de drapeau (de la publicité 50% actions) pour chaque point expérimental (SE et NE fractions pour chaque lignée cellulaire).
    2. Résine de transfert en tube de 15 ml, remettre en suspension dans 13 ml de tegn froid (tableau 3), centrifuger pendant 2 min à 1000 xg et retirer le surnageant. Répétez 5 fois. Après que la résine resuspendre Flag dernier lavage dans un volume égal de tegn (300 pi pour chaque point expérimental).
    3. Pour chaque point expérimental, mélanger 600 pi de résine Drapeau lavé et les extraits de protéines correspondantes (dans un tube de 15 ml pour 12 ml NE et dans un tube de 50 ml pour les 26 ml SE fractions, respectivement). Incuber sur une nuit de roue tournante à 4 ° C.
    4. Centrifugeuse pendant 2 min à 1000 xg à 4 ° C, mettre de côté le surnageant et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que le résultat du test d'efficacité de purification (2.2).
    5. Pour les échantillons SE, resuspendre la résine Flagdans 4 ml de tegn et le transfert à un tube de 15 ml. Répéter cette étape 3 fois, à chaque fois que le transfert dans le même tube de 15 ml pour éviter la perte des billes. Centrifugeuse 2 min à 1000 xg et 4 ° C et retirer le surnageant.
    6. résine Flag Wash 7 fois dans un tube de 15 ml en utilisant 13 ml de tegn et centrifuger 2 min à 1000 xg et 4 ° C.
    7. Après le dernier lavage, remettre en suspension dans 1 ml tegn et transfert dans un tube de 1,5 ml à faible liaison. Centrifugeuse 2 min à 1000 xg et 4 ° C et retirer le surnageant.
    8. Remettre en suspension dans 200 pi de solution de peptide FLAG à 4 mg / ml à un pH de 7,8 pour chaque point expérimental. Mélanger les billes et le peptide. Ajouter 200 pi de tampon tegn et incuber à 4 ° C pendant au moins 4 heures ou toute la nuit pour éluer les protéines liées.
    9. Centrifuger pendant 2 min à 1000 xg à 4 ° C et transférer la résine et le surnageant (Flag éluat) à une colonne de centrifugation vide placé dans un tube de 2 ml.
    10. Centrifugeuse la colonne, recueillir les restes de surnageant dans le tube de 2 ml.
    11. Recueillir la résine de Flag en ajoutant un tampon tegn à la colonne et passer à la deuxième élution de drapeau avec 200 pi de solution de peptide Flag (4 mg / ml) pendant une nuit à 4 ° C pour chaque point expérimental.
    12. Répétez les étapes 2.1.9 - 2.1.10 pour recueillir deuxième élution. Combiner les première et seconde éluats.
  2. Test d'efficacité de la purification
    Remarque: Lors de l'étape 2.1.11 - 2.1.12, effectuer SDS-PAGE et coloration à l'argent (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Prenez 15 pi des éluats, ajouter 5 pl de tampon 4x de chargement et 2 pi de 10x agent réducteur, faire bouillir pendant 5 min à 96 ° C et exécuter un SDS-polyacrylamide 4 - gel à 12% selon les instructions du fabricant.
    2. Colorer le gel en utilisant le kit de coloration à l'argent (suivre les instructions du fabricant). S'il y a des différences claires dans les modèles de protéines entre Flag-HA-MyoD et Flag-HA éluats simulacres, en particulier la bande de Flag-HA MyoD (environ 50 kDa, la figure 1A), procéder à la prochaine step.
  3. Hémagglutinine (HA) de purification à base de
    1. résine Wash HA en transférant en tube de 15 ml, remise en suspension dans 13 ml de tegn et centrifuger 2 min à 1000 xg à 4 ° C. Répéter l'étape de lavage 5 fois. Après le dernier lavage des perles de remettre en suspension dans un volume égal de tampon tegn.
      Remarque: Le volume doit être ajusté en fonction de l'efficacité de la purification à base de drapeau. Commencez avec 300 pi du commerce 50% actions pour chaque point expérimental.
    2. Transfert de résine HA pour chaque point expérimental dans un faible tube de liaison de 1,5 ml. Centrifuger 2 min à 1000 x g à 4 ° C, d' éliminer le maximum du tampon de lavage (tableau 3) et d' ajouter les éluats provenant de la purification à base d' un drapeau à la résine HA.
    3. Incuber les tubes sur la nuit de la roue tournant à 4 ° C.
    4. Centrifugeuse pendant 2 min à 1000 xg à 4 ° C, mettre de côté le surnageant et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que le résultat du test d'efficacité de purification (2.3.12.).
    5. Résuspendre la résine HA dans 0,5 ml de tegn, transfert à un nouveau 1,5 ml tube de liaison faible. Répéter une fois la remise en suspension en ajoutant dans le même tube de 1,5 ml pour éviter de perdre des billes et centrifuger 2 min à 1000 x g et 4 ° C. Retirer le surnageant.
    6. Laver les billes 8 fois en utilisant 1 ml de tegn à chaque fois, centrifuger 2 min à 1000 x g et 4 ° C et en éliminant le surnageant (pour éviter de perdre des billes). Après le dernier lavage, transférer les billes dans 0,5 ml tubes.
    7. Retirez autant surnageant que possible. Ajouter 100 ul de solution de peptide HA libre (4 mg / ml) à pH 7,8 sur des billes pour éluer les protéines liées. Incuber sur la roue en rotation pendant une nuit à 4 ° C.
      Remarque: La quantité de HA-peptide doit être ajustée en fonction de l'abondance des complexes.
    8. Centrifuger pendant 2 min à 1000 xg à 4 ° C et transférer la résine et le surnageant (HA éluat) à une colonne de centrifugation vide placé dans un tube de 2 ml.
    9. Centrifuger la colonne pour recueillir les restes de surnageant dans le tube de 2 ml.
    10. Effectuer une deuxième élution avec 100 ul de peptide HA (4 mg / ml) pour chaque point expérimental. Incuber sur la roue en rotation pendant une nuit à 4 ° C. Répétez l'étape 2.3.8 - 2.3.9 pour recueillir deuxième élution.
    11. Combiner les première et seconde éluats.
    12. Test d' efficacité de purification par SDS-PAGE et coloration à l'argent (voir les étapes 2.2.) (Figure 1A).
    13. Concentrer le éluat HA 30 ul en utilisant des unités de filtration centrifuge avec un (limite nominale de poids moléculaire, PMNL) 10 kDa coupure selon les instructions du fabricant.
    14. Diviser les échantillons concentrés en deux parties: 22,5 (3/4) et 7,5 (1/4) ul. Snap geler 1/4 des échantillons dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C. Utilisez la partie 3/4 pour l'étape 3.
      Remarque: La partie gelée 1/4 doit être utilisé pour la confirmation des résultats de spectrométrie de masse par western blot (voir étape 5.1).

