A l'étape par le protocole de l'étape pour la chirurgie sous-rétinienne chez les lapins

Résumé

Épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des stratégies de remplacement et de la thérapie à base de gènes sont considérés pour plusieurs maladies dégénératives de la rétine. Pour la traduction clinique, de grands modèles animaux de l'œil sont nécessaires pour étudier les techniques chirurgicales applicables chez les patients. Nous présentons ici un modèle de lapin pour la chirurgie sous-rétinienne orientée vers RPE transplantation, qui est polyvalent et rentable.

Résumé

Âge dégénérescence maculaire liée (AMD), la rétinite pigmentaire, et d'autres maladies liées à l'EPR sont les causes les plus courantes pour la perte irréversible de la vision chez les adultes dans les pays industriellement développés. RPE transplantation semble être une thérapie prometteuse, car elle peut remplacer RPE dysfonctionnel, restaurer sa fonction, et ainsi la vision.

Nous décrivons ici un procédé pour la transplantation d'un EPR monocouche de culture sur un échafaudage dans l'espace sous-rétinien (SRS) de lapins. Après xénogreffes de vitrectomie ont été livrés dans le SRS en utilisant un jeu de tir sur mesure composé d'une buse métallique de calibre 20 avec un polytétrafluoroéthylène (PTFE) plongeur revêtu. La technique actuelle a évolué dans plus de 150 chirurgies de lapin sur 6 ans. Post-opératoire suivi peut être obtenue en utilisant non invasive et répétitif dans l' imagerie in vivo tel que le domaine spectral optique de tomographie par cohérence (SD-OCT) suivie d' une histologie de perfusion fixe.

thméthode de e a des étapes bien définies pour faciliter l'apprentissage et le taux de réussite élevé. Les lapins sont considérés comme un grand modèle animal de l'oeil utile dans les études précliniques pour la traduction clinique. Dans ce contexte, les lapins sont une alternative rentable et peut-être pratique pour d'autres grands modèles animaux des yeux.

Introduction

liée à l'âge de la dégénérescence maculaire (DMLA) est la cause la plus fréquente de déficience visuelle chez les adultes âgés de 50 ans ou plus dans les pays industriellement développés, car il provoque la perte de la vision centrale. Environ 15% de ces patients souffrent de la forme «humide» de la maladie, dans laquelle la néovascularisation provient de la choroïde et perturbe la fonction rétinienne ^1. Cette variante peut être traitée par un traitement très efficace avec répétition des injections intra-vitréennes des médicaments anti - angiogéniques ^2. Cependant, la grande majorité des patients (~ 85%) souffrent de la forme sèche, qui se caractérise par des dépôts extracellulaires (par exemple, drusen) sous l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Ces dépôts provoquent un dysfonctionnement RPE conduisant à l'atrophie rétinienne dans la macula. Compte tenu de l'absence de toutes les options thérapeutiques curatives, AMD a évolué dans un domaine de recherche en développement intensive, où beaucoup de différentes approches thérapeutiques curatives sont testées. remplacement de la RPE chirurgicale estune attrayante possibilité future pour vaincre cette maladie débilitante ^3.

Autogreffe RPE subrétinien remplace RPE dysfonctionnelle ou perdu dans macula, et a le potentiel de restaurer sa fonction physiologique ^4-9. Cette technique chirurgicale a eu une percée avec le développement de protocoles de différenciation des cellules EPR souches embryonnaires humaines (hESC) et des cellules souches pluripotentes induites (CISP), ce qui donne le scientifique une source illimitée de cellules pour la transplantation d' un EPR ^10. RPE transplantation est maintenant reconnu comme un first-in-humaine demande attractive pour les cellules souches thérapeutiques dérivés. L'œil offre un excellent accès chirurgical et sophistiqué d'outils de suivi in vivo ^11-13.

Pour transplanter le RPE, une façon est avec une livraison peu invasive en utilisant une suspension de cellules, alternativement, afin de mieux préserver les caractéristiques de l'EPR et de la fonction de greffe, arti fi cielle porte-substrAtes (échafauds) pour le remplacement de l' EPR sont considérés comme ^4,14,15. Modèles grands animaux sont nécessaires pour la validation préclinique, mais des informations techniques détaillées sur la manipulation des animaux et la technique chirurgicale est manquante à ce jour ^16-23.

Nous et d' autres ^11,24 en dépit des preuves du contraire ^25, suggérons l'utilisation d'un substrat de support rigide mais élastique car il fournit une manipulation plus sûre, préserve l' intégrité de la monocouche et la fonctionnalité. Au fil du temps, nous avons testé plusieurs instruments et techniques auxiliaires conçus sur mesure pour l'implantation de cellules porteuses soutenues greffes RPE dans l'espace sous-rétinien (SRS). Nous avons utilisé des enregistrements vidéo peropératoires, in vivo ophtalmoscopie laser à balayage combiné avec domaine spectral tomographie par cohérence optique (SLO / SD-OCT), et l' histologie pour évaluer le succès de l' implantation ^14,26,27. Ici, nous fournissons notre recommandation actuelle pour les implants sous-rétiniens RPE chez les lapins,qui ont été testés dans 5 souches de lapin différentes, 7 matériaux de support de cellules et sources de cellules 4 RPE dans plus de 150 procédures.

