Murine Hind Limb os long Dissection et moelle osseuse Isolation

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la dissection des os longs des membres postérieurs (fémurs et tibias) de la souris de laboratoire. Nous décrivons en outre une technique rapide d’isolement de la moelle osseuse de ces os qui utilise la centrifugation pour retirer la moelle osseuse de l’espace de la moelle osseuse.

Résumé

L’étude de l’os et de la moelle osseuse est essentielle dans de nombreux domaines de recherche, notamment la biologie osseuse fondamentale, l’immunologie, l’hématologie, les métastases cancéreuses, la biomécanique et la biologie des cellules souches. Malgré l’importance de l’os dans les états sains et pathologiques, il s’agit d’un organe largement sous-étudié en raison du manque de connaissances spécialisées sur la dissection osseuse et l’isolement de la moelle osseuse. Les souris sont un organisme modèle commun pour étudier les effets sur les os et la moelle osseuse, ce qui nécessite une méthode standardisée et efficace pour la dissection des os longs et l’isolement de la moelle osseuse pour le traitement de grandes cohortes expérimentales. Nous décrivons une procédure de dissection simple pour l’ablation du fémur et du tibia qui convient aux applications en aval, y compris, mais sans s’y limiter, l’analyse histomorphologique et les tests de résistance. De plus, nous décrivons une procédure rapide pour l’isolement de la moelle osseuse des os longs par centrifugation avec un temps de manipulation limité, idéale pour le tri cellulaire, la culture cellulaire primaire ou l’extraction d’ADN, d’ARN et de protéines. Le protocole est rationalisé pour un traitement rapide des échantillons afin de limiter les erreurs expérimentales, et est normalisé pour minimiser la variabilité d’un utilisateur à l’autre.

Introduction

L’étude des os longs et des cellules de la moelle osseuse est au cœur d’une myriade de disciplines de recherche, y compris, mais sans s’y limiter, la biologie osseuse, la biologie du cancer, l’immunologie, l’hématologie et la biomécanique. L’os est un organe très dynamique qui, avec le cartilage, forme le squelette pour fournir un soutien mécanique contre la charge et la protection des organes internes. De plus, les composants minéraux de l’os constituent un puits de stockage pour les molécules de signalisation critiques que sont le calcium et le phosphore, ainsi que d’autres facteurs¹. Enfin, les os abritent la moelle osseuse et, avec les ostéoblastes formant l’os métaboliquement actifs et les ostéoclastes résorbants osseux, fournissent la niche de cellules souches nécessaire au maintien des populations de cellules hématopoïétiques et lymphoïdes.

L’os et la moelle osseuse sont affectés dans de nombreux troubles, conduisant souvent à un dysfonctionnement de la moelle osseuse, à de graves douleurs osseuses et à des fractures pathologiques. L’os est un site commun de métastases dans de nombreuses tumeurs solides, notamment le cancer du sein et le cancer de la prostate, où les cellules tumorales engagent directement la niche de la moelle osseuse pour initier le cercle vicieux des métastases osseuses et déplacer les cellules souches hématopoïétiques^2,3. Les tumeurs malignes hématopoïétiques, y compris le myélome et la leucémie, sont caractérisées par un dysfonctionnement de la moelle osseuse ainsi que par une dérégulation du remodelage osseux sain¹. D’autres troubles squelettiques non malins sont également des domaines de recherche actifs, tels que l’arthrose, l’ostéoporose, la scoliose et le rachitisme. Même chez un individu par ailleurs en bonne santé, une défaillance biomécanique d’un os entraîne une fracture douloureuse. Tous ces troubles représentent des domaines de recherche actifs dans le but d’identifier de nouvelles mesures préventives et de nouveaux schémas thérapeutiques pour réduire la morbidité et la mortalité.

Pour étudier la pléthore de rôles de l’os et de la moelle osseuse, à la fois dans des conditions physiologiques et pathologiques, il est essentiel pour les chercheurs de disposer d’une méthode standardisée simple et efficace de dissection des os longs de souris pour le traitement rapide de grandes expériences in vivo. Le protocole de dissection décrit ici convient à toutes les analyses d’os longs, y compris l’imagerie ex vivo, l’histologie, l’histomorphométrie et les tests de force, entre autres. De même, une méthode standardisée d’isolement de la moelle osseuse avec une récupération élevée des cellules de la moelle osseuse et une faible variabilité entre les utilisateurs est importante pour l’analyse expérimentale telle que le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou la PCR quantitative (qPCR) ainsi que pour les applications en aval telles que la culture cellulaire primaire de cellules de moelle osseuse.

Protocole

Tous les travaux des animaux a été approuvé par l'Institutional Animal Care et utilisation Comité conformément aux recommandations énoncées dans le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health.