3. Analyse de spectrométrie de masse

Remarque: Les étapes suivantes devraient être discutées avec l'installation de spectrométrie de masse qui effectuera l'analyse.

  1. Supplément 3/4 (22,5 pi) des échantillons avec 7,5 pi de tampon de chargement 4x et 3,3 pi de 10x agent réducteur et faire bouillir pendant 5 min à 96 ° C.
  2. Charger les échantillons sur un SDS-polyacrylamide 4 - gel à 12%. gel Exécutez à 150 V constante pendant 5 minutes pour permettre à tous les protéines d'entrer dans le gel sans séparation.
  3. Laver le gel avec de l'eau; fixer pour 20 - 30 min avec une solution de fixateur (acide acétique à 10%, 50% de methanol, 40% d'eau ultra-propre) puis laver le gel fixe 5 fois dans l'eau ultra-propre.
  4. Couper les bandes contenant les protéines, stocker dans 1 ml d'eau dans un tube de 1,5 ml et l'envoyer à l'installation de la spectrométrie de masse.

Analyse 4. Données

Note: Ceci est une orientation générale pour l'analyse. Les étapes exactes dépendent du mode particulier des données fournies par MS installationutilisé pour effectuer l'analyse (par exemple, 21,22).

  1. Comparez la liste des protéines identifiées dans les éluats "de MyoD" avec la liste obtenue à partir de la préparation de contrôle négatif correspondant. Exclure de l'analyse les protéines présentes dans les deux listes.
  2. Retirer des protéines qui ont ≤2 nombre total de peptides identifiés à partir restants liste.
  3. Accès annotation fonctionnelle et la classification fonctionnelle de la liste obtenue de protéines à l' aide de ressources DAVID Bioinformatique (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) et classer la liste des protéines 23,24.
  4. (Facultatif) Retirer de la liste «auto - stoppeurs», chargés des protéines non-nucléaires avec une forte adventice de liaison à l' ADN chargé négativement 25. Ceux - ci contiennent des protéines du cytosquelette, cytoplasmiques, mitochondriales, membrane et récepteurs (repliement des protéines, cytosquelette et diverses protéines de groupe dans les tableaux 1 et 2).
  5. Comparez les listes obtenues des interacteurs de MyoD de SE et NE fractions pour identifier des protéines et des protéines communes spécifiques pour chaque fraction (Figure 2).