Protocole

L'éthique de la manipulation des animaux dans la recherche ophtalmique: Nous avons obtenu l'approbation du comité d'éthique de la Faculté de médecine, Université de Bonn, et adhèrent aux lignes directrices énoncées par l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO). En outre, toutes les procédures ont été approuvées par les autorités réglementaires de l'Etat de Rhénanie du Nord-Westphalie. Les animaux ont eu lieu à l'intérieur dans un établissement spécialisé dans une salle climatisée avec des températures entre 18 - 20 ° C, l'exposition à la lumière du jour régulière, dans des cages individuelles normalisées avec accès libre à la nourriture et de l'eau.

Remarque: Pour assurer les animaux d'affinité opératoire, une feuille de pointage de la santé animale est suivi qui comprend les animaux définitive des critères d'exclusion suivants: 20% de perte de poids par rapport à un poids à l'admission; cyanose apparente de l'animal; frissons d'animaux, a des crampes ou ne peut pas se déplacer dans la coordination; . ataxie / paresthésie, par exemple, paralysies; apathie; mutilation extrême auto (des plaies de la peau, des membres sectionnés).

1. Instrument de stérilisation

1. Placez les instruments réutilisables dans un bain à ultrasons.
2. Ajouter 500 ml d'eau distillée et 2 ml de désinfectant pour instruments.
3. Nettoyer les instruments à l'aide de la fonction de balayage pendant 15 min.
4. Retirer les instruments du bain à ultrasons et rincer abondamment à l'eau distillée pendant 5 min.
5. Insérez instruments en autoclave et utiliser le programme standard (stérilisation des instruments sous 121 ° C pendant 20 min).

2. Instrument de préparation

1. Établir et maintenir un champ stérile, en travaillant dans une pièce fermée, le port chirurgical frotte, masque et couverture de cheveux. Désinfecter les mains avant de porter des gants chirurgicaux stériles. Pour l' approche détaillée , voir ^28.
2. Placez les instruments stérilisés sur un champ stérile.
3. Placer 1 ml d'une seringue préremplie de 40 mg triamcinolone attachée à une aiguille 27 G pour injection, une seringue de 10 ml avec une solution saline équilibrée (BSS) et une seringue de 5 ml of lubrifiant sur le champ opératoire.
4. Placez soie 3-0, 7-0 Vicryl, bâtonnets oculaires (pour arrêter le saignement conjonctival / scléral), éponges twister de gaze, bandes de fermeture de plaies (pour fixer la pointe des tubes de vitrectomie) et lustre endoillumination fil de fibre sur un drap.
5. Déballer 25 G lustre endoilluminator et se connecter à la machine de lumière en utilisant des techniques stériles (voir étape 2.1). Se connecter ensemble de vitrectomie y compris vitréotome haute vitesse et la cassette Venturi à la machine de vitrectomie en utilisant des techniques stériles (voir étape 2.1).
6. Ouvrez 500 ml BSS bouteille et connecter la solution à la cassette Venturi selon les instructions du fabricant.

3. Préparation d'anesthésie et de positionnement de l'animal

1. Peser animal pour assurer un dosage de médicament précis.
2. Préparer intramusculaire (IM) en utilisant l'anesthésie 1 seringue avec 27 aiguille G contenant 0,35 mg / kg de kétamine et 0,25 mg / kg médétomidine pour le démarrage. Retournez la seringue pour mélanger.
3. Préparer 2 seringues avec 1/3 til doses pour maintenir l'anesthésie pendant l'opération.
4. Préparer une seringue contenant 20 ml de solution de glucose à 5% et 18 aiguille G pour injection sous-cutanée sous forme d'infusion intraveineuse de remplacement.
5. Donne 3 x 1 goutte de collyres mydriatiques avant vitrectomie pour la dilatation des pupilles.
6. Couverture de lapin avec une couverture au calme avant l'injection d'anesthésie, injecter dans le membre postérieur (fessière musculaire) et massage autour du site d'injection pendant 30 secondes.
   Note: Le premier coup de IM l'anesthésie dure environ 1 - 2 h. selon la taille de l'lapin, la tolérance au médicament, la couche de graisse, le stress et la température corporelle. Le premier signe de l'anesthésie évanouissement est un nystagmus (doit être surveillée par le chirurgien), les injections suivantes durent environ 30 - 45 min.
7. Confirmer l'anesthésie appropriée, en vérifiant l'hypnose, hyporéflexie, l'analgésie et la relaxation des muscles de l'animal.
8. Donner une injection sous-cutanée (Pt. 3.3) dans le pli de la peau du cou, une fois que le lapin est inconscient.
9. Ajouter methylclubrifiant ellulose tous les 5 - 10 min dans l'oeil opéré, ajouter du lubrifiant et de bande couvercles dans l'œil non opéré.
10. Placez le lapin couvert sur la table chirurgicale drapé d'une couverture comme une couverture de coton dans une position optimale (nez légèrement élevée à travers un moule de la couverture, de sorte qu'il est de niveau avec la surface oculaire) sous microscope chirurgical. Alignez oeil perpendiculaire au microscope objectif.
11. Veiller à la bonne température centrale du corps à l' aide d'un thermomètre rectal (normothermie 39 ± 1 ° C) ^29.
12. cils Cut avec des ciseaux (un peu de pommade sur la lame) pour réduire les infections postopératoires.
13. Désinfectez l'œil en utilisant 2 - 3 gouttes de 0,1 g / ml Povidone-iode par voie topique pendant 1 min et rincer avec BSS stérile.
14. Couvrir les yeux avec champ stérile avec ouverture pré-découpée au milieu de l'œil, puis couvrir avec (collant) incision chirurgicale drap 12 x 17 cm.