Dissection 1. Hind Limb os long

1. Euthanasier la souris conformément aux directives institutionnelles.
2. Placez la souris dans une position couchée et apposer en épinglant les quatre pattes à travers les coussinets des pattes de souris ci-dessous l'articulation de la cheville.
3. Pulvériser la souris avec 70% d'éthanol, arrosant abondamment les jambes.
4. Faire une petite incision à la droite de la ligne médiane dans le bas ventre, juste au-dessus de la hanche.
5. Prolongez l'incision dans la jambe et au-delà de l'articulation de la cheville.
6. Tirez la peau et couper le muscle quadriceps ancré à l'extrémité proximale du fémur pour exposer la face antérieure du fémur et la broche à partir de la jambe, en plaçant la tige à un angle de 45 degrés par rapport à la carte.
7. Avec le blade des ciseaux contre la face postérieure du fémur, couper les tendons du jarret loin de l'articulation du genou.
8. Tirez la peau et les muscles ischio-jambiers ancrés à l'extrémité proximale du fémur pour exposer la face postérieure du fémur et la broche à partir de la jambe, en plaçant la tige à un angle de 45 degrés par rapport à la carte.
9. Avec la pince, prise de l'extrémité distale du fémur, juste au-dessus de l'articulation du genou. Guide des lames des ciseaux de chaque côté de la diaphyse fémorale vers l'articulation de la hanche, en faisant attention à ne pas couper dans le fémur lui-même.
10. Après avoir atteint la tête fémorale, indiquée par les ciseaux ouverture légèrement, tournez les ciseaux avec la lame supérieure des ciseaux mobiles directement sur la tête fémorale à disloquer le fémur, en faisant attention de ne pas casser l'os en dessous de la tête fémorale.
11. Saisissez le haut de la diaphyse fémorale avec la pince, couper les tissus mous loin de la tête fémorale pour le libérer de l'acétabulum.
12. Tirez l'ensemble de l'os de la jambe, y comprisfémur, le genou et le tibia, le haut et loin du corps, découpant soigneusement le tissu conjonctif et les muscles de la jambe de liaison à la peau.
13. Éparpille l'articulation de la cheville et de nouveau utiliser les ciseaux dans un mouvement de torsion pour disloquer le tibia.
14. Saisissant l'extrémité distale du tibia, en prenant soin de ne pas couper les tendons, tirez le tibia et loin du corps et la carte de la broche.
15. Couper tout tissu conjonctif restant fixer l'os long à la souris au niveau du genou.
16. Enlever tout muscle ou du tissu conjonctif supplémentaire attaché au fémur et au tibia.
17. Pour toutes les applications qui nécessitent l'os restent intacts (histologie, histomorphométrie, tests biomécaniques, etc.), Procéder à des protocoles internes standards (comme dans ^4-7). Pour isoler la moelle osseuse, passez à la section 2.

2. Préparation à long os pour moelle osseuse Isolation

1. Utilisation de la pince, saisir le fémur avec la rotule opposée unee l'extrémité proximale (tête fémorale) vers le bas.
2. Éparpille l'articulation du genou et d'utiliser les ciseaux dans un mouvement de torsion pour disloquer le tibia et le fémur.
3. Couper tout tissu conjonctif tenant le fémur et le tibia ensemble.
4. Utilisation de la pince, saisir le fémur avec la face antérieure opposée et l'extrémité proximale (extrémité de la tête fémorale) vers le bas.
5. Guide des ciseaux jusqu'à la diaphyse fémorale aux condyles.
6. Tournez doucement les ciseaux et en arrière pour enlever les condyles, la rotule, et l'épiphyse pour exposer la métaphyse.
7. Retirez tout musculaire supplémentaire ou de tissu conjonctif attaché au fémur à l'aide des pinces, des ciseaux, et Kimwipes.
8. À l'aide de la pince, saisir le tibia avec la face antérieure tournée à l'opposé et l'extrémité distale (extrémité de la cheville) vers le bas.
9. Si l'épiphyse tibiale est intact, guider les ciseaux jusqu'à l'arbre du tibia aux condyles.
10. Tournez doucement les ciseaux et en arrière pour enlever les condyles et épiphyse pour exposer la métaphyse.
11. Retirez tout musculaire supplémentaire ou de tissu conjonctif attaché au tibia à l'aide des pinces, des ciseaux, et Kimwipes.

3. Bone Marrow Isolation

1. Pousser une aiguille de 18 G à travers le fond d'un tube à microcentrifugation de 0,5 ml.
2. Placez les os longs (maximum de 2 fémurs et 2 tibias) dans le tube, le genou-end end vers le bas vers le bas et fermer le couvercle.
3. Nest le tube de 0,5 ml de microcentrifugation dans un tube de 1,5 ml.
4. Centrifuger les tubes emboîtés à ≥10,000 xg dans une microcentrifugeuse pendant 15 sec.
5. Vérifier que la moelle osseuse a été filé à des os par inspection visuelle. Les os doivent apparaître blanc et il devrait y avoir un grand culot visuel dans le plus grand tube.
6. Jeter le tube de 0,5 ml de microcentrifugation avec les os.
7. Suspendre la moelle osseuse dans une solution appropriée (par exemple, PBS, milieux de culture, le tampon FACS) et procéder à protocole expérimental (ADN, ARN, ou l' isolement de la protéine,l'analyse par FACS, ou une culture cellulaire primaire).