5. Confirmation des Interactiens identifiées par Western Blot

  1. Confirmation dans HeLa-S3 Flag-HA-MyoD et HeLa-S3 Flag-HA
    1. échantillons d'éluat Décongeler obtenus à l'étape 2.3.14 (7,5 pi) sur la glace. Ajouter 12 pi de tampon tegn, 10 ul de tampon de chargement 4x et 3 pl de 10x agent réducteur. Faire bouillir les échantillons pendant 5 min à 96 ° C.
    2. Préparer des échantillons d'entrée pour le transfert de Western.
      1. Décongeler aliquotes des étapes 1.3.9 et 1.4.11 et mesurer la concentration de protéines, par exemple en utilisant le kit BCA (suivez les instructions du fabricant).
      2. Utilisez 15 ug de la protéine par voie. Mesurer la quantité appropriée de l'extrait et de régler le volume de l'échantillon jusqu'à 15 pi avec un tampon tegn.
      3. Ajouter un tampon de chargement 4x 5 pi et1,5 ul 10x agent réducteur. Faire bouillir les échantillons pendant 5 min à 96 ° C.
    3. Effectuer une analyse western blot avec des anticorps spécifiques d'intérêt (pour le candidat partenaire identifié lors de l'analyse MS) en utilisant 15 ul d'échantillons d'éluat. Utiliser des extraits d'entrée comme un contrôle des niveaux de protéines endogènes (Figure 3A).
  2. Confirmation dans le système cellulaire pertinent
    1. Préparation de l'extrait nucléaire total de myoblastes de souris C2C12.
      1. Cultiver les myoblastes de souris C2C12 dans du milieu DMEM additionné de 15% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur humide. Ne jamais dépasser 80% de confluence cellulaire pour maintenir les cellules en état prolifératif.
      2. Cultiver au moins deux 150 plats mm de C2C12 pour un point (un anticorps) de immunoprécipitation (IP). Aspirer le milieu, laver les cellules deux fois avec 10 ml de PBS.
      3. Grattez les cellules et de recueillir dans 15 ml tube. Centrifuge à 250 g pendant 5 min à 4 ° C. surnageant Jeter.
      4. Estimer le volume du culot cellulaire (cellule = V). Resuspendre doucement le culot dans 3 volumes V cellule hypotonique tampon B à perturber membrane cytoplasmique (tableau 3).
      5. Ajouter le volume de cellule V 0,44 x de 10% de NP-40 pour atteindre la concentration finale de 1% (v / v). Retourner doucement le tube plusieurs fois pour mélanger.
      6. Ajouter le volume de cellule V 0,89 x SR (tableau 3) pour préserver l'intégrité des noyaux. Retourner doucement le tube plusieurs fois pour homogénéiser la suspension, et centrifuger pendant 5 min à 2000 xg pour sédimenter les noyaux.
      7. Retirer le surnageant (fraction cytosolique). Estimer le volume des noyaux pellet (= V nuc). Resuspendre le culot de noyaux dans un volume V nuc de tampon saccharose.
      8. Ajouter goutte à goutte tout en mélangeant soigneusement dans un tourbillon d' un volume V de tampon nuc haute teneur en sel pour obtenir une concentration finale de 300 mM ,NaCl, et incuber pendant 30 minutes sur la glace. Mélanger toutes les 5 min.
      9. Ajouter un volume V nuc de tampon de saccharose (pour diminuer la concentration de NaCl à 150 mM) et du CaCl2 (concentration finale 1 mM). Mélanger.
      10. suspension Préchauffer pendant 1 min à 37 ° C, ajouter nucléase micrococcique pour obtenir finale de concentration 0,0025 U / pl (1/200 du stock de 0,5 U / ul). Mélanger.
      11. Incuber exactement 12 min à 37 ° C. Mélanger tous les 3 min.
      12. Placer immédiatement la réaction sur la glace et ajouter EDTA (concentration finale 4 mM) pour arrêter l'activité MNase. Incuber pendant 5 min sur la glace.
      13. Soniquez 5 fois pendant 0,5 min chacun à haute amplitude. Entre deux sonications, permettre une pause de 0,5 min (5 min au total).
      14. Ultra-centrifugeuse pendant 30 minutes à 85.000 xg et 4 ° C. Recueillir le surnageant (extrait nucléaire total).