4. vitrectomie

1. Proptose et oeil sécurisé avec 3-0 soie en utilisant invétrier erted et, effectuer une péritomie conjonctivale.
   1. Inciser la conjonctive avec une paire de ciseaux Vannas près de limbe, mais assez loin des vaisseaux sanguins (~ 1 mm de distance).
   2. Disséquer la conjonctive en créant un "T-cut". Tout d'abord agrandir le péritomie avec le ciseau parallèle à limbe puis inciser la conjonctive verticalement sous forme d'un "T" pour environ 6-7 mm. Séparez délicatement la conjonctive sans ménagement.
2. Effectuer une sclérotomie en utilisant une lame 23 G microvitreoretinal (MVR) à 8 heures œil droit / OD (4 heures, oeil gauche / OS) en insérant avec précaution l'extrémité pointue de la lame dans la direction vers le nerf optique. Rétracter lentement la lame dans la même direction et à éviter l'élargissement de la sclérotomie.
3. Insérez et côté suture personnalisé port-canule de perfusion ²⁷ en utilisant une suture 7-0 de la soie et la pression intraoculaire set (IOP) à 24 mmHg.
4. Effectuer une sclérotomie avec 25 G tête plate trocart à 2 heures sur OD (10 o '; Horloge sur OS) similaire à l'étape 4.2.
5. Insérez 25 G lustre de la lumière dans la tête plate trocart, fixer avec du ruban adhésif et mettez la source de lumière à environ 30%.
6. Si nécessaire, retirer l'épithélium cornéen oedémateux en utilisant un scalpel # 20 pour une meilleure visualisation intraoculaire.
7. Effectuer une sclérotomie similaire à l'étape 4.2 à 10 heures OD (2 heures, OS), (pré) vitrectomie pointe de coupe lieu u en forme de 7-0 sutures autour de sclérotomie sans attacher le noeud, et insérer.
8. Démarrez vitrectomie ³⁰ autour du port d'entrée, puis continuer sur le disque optique et les medullares de fibrae utilisant vitréotome haute vitesse en coupant l'humeur vitrée en petits morceaux au max. 2.000 - 3.000 coupes / min, d'aspiration au max. 200 mmHg à l' aide de la configuration du paramètre déclaré de la machine de vitrectomie (tableau 1)
9. Effectuer un détachement postérieur du vitré (PVD) en séparant l'humeur vitrée de la rétine en maintenant la vitréotome à grande vitesse sur la partie postérieure pôle and (si doucement possible) supérieure du disque ³¹ tout en aspirant seulement à max. 200 mmHg sans couper.
10. Injecter environ 50 pi (20 mg) triamcinolone ou fluorescéine dilué (environ 0,1 mg / ml) par voie intravitréenne de visualiser et de faciliter (presque totale) le retrait du vitré flottant au- dessus du pôle postérieur et pendant la vitrectomie moyenne périphérie. Évitez de traverser sous la lentille. Indentation de se raser vitreux périphérique par un (homme) assistant est recommandé si tamponnade de gaz est souhaitée.
11. Ajouter 20 unités / ml d'héparine et 0,5 mg d'épinéphrine à une concentration finale de 0,001 mg / ml dans la solution de perfusion BSS en parallèle ou après l'étape 4.10.
    Note: Comme l'héparine / adrénaline ne sont pas injectés intraoculaire leurs effets sont retardés en fonction du débit de perfusion.

5. Chargement Shooter

Remarque: Les travaux décrits ici ne tombe pas sous les principes de la Déclaration d'Helsinki; il ne comportait pas des patients humains. Ici, stacellules ndard RPE ont été isolés à partir des yeux humains fœtaux, cultivées et différenciées sur non couché polyester de 10 um d'épaisseur (PET) insère selon notre protocole précédemment publié ^14. Une autorisation de travailler avec le matériel fœtal humain a été obtenu à partir du comité d'éthique de l'Université de Bonn. Alternativement, hES-RPE ont été expédiés du laboratoire Skottman (manuscrit en préparation.), Où ils ont été cultivés selon la technique décrite par Vaajasaari et al ^32. pour ces cellules une autorisation a été obtenue à partir de l'Institut Koch R., Berlin, Allemagne.