Résultats

Le protocole décrit ici est optimisé pour la dissection rapide du fémur de la souris et le tibia avec un minimum de dommages au tissu osseux. Cette technique convient à un certain nombre d'analyses en aval, y compris des études de biomécanique, histomorphométrie (Figure 1A - B), et l' histologie (figure 1C) ^4,7. Le histomophometric représentant de la reconstruction micoCT 3D (Figure 1A - B) montre que les deux os spongieux et la coque corticale sont maintenus qui permet une quantification précise des paramètres structurels normalisés pour histomorphométrie osseuse, y compris le numéro trabéculaire, l' épaisseur et l' espacement; volume osseux; et l' épaisseur corticale, entre autres ^8. La section histologiques représentant montre un formaline fixe et décalcifiée tibia H & E tachée (figure 1C). L'image montre l'intégrité de la b calcifiéeune et cellulaire de la moelle osseuse pour l'analyse histologique.

La procédure d'isolement de la moelle osseuse préserve la stérilité de l'espace médullaire, a une faible manipulation pour réduire la contamination, et ne nécessite pas la coupe de l'os long, réduisant ainsi la perte de rendement de la moelle osseuse. Cette moelle osseuse est adapté à de nombreuses applications en aval, y compris de cytométrie de flux ⁵ et PCR analyses. En outre, cette procédure peut être utilisée pour isoler la moelle osseuse pour la culture de cellules primaires de cellules de moelle osseuse, y compris les ostéoclastes et les ostéoblastes (figure 2A - B) ^4,6.

Reconstruction Figure 1. histomorphologique et analyses histologiques de souris os long. Trois dimensions microCT d'un tibia de souris montrant (A) la coque corticale externe et (B trong>) os trabéculaire (barre d'échelle = 0,5 mm). (C) histologiques H & E tache d'un tibia décalcifiée et en coupe (4x). Images courtoisie de Katherine Weilbaecher, School of Medicine, USA Université de Washington. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Primary Bone Marrow culture cellulaire pour la différenciation des ostéoclastes et des ostéoblastes. (A) TRAP coloration pour ostéoclastes multinucléés après 7 jours dans les médias ostéoclastogénique (4x). (B) La phosphatase alcaline (couleur violette) pour ostéoblastes et alizarine rouge (couleur rouge) tache pour la minéralisation après 21 jours dans les médias ostéogénique. Images courtoisie de Katherine Weilbaecher, School of Medicine, USA Université de Washington.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Nous présentons une méthode simple et efficace pour l’ablation des os longs postérieurs de la souris et l’isolement ultérieur de la moelle osseuse. Cette méthode maintient l’intégrité structurelle et cellulaire élevée des os et de la moelle osseuse et a un faible temps de manipulation, minimisant la probabilité de fracture ou de marquage osseux induit par l’utilisateur qui peut influencer les analyses en aval. De plus, la méthode de centrifugation pour isoler la moelle osseuse ne nécessite pas de couper l’os pour exposer l’espace de la moelle osseuse ou de liquide pour rincer la moelle osseuse, réduisant ainsi les points de contamination potentiels. De plus, la technique de centrifugation a un débit relativement élevé avec un temps de manipulation plus faible que les autres méthodes, réduisant ainsi le temps de traitement.

Une forte variation est inhérente aux études in vivo sur la souris en raison de la forte variation phénotypique d’une souris à l’autre. Afin de maximiser l’impact de la recherche des études coûteuses et laborieuses sur les souris, il est essentiel de minimiser les erreurs expérimentales techniques^9,10. Le temps écoulé entre le sacrifice d’un animal et l’analyse en aval ou la fixation des tissus introduit des variations expérimentales qui peuvent surmonter des changements subtils et réduire les grandes différences entre les groupes. Par conséquent, un traitement rapide des échantillons est essentiel pour une analyse précise des données. Les techniques de dissection d’os long et d’isolement de la moelle osseuse décrites ici sont optimisées pour un traitement rapide des animaux et des échantillons afin de réduire les variations techniques.

Ce protocole peut être largement appliqué à de nombreux domaines de recherche, notamment l’étude du tissu osseux lui-même ou l’interrogation des cellules de la moelle osseuse. De plus, cette approche simple de la dissection des os longs permettra aux chercheurs dans des domaines connexes d’interroger directement les contributions osseuses afin d’élargir nos connaissances sur le dysfonctionnement de la moelle osseuse dans des pathologies autrement peu étudiées.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pinboard
Pins
70 % Ethanol Dissection
ciseaux  ;
Pince
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
Aiguille
1,5 ml Microtube à
0,5 ml Tube
microcentrifuger