      15. Mesurer la concentration en protéines de l'extrait nucléaire total, par exemple en utilisant le kit BCA (suivez les instructions du fabricant) et procéder immediately à l'étape 5.2.2.
    2. Immunoprécipitation (IP) de MyoD endogène.
      1. Pour pré-clair que les extraits, laver 10 pi de la protéine G des billes d'agarose pour chaque point IP.
        1. Transférer le volume nécessaire de la protéine G des billes d'agarose dans un tube de 1,5 ml, remettre en suspension dans 1,4 ml de tegn froid, centrifuger 2 min à 1800 xg et retirer le surnageant. Répétez 3 fois.
      2. Mélanger les perles pré-lavés protéine G agarose avec le volume approprié d'extrait nucléaire total. Utilisez 500 ug de protéines totales d'extrait nucléaire par point IP.
      3. Incuber sur une roue tournant à 4 ° C pendant 2 heures pour pré-nettoyer les extraits.
      4. Centrifugeuse pendant 5 min à 1800 xg à 4 ° C. Gardez surnageant.
      5. Mélanger 5 ug de MyoD Ab ou 5 ug de IgG de lapin avec 500 pg d'extraits nucléaires totaux pré-autorisé, dans 1,5 ml de faibles tubes de liaison. Ajouter tegn tampon jusqu'à 1 ml. Incuber sur une roue tournant à 4 ° C pendant la nuit.
        Remarque: Effectuer la fuite étapes lors de l'étape 5.2.2.3.
      6. Pré-lavage 7,5 ul de protéine A / G perles de stock solution par point IP.
        1. Transférer le volume nécessaire de billes dans un tube de 1,5 ml, des billes de remettre en suspension dans 1 ml de tegn et centrifuger à 1800 g à 4 ° C pendant 2 min. Retirer le surnageant. Répétez 3 fois.
      7. Protéines Resuspendre A / G perles dans 1,5 ml de solution de blocage (tableau 3) et incuber sur une roue en rotation pendant une nuit à 4 ° C.
      8. des extraits nucléaires totaux Centrifugeuse incubés avec Abs (étape 5.2.2.5) à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Gardez surnageant.
      9. Centrifugeuse bloqué la protéine A / G résine (étape 5.2.2.7) à 1.800 xg pendant 2 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de tampon tegn. Re-centrifugeuse à 1800 g pendant 2 min à 4 ° C pour laver le tampon de blocage.
      10. Resuspendre bloqué la protéine A / G résine dans 1 ml de tampon tegn et aliquote dans de nouveaux tubes de protéine de liaison faible pour obtenir 7,5 pi bloprotéines cked Une résine / G par point IP. Centrifuger à 1800 g à 4 ° C pendant 2 min et éliminer autant que possible le surnageant.
      11. Ajouter les extraits nucléaires totales incubées avec le Abs (ou contrôler IgG) à la résine A / G. Mélanger et incuber pendant 2 heures à la température ambiante (RT) sur une roue en rotation.
      12. Centrifugeuse suspension 1.800 xg à température ambiante pendant 2 min. Rejeter le surnageant, remettre en suspension dans 1 ml de tampon de lavage et de transfert de suspension dans de nouveaux tubes de liaison faible. Incuber à température ambiante sur une roue en rotation pendant 5 min.
      13. Centrifugeuse suspension à 1800 xg à température ambiante pendant 2 min, remettre en suspension dans 1 ml de tampon de lavage et incuber à température ambiante sur une roue en rotation pendant 5 min. Répétez 4 fois. Pour le dernier transfert de lavage dans un nouveau tube de liaison faible.
      14. Éliminer au maximum le surnageant. Ajouter 7 pi de tampon de lavage, 7 pi de tampon 4x de chargement et 3 pi de 10x agent réducteur pour les perles, mélanger et faire bouillir pendant 5 min à 96 ° C.
      15. Effectuer une analyse de western blot avec des anticorps de intEREST (spécifique pour le candidat de partenaire pour le système immunitaire protéine précipitée). En utilisant 1% (5 ug) d'extraits d'entrée comme un contrôle des niveaux de protéines endogènes (figure 3B).