1. Rincer la culture cellulaire avant la préparation du 3x implant avec BSS de qualité ophtalmique.
2. Remplir une boîte de culture cellulaire standard (100 x 20 mm) avec 10 ml ophtalmique BSS de qualité.
3. Ajouter l'insert de culture cellulaire dans le BSS et centrer le plat sous un microscope optique.
4. Découper un implant de 2,4 x 1,1 mm avec un ovale, l'aiguille sur mesure émoussée pour obtenir un substrat plat, en forme de haricotavec deux bords longs et deux bords arrondis.
5. Inonder délicatement l'aiguille à travers le second port avec BSS pour débusquer l'implant dans la coutume fait la station de chargement de BSS rempli (figure 1).
6. couper éventuellement une extrémité ronde de l'implant (<0,5 mm), juste pour obtenir un troisième bord.
7. Assurez-vous que l'implant est dans la bonne orientation en veillant à ce que la monocouche est à l'envers sur le support de cellules. Pour modifier le positionnement à utiliser avec précaution deux scalpels.
8. Poussez doucement l'implant et complètement dans l'instrument de tir à l'aide du porte-aiguille jusqu'à ce que tout de l'implant est fixé à l'intérieur de la pointe. Le plongeur doit rester en retrait.
9. Gardez la pointe de tir "chargé" dans la station de chargement sous BSS jusqu'à ce que le moment de l'implantation.

6. Implantation

1. Approche rétine neurale avec prorogeable 41 G aiguille d'injection sous-rétinien reliée à une seringue étanche aux gaz (veiller à ce que toutes les bulles d'air ont été évacuésà partir de tubes!).
2. Injecter BSS (avec le calcium et le magnésium / CM) sous-rétinienne et de créer ainsi un décollement de la rétine de bleb (BRD) d'environ 2 - 3 disques de diamètre (DD). Deux BRD par oeil peut être soulevée en toute sécurité.
3. Agrandir rétinotomie à 1,5 mm avec verticaux 23 G VR-ciseaux. L'espace sous-rétinien est maintenant accessible pour l'implantation ou encore les manœuvres.
4. Etendre sclérotomie (précisément) avec un couteau d'incision de 1,4 mm à 20 G approche.
5. Tentative passant par le sclérotomie en utilisant un 20 G shooter mannequin, agrandir au besoin pour assurer une transition en douceur, mais confortable du tireur chargé.
6. Passez avec le tireur chargé ²⁷ à sclérotomie idéalement à 24 mmHg.
7. Approche rétinotomie bord et éjecter l'implant sous-rétinienne d'une position epiretinal.
8. Ajuster l'implant avec demi-fermé 23 G ciseaux, une pince ou 41 aiguille G pour vous assurer qu'il est bien placé sous le retina- raisonnablement loin de la rétinotomie.

7.Mettre fin à l'opération

1. Retirer 25 G lustre et la canule de perfusion.
2. Suture tous sclérotomies.
3. Injecter 25 ul (10 mg) par le triamcinolone sclérotomie 8 heures (avant le dernier suturer sclérotomie).
4. Contrôler / régler la PIO par palpation et injecter BSS via 30 G aiguille / seringue, si nécessaire.
5. Suture conjonctive avec 7-0 Vicryl.
6. Retirer proptosing 3-0 fronde de soie lentement (Évitez plexus veineux orbital profonde!).
7. Ajouter la dexaméthasone / pommade antibiotique sous le couvercle.
8. Position pendant 1 h couvert de couverture avec œil opéré vers le haut (w / o gaz), ou vers le bas (avec de l'air / gaz).
9. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'elle reprenne conscience suffisante pour maintenir décubitus sternale.
10. Ne pas transporter de lapin avant l'anesthésie disparaît complètement, ce qui peut être accélérée par l'injection medetomidine l'agent d'inversion égale à la quantité de médétomidine donné.

8. Post-operative Animal Care

1. Garderlapins dans des conditions appropriées (température, lumière, nourriture, eau, espace, etc.) et une surveillance étroite dans un établissement spécialisé.
2. Veiller à ce que l' animal est bien reposé, ie., Pas de longues périodes de nourriture ou de privation d'eau.
3. Recherchez les blessures ou les blessures, en particulier sur les sites d'injection.
4. Gardez les plaies sèches pour prévenir les infections. Donner des antibiotiques en cas d'infection est suspectée: dexaméthasone 1 mg / g, sulfate de néomycine 3500 UI / g, sulfate de polymyxine B 6000 UI / g de pommade a été appliquée deux fois par jour pendant 1 semaine post-opératoire sur la surface oculaire.
5. Ajouter la dexaméthasone / pommade antibiotique pour 7 jours postopératoires deux fois par jour pour une meilleure régénération de la surface oculaire et réduit la douleur post-opératoire.
6. Donner des analgésiques systémiques (Carprofene 4 mg / kg deux fois par jour) pendant 48 heures initiale.
7. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale.
8. Ne retournez pas un animal quia subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
9. Ne pas exposer les animaux à la détresse inutile.

9. SLO / SD-OCT orientation

1. Préparer et injecter par voie intramusculaire (IM) en utilisant l'anesthésie 1 seringue avec 27 aiguille G contenant 0,175 mg / kg de kétamine et de 0,125 mg / kg médétomidine pour le démarrage. Retournez la seringue pour mélanger.
2. Ajouter un lubrifiant au moins tous les 5 min pour hydrater les yeux et maintenir SD-OCT imagerie claire, éventuellement une lentille de contact personnalisé peut être utilisé.
3. Fixer une plate-forme en acier à l'appui-tête pour stabiliser l'animal dans la position requise.
4. Placez le lapin sur la plate-forme en acier, en plaçant son oeil perpendiculaire à la sonde.
5. Tenir la tête du lapin de l'os inférieur de la joue (de mandibule) évitant la trachée.
6. la tête de l'animal Tilt d'environ 45º vers le SD-OCT sonde pour optimiser l'angle de vision sur l'implant.
7. Utilisez un objectif de 30 degrés et les paramètres suivants pour optimal imagerie OCT [HS]: 30 degrés paramètres pour une seule ligne numérise avec le mode ART réglé à 100 (moyenne) et 20 x 20 paramètres de degré pour les analyses de volume avec mode ART réglé sur 15; mode haute résolution est pas nécessaire.
8. Utilisez SLO réflectance infrarouge imagerie pour trouver le plan focal de l'implant (Fig 2A.); mise au point optimale est atteinte lorsque (tous) les bords d' implants sont tranchants ^14.
9. Ajouter dexaméthasone 1 mg / g, sulfate de néomycine 3500 UI / g, sulfate de polymyxine B 6000 UI / g de pommade sous le couvercle lorsque vous avez terminé.

Résultats

Les résultats de la méthode décrite pour l' implantation sous - rétinien sont présentés dans le tableau 2. La prise de greffe sous la rétine avait un taux d'environ 61% de succès quand une vitrectomie de base a été réalisée et a augmenté jusqu'à 76%, lorsque le détachement postérieur du vitré a été induite. Ces chiffres comprennent environ 21% des animaux qui sont morts soit en peropératoire ou dans les 3 premiers jours postopératoires. Cette technique peut être utilisée pour implanter deux échafauds sur différentes zones de la rétine d'un oeil simultanément.

Les lapins ont subi postopératoires in vivo suivi utilisant SD-OCT et le traitement histologique tel que décrit par Stanzel et al. ²⁷ (Figure 2). Fig. Le balayage de l' image ophtalmoscope laser à réflexion infrarouge de l' EPR culture implantée sur une membrane de polyester (PET) La figure 2A montre la suite d' une transplantation sans complication. lehalo autour de l' implant correspond à photorécepteur atrophie. Fig. 2B montre un amincissement correspondant SD-OCT, l' avis de la rétine, la couche nucléaire essentiellement externe (ONL), bande réfléchissante hyper sur SD-OCT ci - dessus implant, tandis que la rétine neurale adjacente à l'implant montre des bandes près de la normale réflexion. Ces résultats suggèrent une livraison atraumatique. Fig. 2C montre Hematoxiline / éosine (H / E) tache de l'implant qui montre des cicatrices sous - rétinien et une atrophie ONL autour du site , probablement en raison de la manipulation iatrogène rétinotomie, une couche pigmentée encore irrégulière contigus sur PET. la membrane de Bruch en dessous de l'implant est également apparu comme un seul tenant, et la choriocapillaire contient des globules rouges dispersés. Ce résultat morphologique sont comparables à la SD-OCT et de renforcer la thèse d'une livraison atraumatique.

figue ure 1: Chargement Shooter avec Human iPSC-RPE Cultured sur PET cellulaire Carrier. A) montre le poinçonnage d' un implant à l' aide sur mesure aiguille. B) de l' implant en forme de haricot coupé de la culture cellulaire. C) Positionnement de l' implant avant le chargement. D) Chargement de tir avec l' implant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

Figure 2: Cultured Human hES-RPE sur PET cellulaire transporteur 4 semaines en lapin sous - rétinienne Espace. A) Affiche SLO image réflectance infrarouge, la ligne verte délimite la section transversale représentée sur la figure. 2B. B) correspondant SD-OCT. C) H / E tache, voir le texte ou ^26,27 pour plus de détails.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Paramètre	paramètres d' occasion
vitrectomie	6.000 coupes / min
Vide	200 mmHg
Temps de montée	1 seconde
Air	24 mmHg
Irrigation	24 cmH 2 O
Diathermy	30%

Tableau 1: Configuration des paramètres de la vitrectomie Machine.

vitrectomie	Implant	Lapins exploités	implant réussie	implant Échec	Décès	Taux de réussite%
vitrectomie de base	ANIMAL DE COMPAGNIE	30	19	4	7	63.33
	PET + RPE	70	42	12	16	60
PVD, ± plasmine w / PPV	ANIMAL DE COMPAGNIE	28	21	2	5	75
	PET + RPE	22	17	2	3	77.27

Tableau 2: Résumé des 150 dernières opérations , y compris la méthode et Implant Type.