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Résultats

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Pour comprendre la régulation de l'activité de MyoD, nous avons entrepris la caractérisation exhaustive des complexes MyoD utilisant la purification biochimique, sur la base du immunopurification d'une double forme étiqueté de MyoD suivie par spectrométrie de masse (MS). L'utilisation de la lignée cellulaire HeLa-S3 exprimant MyoD Flag-HA-marqués et une lignée de cellules de contrôle exprimant permis Flag-HA pour obtenir suffisamment de matériel pour purifier le complexe de MyoD en effec...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode présentée permet une identification exhaustive des partenaires d'un facteur de transcription, MyoD. Elle a révélé des partenaires de MyoD dans un système hétérologue résistant à la différenciation induite MyoD, à savoir les cellules HeLa-S3. Ainsi, par définition, les partenaires de MyoD identifiés sont exprimés de façon ubiquitaire. Ceux - ci comprennent des facteurs généraux et spécifiques d' une séquence de transcription, des enzymes de modification de la chromatine, des protéines de traitement de ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les travaux du laboratoire Ait-Si-Ali ont été soutenus par l’Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon) ; Institut National du Cancer (INCa) ; Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC) ; Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC) ; CNRS ; L’Université Paris Diderot et le concours « Qui suis-je ? » Laboratoire d’Excellence #ANR-11- LABX-0071 financé par le Gouvernement français à travers son programme d’Investissements d’Avenir opéré par l’ANR sous la subvention #ANR-11-IDEX-0005-01. EB a été soutenu par une bourse de l’INCa.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
fortes
HeLa-S3ATCC CCL-2.2
C2C12ATCCCRL-1772
Equipment
SpinnerCorning778531
Homogénéisateur :  ; Dénoncer l’homogénéisateur  ;Wheaton432-1273 et 432-1271
Dispositif d’agitation pour spinnersBellco778531
SonicatorDiagenodeUCD 200
HémocytomètreMarienfeld Superior  ;640610
Tubes à faible liaisonSorenson27210
Colonne de centrifugation videBio-Rad7326204
réactifs
SDS-polyacrylamide 4-12 %  ; gelLife technologiesNP0336BOX
4x tampon de chargement  ;Life technologiesNP0007
10x agent réducteurLife technologiesNP0004
Kit de coloration à l’argentLife technologiesA8592
Unités de filtration centrifuges, 10KMilliporeUFC501024
Protéine G billes d’agaroseSigma-AldrichP4691
Protéine A/G  ; RésineThermo Scientific53132
Résine Flag (gel d’affinité à l’agarose M2 anti-Flag)Résine Sigma-AldrichA2220
HA (agarose anti-HA monoclonale)Sigma-AldrichA2095
MNaseSigma-AldrichN3755
Peptide sans drapeau (DYKDDDDK)Ansynth Service BVSynthèse personnaliséeRemise en suspension jusqu’à 4 mg/ml dans 50 mM Tris-HCl, pH 7,8
Peptide libre HA (YPYDVPDYA)Ansynth Service BVSynthèse personnaliséeRemise en suspension jusqu’à 4 mg/ml dans 50 mM Tris-HCl, pH 7,8
Kit de dosage des protéines à base d’acide bicinchoninique : Kit BCAThermo Scientific23225
Inhibiteurs de protéaseSigma-AldrichS8830
Chimiluminescence améliorée (ECL) à base de luminol Substrat HRPvie34075
BSASigma-AldrichA9647
ADN de spermatozoïde de saumon cisaillé (sel de sodium de l’acide désoxyribonucléique des testicules de saumon)Sigma-AldrichD1626
Tétrachlorhydrate de spermineSigma-AldrichS1141
SpermidineSigma-AldrichS0266
GlycérolSigma-AldrichG5516
PBSSigma-AldrichD8537
MOPS tampon de fonctionnementLife technologiesNP0001
DMEM (glycémie élevée)Sigma-AldrichD0822Préchauffage  ; à 37 ° ; C avant utilisation
Trypsine-EDTA (0,05 % rouge de phénoltechnologies25300-054
SérumGE soins de santé sciences de la vie  ;PAA A15-102Chaque lot de sérum doit d’abord être testé pour vos cellules.
Pénicilline et streptomycine  ;Life technologies15140-122
Trypan Blue Solution, 0,4 %Life technologies15250-061
Eau (stérile-filtrée)Sigma-AldrichW3500
Antibodies
HA de rat (12CA5)Roche11583816001
Sigma-AldrichA8592
MyoDSanta Cruzsc-32758À utiliser pour le western blot
MyoDSanta CruzSC-760À utiliser pour l’immunoprécipitation et le western blot
CBFbetaSanta CruzFL-182  ;
HP1alphaEuromedex2HP2G9
HP1betaEuromedex1MOD1A9AS
HP1gammaEuromedex2MOD1GC
Suv39h1Technologie de signalisation cellulaire8729
BAF47BD Biosciences612111
Myf5Santa CruzSC-302
TubulineSigma-AldrichT9026
ActinSigma-AldrichA5441
IgG SourisSanta CruzSC-2025
IgG LapinSanta CruzSC-2027
Chèvre anti-rat -HRPSigma-AldrichA9037
Chèvre anti-lapin -HRPSigma-AldrichA6154  ;
Anti-souris chèvre -HRPSigma-AldrichA4416
Technologies de Life Flag

Références

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