Discussion

En utilisant un modèle de lapin, une méthode sûre et reproductible est présenté pour la livraison transvitreal des RPE cultivées sur des supports de cellules dans l'espace sous-rétinien avec un instrument de tir conçu sur mesure. La méthode décrite offre une technique chirurgicale courte / optimisé pour l'apprentissage facile, car il implique des techniques standard en vitrectomie avec des manoeuvres sous-rétiniens. Résultat est grandement facilitée par une interface vitréo-rétinienne propre, et la perfusion intra-oculaire qui évite la turbulence fluide sur le site d'implantation, induisant bleb décollement de la rétine (BRD) à basse pression intraoculaire, ce qui empêche la rétine et des lésions sclérotique par la sécheresse, et un positionnement approprié du lapin.

Nous avertissons cependant, comme plusieurs complications intra-opératoires peuvent survenir à tout moment, ce qui entrave le succès de l'implantation, par exemple intra saignées oculaires, l'anesthésie fading off au cours des étapes vitales telles que l'implantation, l'effondrement de la BRD due à la manipulation de l'instrument ou hypotonie oculaire, rabbit décès dus à des doses excessives de l'anesthésie, une pression artérielle basse pendant longue opération causant des lésions cérébrales hypoxiques, ou hyperthermie. Pourtant, ces complications diminuent avec le temps car ils sont rapidement abordés et résolus en augmentant l'expérience de l'équipe chirurgicale.

Certaines complications peuvent être réduites en suivant quelques simples mais cruciales étapes. Lubrifiant devrait être ajouté tous les 5 - 10 min pour empêcher la cornée, des lésions scléral et conjonctivale pendant l'opération, et de maintenir un milieu intraoculaires claires, comme séchées sclérotique / noircie peut être une cause de déhiscence de la plaie, ce qui à son tour conduit à une hypotonie oculaire et / ou une fuite de sclérotomies peropératoire. L' héparine doit être ajouté pour empêcher la formation d'un film de fibrine qui rend difficile l' implantation sous - rétinien en particulier et en ajoutant simultanément l' épinéphrine pour réduire les saignements sous héparine ^16. fois trop long héparine / exposition d'épinéphrine (> 1 heure) doivent être évitées pour empêcher ede cornéennema par décompensation endothéliale ^33, une crise hypertensive ou de décès peropératoire. retrait du vitré Méticuleux doit être effectué à l'instrument (entrée) Port pour éviter la rétine et / ou des détachements de la choroïde. instruments intraoculaires doivent être indiqués vers le pôle postérieur pour éviter lentille contact (provoque la formation de la cataracte iatrogène) ou (site d'entrée) de dommages à la rétine. Un intraoculaire orifice latéral canule de perfusion doit être utilisé, car il atténue le courant-jet autour de la zone d'implantation, empêchant ainsi la déchirure incontrôlée du rétinotomie, et l'effondrement de la BRD. BRD induction dans la ligne médiane (axe vertical du nerf optique) ou à proximité de fibres optiques médullaires doivent être évitées pour empêcher de vastes décollements de la rétine iatrogènes. Enfin, last but not least BRD devrait être induite à basse pression intraoculaire, pour éviter une injection BSS sous - rétinien en utilisant des taux excessifs d'écoulement qui peut conduire à une lésion de la rétine (par exemple., En étirant).

De nombreuses variables de l'étude tels que carrie cellulairevariantes de r, foetal, souches adultes ou sources de cellules RPE dérivées de cellules, choix pour les immunosuppresseurs, etc., peuvent être explorées ^14,26,27,34. Poursuite de l' amélioration telles que les méthodes de culture de RPE sans sérum, caractérisation des xenoRPE dans l' espace sous - rétinien, l' enlèvement de la couche RPE hôte ¹⁴ ou stratégies pour l' ancrage de l' implant sont les travaux en cours.

À ce jour, les techniques décrites ont été utilisées sur 5 souches de lapin différentes, y compris chinchilla bâtard, Chinchilla bastard / hybrides, KBL Nouvelle-Zélande Blanc / Croix-Rouge, la Nouvelle-Zélande White (albinos) et néerlandais ceinturée. Les deux lapins mâles et femelles ont été opérés, avec des lapins au moins 1,5 kg ou 2 mois (selon les espèces). La plupart des chirurgies étaient sur des lapins pigmentés (bâtards chinchilla ou hybrides bâtardes chinchilla) avec des poids compris entre 2,5 à 3 kg.

Toutes les souches de lapin nous avons eu l'occasion de travailler avec semblent avoir quelques particularités. Etant donné les accessive disponibilité des lapins pigmentés de la souche chinchilla bâtarde en Allemagne en 2009-13, nous avons recueilli le plus d'expérience avec ces animaux. Malheureusement, il est plus disponible, puisque l'élevage a été abandonné, mais se compare très bien à la Nouvelle-Zélande Blanc / Croix-Rouge, sauf pour la sclérotique plus avantageux plus épais et de plus grands volumes d'oeil dans ce dernier. hybrides bâtards Chinchilla ont la formation de fibrine peropératoire significatif et nécessitent l'utilisation d'héparine / épinéphrine tel que décrit ci-dessus pour assurer les manoeuvres réussies sous-rétiniens. Ce protocole a également été réalisée en non-pigmentées lapins albinos (blancs de Nouvelle Zélande), la création cependant particulièrement BRD et l'implantation sous-rétinien est plus difficile étant donné l'appréciation réduite de contraste. La faisabilité d'induire un détachement postérieur du vitré ne semblait pas la souche de lapin dépendante dans nos mains.

livraison sous-rétinien Transvitreal est probablement la stratégie chirurgicale future de choix étant donné qu'il est le plus comm sur la route de nos jours en clinique pour accéder à la rétine. En conséquence , beaucoup d' autres groupes ont présenté de telles techniques pour RPE cultivées sur support soutient dans le travail des animaux ^11,15,23,35. Aramant et al. ³⁶ ont un instrument, qui place plutôt que pousse leur implant hydrogel mou-encapsulé à son site cible sous - rétinien. La conception de Thumann et al. Utilise une spatule creuse, ce qui libère le greffon sur support par celui - ci flottant au large par injection de fluide ^19. Les deux anciennes stratégies nécessitent l'insertion sous-rétinien de l'instrument, ce qui à notre avis est plus sujette à des complications, par rapport à un instrument epiretinally appositioned. Montezuma et al. ²² décrit un instrument d'insertion sous - rétinien pour la livraison des implants de puces sous - rétiniens chez les porcs , mais pas d' autres travaux ont été publiés depuis le meilleur de nos connaissances. Nous avons été en mesure d'étendre la technique décrite avec une certaine modification de porc.

jove_content "> Nos supports de cellules préférées sont de 10 microns de téréphtalate de polyester épais (PET) membranes. Du point de vue chirurgical, ce matériau présente les paramètres de rigidité et d'élasticité favorables, en plus de sa grande polyvalence au cours des expériences de culture cellulaire. Nous avons trouvé que des expériences similaires avec le tétrafluoréthylène expansé Lorsque lactique-co-acide glycolique (PLGA), ainsi que des nanofibres composites (PLGA ou PET) et ultramince PET ²⁶ - (ePTFE) ³⁷ ou nanofibres électrofilées de membranes à partir de PET, les poly-lactique / acide capronolactic (PLCL) ou poly. membranes PET sont utilisés avec notre instrument de tir métallique, ils ont une tendance occasionnelle à présenter une charge électrostatique, qui remet en cause leur éjection du tireur ^27. ultraminces membranes de polyimide pourraient dans nos mains ne sont pas implantés dans l'espace sous - rétinien avec le protocole décrit ci - dessus ( manuscrit en préparation).

Marmor et al. ont étudié systématiquement reso spontanéerption du liquide sous - rétinien dans iatrogènes décollements de rétine localisées ^38-41. Même après la manipulation dans l'espace sous-rétinien ils ont été trouvés pour être réabsorbés par jour postopératoire 4 dans les chirurgies sans incident. Rétinopexie laser n'a pas été réalisée pour fixer les bords de la rétinotomie. Bien que contraire à l'intuition par rapport à la chirurgie humaine, tamponnade air / gaz est pas nécessaire. À moins que l'élimination minutieuse du corps vitré périphérique peut être obtenue, en particulier dans le quadrant supérieur, ceci peut en effet entraîner des déchirures rétiniennes géantes provenant du site rétinotomie. Il est recommandé que pour effectuer l'échange d'air fluide avec la suite 20% SF6 tamponnade de gaz pour sauver les décollements de rétine iatrogènes peropératoires ou dans le cas d'une position de l'implant particulier doit être fixé.

Bien que l'ablation induite mécaniquement de la rétine neurale peut causer des RPE et photorécepteur dégâts chez les lapins ^42,43, son étendue varie considérablement (même avec régulière BSS) dedans l' attente de facteurs tels que le type PIO, une seringue utilisée, le volume d'injection avec la rétine ainsi induite par l' étirage, etc. Nous avons également testé le souvent recommandé Ca / Mg sans BSS facilité le détachement ^42-44, mais a constaté qu'il provoque une opacification de la lentille peropératoire ( en particulier avec la température élevée), et de manière significative les retards ou même porte atteinte rétinienne re-attachement ^27. injection sous-rétinienne lente de 20 - volume 30 pi de BSS régulière avec une seringue de 100 pi est donc recommandé; mouvements de l'aiguille d'injection devraient être minimes pour que les joints d'étanchéité rétinotomie autour d'elle et de prévenir les dommages de la membrane de Bruch. Certains des dégâts iatrogène peut être résolu par RPE cicatrisation de la plaie, et la préservation relative observée de l' épaisseur ONL après recollement, suggère que le complexe / photorécepteur RPE peut tolérer cette perte de valeur, comme décrit également par d' autres ^45.

thérapeutiques à base de cellules ou de prothèses rétiniennes nécessitent ANIMA précliniquel test avant l'approbation réglementaire et de commencer des études de sécurité humaines. L'ancien varient d'un pays à l'autre. Le modèle de lapin décrit ici peut servir de plate-forme rentable et moins difficile pour établir ou même la réalisation de toutes les exigences des autorités réglementaires. En outre, il peut ensuite servir à la formation des chirurgiens dans les essais cliniques multicentriques éventuels ou d'autres améliorations de la technique le long du chemin.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
s30 unité de nettoyage par ultrasons	Elmasonic	100 4631	2,75 L
DE-23  ; autoclave	Systec	C 2209	23 L
Seringue  ;	BD  ;	300013 300995  ; 301285 300294 300330  ;	1 ml x3 2 ml x3 5 ml x1 10 ml x1 20 ml x1
Aiguille  ;	BD	305196 305136	18 G x1  ; 27 G x5
Scalpel	Feather	2975#20	lame#20 x3
Champ chirurgical	HARTMANN LOHMANN & RAUSCHER	277 502 25 440	60 x 40 cm x2 12 x 17 cm
Bâtonnets oculaires	LOHMANN & RAUSCHER	16 516	66 x 5 mm
Éponges de gaze Twister	HARTMANN	481 274	x2
Bandes de fermeture	HARTMANN	540 686	x4
Microscope Opmi Visu CS Zeiss	N/a	avec système d’imagerie du fond d’œil BIOM II
Lustre endoéclairage	Geuder	G-S03503 + G-S03504	25 G avec trocart
Machine à lumière	Geuder	G-26033	Xénotron III
Vitrectomie	Geuder	G-60000	MegaTRON S4 S4/ HPS
Vitrector	Geuder	G-46301	MACH2 coupeuse vitreuse 23 G
Cassette Venturi  ;	Geuder	G-60700
Canule à perfusion Sideport	Geuder	custom  ;	23 G x1
Suture en soie 3-0	ETHICON	V546G	x1
Étrier	Geuder	G-19135	x2
Ciseaux Vannas	Geuder	G-19777	x1
Lame de sclérotomie	Ziemer	21-2301	1x 23 G 1x 20 G
Suture en soie 7-0	ETHICON	EH6162H	x1
Porte-aiguille	Geuder	G-32320	x2
Pince à iris	Geuder	G-18910	x1
Pince Colibri	Geuder	G-18950	x1
Aiguille d’injection sous-rétinienne extensible	DORC	1270.EXT	41 G
Ciseaux VR	Geuder	G-36542	25 G
Porte-pince Grieshaber	Alcon	712.00.41	23 G
Pointes de pince à ciseaux incurvées	Alcon	723.52	23 G
Station de chargement	d’implant Dow Corning	3097358-1004	SYLGARD 184 Kit d’élastomère de silicone
Tréphine d’implant ovale élastophone  ;	Geuder	sur mesure  ;	2,4 x 1,1 millimètre  ;
Mannequin de tir	Geuder	G-32227	x1
Shooter	Geuder	G-S03443	x1
Aiguille de flûte	DORC	1281.SD	20 G (Vide)
Seringue microlitre manuelle	Hamilton	24535	100 µ ; l
Plaques de culture tissulaire	Greiner bio-one	; 664160	100 x 20 mm
Spectralis Multi-Modality	Heidelberg Engineering	N/a	Spectralis HRA   ;+ OCT
Médicaments et solutions
Nom	Entreprise	Agent actif	Commentaires
Mucadont-IS	Merz Hygiene	virucide instrument désinfectant  ;	2 L
Mucocit  ; T	Merz Hygiene	Désinfectant pour instruments sans aldéhyde	2 L
Kétamine 10 %	WDT	Kétamine  ;	10 ml (100 mg/ml)
Domitor	Orion Pharma	Chlorhydrate de médétomidine	10 ml (1 mg/ml)
Antisedan	Orion Pharma	Chlorhydrate d’atipamézole	10 ml (5 mg/ml)
Néosynéphrine POS 10 %	URSAPHARM	Phényléphrine HCl	10 ml
Mydriacyl	Alcon	Tropicamid	10 ml (5 mg/ml)
Méthocel 2 %	Omni Vision	hydroxypropylméthylcellulose	10 g
solution saline équilibrée PURI	CLEAR	ZEISS	500 ml
Glucose 5 %  ;   ;	B.Braun	Glucose 5 % solution  ;	100 ml
Héparine-Natrium-25,000	Ratiopharm	Héparine	5 ml (2,500 unité/ml)
Suprarénine	SANOFI	Épinéphrine	1 ml (1 mg/ml)
Triamcinolone	Université de Bonn pharmacie	sans conservateur Triamcinolone  ;	1 ml (40 mg/ml)  ;
Isoptomax pommade oculaire	Alcon	dexaméthasone 1 mg/g sulfate de néomycine 3 500 UI/g sulfate de polymyxine B 6 000 UI/g	10 ml
Betaisodona	Mundipharma	Povidon-Iod	30 ml (1 g/10 ml)
Optive	ALLERGAN	sodium carboxyméthylcellulose glycérol	10 ml